一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用 (A kind of bone repairing support preparation method and applications of nano-attapulgite stone ) 是由 李辰凯 秦文 赵红斌 倪新晔 周栋 陈文扬 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用,包括以下制备步骤：(1)、骨髓间充质干细胞的培养(2)、凹凸棒石纳米的制备(3)、电纺3D打印制备含纳米凹凸棒石骨修复支架(4)、骨髓间充质干细胞的种植本发明基于电纺3D打印技术,采用多材料、多维度方向发展的3D打印技术则为骨软骨修复,利用3D打印技术,可于时间和空间上精确、按需组合不同生理物理特性的材料(包括细胞、具有生物相容性且可降解的水凝胶、生长因子等),从而解决传统治疗方法存在的不足。(The invention discloses a kind of bone repairing support preparation method and applications of nano-attapulgite stone, including following preparation step: (1), the culture (2) of mesenchymal stem cell, the preparation (3) of palygorskite nano, electrospinning 3D printing prepares bone repairing support containing nano-attapulgite stone (4), the present invention is based on electrospinning 3D printing techniques for the plantation of mesenchymal stem cell, using more materials, the 3D printing technique that various dimensions direction is developed then is bone repair of cartilage, utilize 3D printing technique, it can be in the time and spatially accurate, material (including the cell of different physiology physical characteristics is combined on demand, with biocompatibility and degradable hydrogel, growth factor etc.), to solve deficiency existing for traditional therapy.)
技术领域
本发明涉及骨软骨生物材料技术领域，具体是指一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用。
背景技术
骨软骨作为关节的重要组成部分，可避免软骨间的冲击与摩擦。在关节等特殊压力环境下的软骨，易受创伤、疾病等问题的影响而发生损伤与病变。其主要与软骨细胞营养代谢、细胞外基质异常降解、生物力学平衡被打破等因素有关。由于软骨组织中缺乏血管与神经，致使软骨损伤后的自我修复能力相当有限，往往引发骨关节炎等疾病，引起关节功能障碍，严重影响患者生活。伴随损伤引发的炎症，引起细胞凋亡，还会通过抑制Ⅱ型胶原合成，促进IL-1β、TNF-α和MMP-13的分泌表达，从而间接的导致软骨支撑作用和保护机制的减弱，加快关节软骨的退变，使正常的软骨细胞向骨关节炎样细胞转化，或加重关节炎的病理改变。对骨软骨损伤成因及修复的研究，已成为再生医学的一个研究重点。
现有骨软骨损伤修复方法主要有传统方法与3D打印两大类。传统的软骨组织治疗方法包括保守治疗和外科治疗。其中，外科治疗包括自体软骨组织细胞移植、微骨折术、软骨下钻孔减压术、关节融合术等，但以上方法存在供体有限、免疫排斥反应、再生能力弱等问题。
现有已应用于临床的金属、陶瓷、无机复合材料支架，往往更着眼于材料的物理特性，在满足生物相容性条件下追求更好的支撑性与耐用性，虽为骨软骨修复提供了空间但缺乏对软骨细胞增殖修复的促进作用。为解决以上问题，科研人员通过多材料并用、改变材料的结构、修饰材料分子基团和应用不同交联剂等方式，进行了各种尝试，这些材料支架在不同程度上展示了各材料的物理特性、打印成型可行性、骨细胞与软骨细胞在不同支架材料上的存活、增殖、分化能力。但目前仍然存在以下问题：(1)不同材料的生物相容性不同，有些材料组分在不同浓度下甚至较大细胞毒性；(2)材料物理性能、降解性能不同，影响软骨再生；(3)不能完全模拟软骨细胞所处的微环境。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对以上问题提供一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用，包括以下制备步骤：
(1)、骨髓间充质干细胞的培养
(2)、凹凸棒石纳米的制备
使用变频式行星球磨机，六偏磷酸钠为助磨剂和分散剂，以纯水为研磨介质，2000rpm研磨凹凸棒粉末1-2小时，通过吸附、电化学作用和化学反应，使凹凸晶体充分分散为200-500纳米级晶体颗粒。
(3)、电纺3D打印制备含纳米凹凸棒石骨修复支架
(3-1)、模型的建立
采用Auto CAD和Materialise Mimics结合3D打印机配套软件建立打印模型，为多层立方体状，各层结构路径间隙根据需要进行调整，保存后输出打印程序代码。
(3-2)、打印材料的制备
取适量生物高分子材料A在温和搅拌下，缓慢加入分散剂B中至混匀。继续搅拌并缓慢加入0.1％-30％(质量体积比)的纳米凹凸棒，制得分散液并加入3D打印机静电纺丝喷头料筒中待用。
(3-3)、打印设备的参数配置
调节熔融静电纺丝3D打印设备的工艺参数，将步骤2制得的分散液放入料筒后接入3D打印机，加热至65℃-80℃，以恒定流速0.8-5mL/hr通过20号针头递送，喷头移动速度25-50mm/s。针尖部位施加高压5-20kV，接受面施加2-15kV的负电压。分散液在电压作用下从喷头出信长流体射流，当射流向接受面加速时，溶剂蒸发，带电聚合物裹挟着纳米凹凸棒石按程序设定在接受面沉积成3D支架。打印完成后，-40℃真空冻干24-72。
(4)、骨髓间充质干细胞的种植：取适量骨髓间充质干细胞种植于各支架区域。
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明基于电纺3D打印技术，采用多材料、多维度方向发展的3D打印技术则为骨软骨修复，利用3D打印技术，可于时间和空间上精确、按需组合不同生理物理特性的材料(包括细胞、具有生物相容性且可降解的水凝胶、生长因子等)，从而解决传统治疗方法存在的不足。
作为改进，所述生物高分子材料A由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
作为改进，所述分散剂B为聚乙烯醇、聚乙二醇、二氯甲烷、六氟异丙醇和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的混合物。
作为改进，所述骨髓间充质干细胞的种植方法如下：移除贴壁生长的骨髓间充质干细胞周围培养基，使用0.01M PBS洗两遍，加入适量为0.25％(质量百分比)胰酶消化3分钟，观察细胞脱落状况，适时使用含血清培养基中止胰酶效果。收集细胞悬液，离心弃上清，培养基重悬后，接种于各支架区域，24小时后更换新鲜培养基，此后每隔2天换液继续培养，待后续实验。
附图说明
图1为一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用的骨修复支架。
图2为一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用的骨修复支架微观结构。
图3为一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用的骨修复支架电镜图(×100)。
图4为一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用的骨修复支架电镜图(×1000)。
图5为细胞在支架表面粘附生长的电镜图。
图6为CCK8法检测支架对细胞增殖影响的结果图。
图7为qRT-PCR检测成骨相关基因结果图。
图8为Westernblot法检测成骨相关蛋白表达结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
本发明在具体实施时，一种纳米凹凸棒石的骨修复支架制备方法及其应用，包括以下制备步骤：
(1)、骨髓间充质干细胞的培养
(2)、凹凸棒石纳米的制备
使用变频式行星球磨机，六偏磷酸钠为助磨剂和分散剂，以纯水为研磨介质，2000rpm研磨凹凸棒粉末1-2小时，通过吸附、电化学作用和化学反应，使凹凸晶体充分分散为200-500纳米级晶体颗粒。
(3)、电纺3D打印制备含纳米凹凸棒石骨修复支架
(3-1)、模型的建立
采用Auto CAD和Materialise Mimics结合3D打印机配套软件建立打印模型，为多层立方体状，各层结构路径间隙根据需要进行调整，保存后输出打印程序代码。
(3-2)、打印材料的制备
取适量生物高分子材料A在温和搅拌下，缓慢加入分散剂B中至混匀。继续搅拌并缓慢加入0.1％-30％(质量体积比)的纳米凹凸棒，制得分散液并加入3D打印机静电纺丝喷头料筒中待用。
(3-3)、打印设备的参数配置
调节熔融静电纺丝3D打印设备的工艺参数，将步骤2制得的分散液放入料筒后接入3D打印机，加热至65℃-80℃，以恒定流速0.8-5mL/hr通过20号针头递送，喷头移动速度25-50mm/s。针尖部位施加高压5-20kV，接受面施加2-15kV的负电压。分散液在电压作用下从喷头出信长流体射流，当射流向接受面加速时，溶剂蒸发，带电聚合物裹挟着纳米凹凸棒石按程序设定在接受面沉积成3D支架。打印完成后，-40℃真空冻干24-72。
(4)、骨髓间充质干细胞的种植：取适量骨髓间充质干细胞种植于各支架区域。
所述骨髓间充质干细胞的种植方法如下：移除贴壁生长的骨髓间充质干细胞周围培养基，使用0.01M PBS洗两遍，加入适量为0.25％(质量百分比)胰酶消化3分钟，观察细胞脱落状况，适时使用含血清培养基中止胰酶效果。收集细胞悬液，离心弃上清，培养基重悬后，接种于各支架区域，24小时后更换新鲜培养基，此后每隔2天换液继续培养，待后续实验。
所述生物高分子材料A由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
所述分散剂B为聚乙烯醇、聚乙二醇、二氯甲烷、六氟异丙醇和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的混合物。
本发明的工作原理：本发明基于基于电纺3D打印技术，采用多材料、多维度方向发展的3D打印技术则为骨软骨修复。
实施例1
1)使用三维打印软件建立打印模型，为多层立方体结构，设定各层打印间隙及路径，保存；
2)取适量高分子材料聚己内酯，缓慢加入含50％(质量百分比)的聚乙二醇的二氯甲烷溶液中至混匀，继续搅拌并缓慢加入1％-10％(质量百分比)的凹凸棒石纳米纳米，制得分散液并加入3D打印机静电纺丝喷头的料筒中待用。
3)打印设备的参数配置调节熔融静电纺丝3D打印设备的工艺参数，将步骤2制得的分散液放入料筒后，接入3D打印机，加热至65℃，以恒定流速0.8-5ml/hr通过20号针头递送，喷头移动速度25-50mm/s。针尖部位施加高压5.0-20kV，接受面施加2-15kV的负电压。分散液在电压下从喷头出信长流体射流，当射流向接受面加速时，溶剂蒸发，带电聚合物裹挟着凹凸棒石纳米按程序设定在接受面沉积成3D支架。打印完成后，冻干24-72小时以出去残留溶剂。通过乙醇溶液中浸泡(75％乙醇)进行灭菌。
实施例2
1)取适量高分子材料聚己内酯，缓慢加入含30％聚乙烯醇的水溶液中至混匀，继续搅拌并缓慢加入5％的纳米凹凸棒石,制得分散液并加入3D打印机静电纺丝喷头的料筒中待用。
2)打印设备的参数配置调节熔融静电纺丝3D打印设备的工艺参数，将步骤2制得的分散液放入料筒后接入3D打印机，加热至65℃-80℃，以恒定流速0.8-5.0ml/hr通过20号针头递送，喷头移动速度25-50mm/s。针尖部位施加高压5.0-20kV，接受面施加2.0-15kV的负电压。分散液在电压下从喷头出信长流体射流，当射流向接受面加速时，溶剂蒸发，带电聚合物裹挟着凹凸棒石纳米纳米按程序设定在接受面沉积成3D支架。打印完成后，冻干24-72小时以出去残留溶剂。75％(质量百分比)乙醇溶液中浸泡(75％乙醇)灭菌。
实施例3
1)取适量高分子材料聚己内酯，缓慢加入含30％(质量百分比)聚乙烯醇的水溶液中至混匀，继续搅拌并缓慢加入10％(质量百分比)的凹凸棒石纳米纳米，制得分散液并加入3D打印机静电纺丝喷头的料筒中待用。
2)打印设备的参数配置调节熔融静电纺丝3D打印设备的工艺参数，将步骤2制得的分散液放入料筒后接入3D打印机，加热至65℃-80℃，以恒定流速0.8-5.0ml/hr通过20号针头递送，喷头移动速度25-50mm/s。针尖部位施加高压5.0-20kV，接受面施加2.0-15kV的负电压。分散液在电压下从喷头出信长流体射流，当射流向接受面加速时，溶剂蒸发，带电聚合物裹挟着凹凸棒石纳米纳米按程序设定在接受面沉积成3D支架。打印完成后，冻干24-72小时以出去残留溶剂。通过乙醇溶液中浸泡(75％乙醇)进行灭菌。
对比例
将上述实施例1-3中得到的电纺3D打印支架进，种植骨髓干细胞，放入培养箱中培养，以单纯聚己内酯电纺3D打印得到的支架，种植骨髓间充质干细胞为对照组，分别与其余支架作对比，分别培养1、3、5天后，利用其余CCK8法检测支架中的细胞活力，结果如图2、3所示，显示带有纳米凹凸棒石的静电纺丝3D打印技术得到的支架上的细胞具有良好的增殖行为，细胞活力较好，且较对照组增殖行为更加显著。培养3、7、14天后，实时荧光定量(qRT-PCR)法检测(图4)显示，实验组较对照组成骨相关基因表达量有不同程度上调。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”，“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。