阅读说明：本技术 新型磺胺类化合物及其在治疗高血脂中的用途 (Novel sulfonamides compound and its purposes in treatment hyperlipidemia ) 是由 王广忠 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了如化合物1所示的磺胺类化合物或其药学上可接受的盐,<Image he="583" wi="563" file="DDA0002211460040000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>通过对模型鼠体内血清、肝脏血脂水平的检测,以及对泡沫细胞内胆固醇含量的影响,发现化合物1能够明显降低血清及肝脏TG、TC水平,使细胞内聚集的胆固醇酯明显减少,显著抑制泡沫化细胞的形成,具有抗高血脂及抗动脉粥样形成的能力。通过对PPARα、PPARγ活性测定发现,化合物1通过双重激动PPARα、PPARγ的作用来改善脂质代谢紊乱,具有同时调节脂代谢和糖代谢的双重作用。(The invention discloses the sulfonamides compound as shown in compound 1 or its pharmaceutically acceptable salt, Pass through the detection to serum, liver blood lipid level in model mouse body, and the influence to foam cells inner cholesterol content, it was found that compound 1 can be substantially reduced serum and liver TG, TC are horizontal, significantly reduce the cholesteryl ester of intracellular accumulation, the formation of foamed cell is significantly inhibited, the ability formed with lipidemia and anti-atherogenic.By the way that PPAR α, the measurement discovery of PPAR gamma activity, compound 1 improves disorders of lipid metabolism by the effect of double excitations PPAR α, PPAR γ, has while adjusting the double action of lipid metaboli and glycometabolism.)

新型磺胺类化合物及其在治疗高血脂中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及磺胺类化合物及其在治疗高脂血症中的用途。

背景技术

血脂是人体血浆内所含脂质的总称，其中包括胆固醇、甘油三脂、胆固醇脂、β-脂蛋白、磷脂、未脂化的脂酸等。当脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常称为高血脂症。一般成年人空腹血清中总胆固醇超过5.72mmol/L，甘油三酯超过1.70mmol/L，可诊断为高脂血症。高脂血症是动脉粥样硬化的主要发病因素，常因侵犯重要器官而引起严重的后果。流行病学显示，至少有2亿中国人存在血脂异常。根据2002进行的全国性调查，中国成人血脂异常患病率为18.6％，其中2.9％为高胆固醇血症(总胆固醇大于或等于5.72mmol/L)，11.9％为高甘油三酯血症(甘油三酯大于或等于1.70mmol/L)，7.4％为高密度脂蛋白偏低(小于1.04mmol/L)。

临床治疗高脂血症化学药物分为四种类型：(1)HMG-CoA还原酶抑制剂。HMG-CoA还原酶抑制剂可竞争性的抑制体内胆固醇合成过程中限速酶活性，从而阻断胆固醇的生成，继而上调细胞表面的低密度脂蛋白(LDL)受体，加速血浆LDL的分解代谢，代表药物如辛伐他汀；(2)苯氧芳酸类降血脂药物。苯氧芳酸类降血脂药物能够激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α，诱导脂蛋白酶表达，促进极低密度脂蛋白(VLDL)、乳糜微粒等富含甘油三酯的脂蛋白颗粒中甘油三酯(TG)成分的水解；还可以通过上调载脂蛋白A1和A2的表达使血浆中高密度脂蛋白(HDL)的含量增加，代表药物如苯扎贝特；(3)胆酸螯合剂。胆汁酸螯合剂能阻止胆酸或胆固醇从肠道吸收，促进胆酸或胆固醇随粪便排出；并且能够反馈性上调肝细胞表面LDL受体表达，进而加速血浆LDL分解代谢，使血浆总胆固醇(TC)和LDL浓度降低，代表药物如考来烯酸；(4)烟酸类降血脂药物。烟酸类降血脂药物在体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)辅酶系统中转变为NAD后发挥降脂效应，代表药物如阿西莫司。

PPARα、PPARγ激动剂分别调节脂质代谢和糖代谢，双重激动PPARα和PPARγ可用于治疗心血管疾病合并代谢功能异常者，并可抵消不良反应。

本发明提供的磺胺类化合物具有与以上类型药物完全不同的新骨架，且可双重激动PPARα、PPARγ的活性，通过药理实验发现具有降低TC、TG、LDL的作用，为治疗高脂血症，特别是合并糖代谢异常的治疗提供新的研究方向。

发明内容

本发明提供了一种新型磺胺类化合物，具体为化合物1、化合物2、化合物3所示的化合物或其药学上可接受的盐，

上述化合物1、化合物2、化合物3的结构数据及其合成方法参见实施例部分。

本发明还提供了所述化合物1-3的药理活性实验，包括模型鼠体内血清、肝脏血脂水平的检测，对泡沫细胞内胆固醇含量的影响，以及对PPARα、PPARγ活性影响试验。

具体实施方式

实施例1：

化合物1的合成方法与Chemical Communications,Issue 57:7861-8012.Copper(I)-catalyzed N–H olefination ofsulfonamides for N-sulfonyl enaminonesynthesis中的方法相同。在氧气条件下，将苯丙酮(0.9mmoL)，N-甲基苯磺酰胺(0.3mmoL)，铜(I)噻吩-2-羧酸酯(20moL％)，对二甲基氨基吡啶(100moL％)，4-CH₃O-TEMPO(3当量)及DMSO(2mL)在110℃搅拌1h。冷却至室温后，用盐水洗涤混合物，用乙酸乙酯萃取。然后将有机层分离并用无水硫酸钠干燥，然后再减压蒸发。残余物用硅胶柱层析分离，用石油/乙酸乙酯混合物(V/V＝10/1)分离得到化合物1。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):8.12(d,J＝8.4Hz,2H),7.75-7.55(m,3H),7.54-7.45(m,2H),7.25(d,J＝8.4Hz,2H),5.60-5.40(m,1H),3.70-3.55(m,1H),3.50-3.30(m,1H),3.26(s,3H),3.26-3.15(m,1H),2.60(s,3H),2.40(s,3H),1.90-1.80(m,1H),1.80-1.65(m,1H),1.50-1.30(m,4H),1.30-1.20(m,4H),1.11(s,3H),0.82(s,3H).¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃):201.2,143.6,137.0,133.8,133.5,129.7,129.2,128.7,127.5,83.2,71.4,55.8,51.7,45.2,45.0,37.5,34.0,33.9,21.5,21.3,21.2。

实施例2：

化合物2的合成方法与Organic Letters(2016),18(15),3774-3777.Palladium-Catalyzed 6-Endo Selective Alkyl-Heck Reactions:Access to 5-Phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Derivatives中的方法相同。N-(2-碘乙基)-4-甲基-N-(2-苯基烯丙基)苯磺酰胺(0.1mmoL)，四(三苯基膦)钯(0.1mmoL)，TEMPO(0.2mmoL)和甲苯(2mL)放置于反应瓶中，氮气条件下130℃加热16h。将反应冷却至室温，用NH₄Cl饱和水溶液猝灭，用EtOAc萃取水层。混合有机层干燥后真空浓缩。用石油/乙酸乙酯混合物(V/V＝10/1)分离得到化合物2。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.46(dd,J＝8.0,2.0Hz,2H),7.35-7.31(m,5H),5.46(s,1H),5.28(s,1H),4.37(s,2H),3.72(t,J＝6.4Hz,2H),3.29(t,J＝6.4Hz,2H),2.41(s,3H),1.52-1.46(m,2H),1.43-1.38(m,4H),0.99(s,12H).¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃):142.9,138.6,137.2,135.1,129.6,128.3,127.9,127.2,126.5,116.2,75.1,59.6,52.3,45.2,39.5,32.8,21.5,21.4,17.0。

实施例3：

化合物3的合成方法与Chemical Communications,Issue 57:7861-8012.Copper(I)-catalyzed N–H olefination ofsulfonamides for N-sulfonyl enaminonesynthesis中的方法相同。在氧气条件下，将苯丙酮(0.9mmoL)，4-氟-N-甲基苯磺酰胺(0.3mmoL)，铜(I)噻吩-2-羧酸酯(20moL％)，对二甲基氨基吡啶(100moL％)，4-CH3O-TEMPO(3当量)及DMSO(2mL)在110℃搅拌24h。冷却至室温后，用盐水洗涤混合物，用乙酸乙酯萃取。然后将有机层分离并用无水硫酸钠干燥，然后在减压蒸发。残余物用硅胶柱层析分离，用石油/乙酸乙酯混合物(V/V＝10/1)分离得到化合物3。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):8.33(d,J＝13.5Hz,1H),7.99–7.80(m,4H),7.55(t,J＝7.3Hz,1H),7.46(t,J＝7.5Hz,2H),7.25(t,J＝13.7,5.1Hz,2H),6.18(d,J＝13.5Hz,1H),3.12(s,3H).¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃):189.18,165.73,143.28(s),138.35,133.51,132.58,130.07,128.57,128.09,117.0,103.64,32.56。

试验例1：对仓鼠血脂水平的影响

1、高血脂动物模型的建立

实验动物适应性饲养1周后，按体重随机分成正常饲料组(8只)和高脂饲料组(40只)，禁食过夜后眼眶采血，取血后尽快分离血清，测定血清中TC、TG、HDL-C水平，以确保实验动物在开始建造高血脂模型前没有出现血脂异常的情况。之后正常饲料组饲喂基础饲料，高脂饲料组饲喂高脂饲料，饲养2周后，再次禁食过夜后眼眶采血，测定计算血清TC、TG水平，当高脂喂养饲料组仓鼠血清TC、TG水平与正常饲料组仓鼠相比显著性升高时，说明高脂饲料组仓鼠血脂出现异常，高血脂动物模型建造成功。基础饲料和高脂饲料配方组成见表1。

表1基础饲料和高脂饲料组成

成分	基础饲料含量(g/kg)	高脂饲料含量(g/kg)
			玉米淀粉	508	407
酪蛋白	242	242
			白砂糖	119	119
猪油	50	150
			胆固醇	0	1
矿物质混合物	40	40
			维生素混合物	20	20
明胶	20	20
			DL-蛋氨酸	1	1

2、实验分组及给药

将高脂血症模型鼠按照TC、TG、LDL-C和HDL-C水平分为5组，分别为模型组(C)、化合物1组、化合物2组、化合物3组及辛伐他汀组，每组8只，使各组的血脂水平无显著性差异；正常饲料组为正常对照组(N)。实验周期为4周，模型组和给药组继续饲喂高脂饲料，正常对照组饲喂基础饲料，自由饮食，每天对实验动物进行灌胃给予2mg/kg受试样品。

3、血脂测定

实验周期结束后(禁食不禁水8h)对仓鼠进行眼眶采血，5000r/min，4℃离心10min，分离血清，测定实验鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。

表2对仓鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影响(mmol/L)

试验结果表明，化合物1能明显的改善模型鼠血脂中TC、TG与LDL-C水平，化合物2改善血脂效果较小，化合物3基本无降血脂作用。各组实验鼠在实验期间血清HDL-C水平均无显著性差异，说明高脂饲料喂养对实验鼠的血清HDL-C水平无显著影响作用。

4、对实验仓鼠肝脏中TC、TG水平的检测

本实验对各组仓鼠肝脏中的TC、TG水平进行检测，来探究各组仓鼠肝脏中脂肪堆积情况，采用Folch method萃取得到肝脏中的TC和TG，之后采用COD-PAP法对其含量进行测定。实验操作参考COD-PAP试剂盒说明。

表3对仓鼠肝脏中TC、TG水平的影响(mg/g)

由表3可知，模型组仓鼠肝脏中TC、TG水平均明显高于正常对照组。化合物1与模型组相比，肝脏中TC、TG水平明显降低，说明化合物1可以有效减少高血脂仓鼠脂肪在肝脏中的堆积；化合物2降脂作用较弱；化合物3基本无降脂作用。

试验例2：对泡沫细胞内胆固醇含量的影响

巨噬细胞泡沫化是早期动脉粥样硬化病变的标志之一，其形成主要原因是细胞内胆固醇平衡被打破，巨噬细胞大量摄取ox-LDL颗粒，在胞内大量蓄积胆固醇。因此，检测化合物对泡沫细胞增殖活力具有抑制作用可表明化合物具有抗动脉粥样硬化的能力。

1、细胞培养、分化及泡沫化处理

细胞培养：THP-1小鼠单核细胞株复苏后，生长于含10％灭活新生小牛血清、1×10⁸U/L青霉素的RPMI-1640完全培养基中，贴壁培养，培养条件为37℃、5％CO₂，每24-48h传代一次。

细胞分化：每次实验前用150nmol/L佛波酯孵育THP-1细胞24h，使其诱导分化为巨噬细胞。

泡沫化处理：取对数生长期细胞进行实验，在每次实验前将细胞密度调整为1×10⁶/mL，加入6孔培养板中。应用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，浓度调整到100mg/L，共同孵育24小时后，诱导巨噬细胞泡沫化。

2、试验分组

实验分14组：对照组、ox-LDL组、化合物1-3与辛伐他汀按浓度分低中高3组(1、10、100μmol/L)。

对照组：不用ox-LDL及辛伐他汀处理，只加入等量的超纯水与其他实验组配平，为空白对照。

ox-LDL组：不用辛伐他汀处理，只加入同等量的超纯水与其他实验组配平，并用ox-LDL泡沫化处理。

化合物1-3与辛伐他汀组：每个化合物/药按浓度(1、10、100μmol/L)分低中高3组，分别用3种浓度处理24小时，并用ox-LDL泡沫化处理。冲洗后将细胞刮下，冰浴下超声粉碎。

3、实验操作

取细胞破碎溶液，加入无水乙醇1mL后加入10mol/L氢氧化钠水溶液0.1mL，50℃水浴中孵育1h，使酯化的胆固醇转化为游离胆固醇(FC)，用于测定总胆固醇(TC)含量。另取细胞破碎液，加入1mol/L氢氧化钠水溶液0.1mL，室温下放置2min，去除绝大部分的甘油三酯和磷脂，保留胆固醇，测定其中游离胆固醇(FC)含量。总胆固醇(TC)量减游离胆固醇(FC)量即为胆固醇酯(CE)的含量。

表4对THP-1小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇代谢的影响

试验结果显示，CE/TC比值随着化合物1浓度的增加而明显降低，化合物2降低不明显，化合物3基本无作用。提示化合物1使细胞内聚集的胆固醇酯明显减少，对抑制泡沫化细胞的形成有显著的效果，具有抗动脉粥样形成的能力。

试验例3：化合物1对PPARα、PPARγ的活性测定

1、pBIND-PPARs-LBD表达质粒的构建

按照Superscript II Reverse Transcriptase试剂盒说明书对肝总RNA进行反转录，再以cDNA为模板进行PCR，将PCR的产物进行胶回收，并连接到pGME-TVector，然后进行测序。将测序结果与Genebank上的目的序列进行比对。将序列正确的PPARα-LBD进行双酶切与pBIND Vector连接构成表达质粒pBIND-PPARs-LBD。

2、PPAR的激动活性测定

人的正常肝细胞L02细胞用含10％胎牛血清、1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素的PRMI1640培养基在37℃，5％CO₂培养箱中培养。

将对数生长期的L02细胞以3×10⁵个/mL细胞数接种细胞于96孔板，24h后，将培养液换成含10％胎牛血清的无双抗的PRMI1640培养基，用lipofectamine2000将重组质粒的报告质粒pG51uc和pGAL4-PPAR-LBD嵌合表达质粒共转染入细胞中。6h加入不同浓度的药物诱导，DMSO作为空白对照。给药24h后，Victor²1420 Multilabel Counter，利用LuciferaseAssay System检测细胞中荧光素酶的活性。

表5化合物1对PPARα、PPARγ激动活性的EC₅₀值

	PPARα(μM)	PPARγ(μM)
			化合物1	25.7	29.5

试验结果表明，化合物1对PPARα、PPARγ均表现出良好的激动作用，适用于脂代谢和糖代谢均紊乱的代谢功能异常患者。