阅读说明：本技术 一种多器官芯片及其制备方法和应用 (A kind of multiple organ chip and its preparation method and application ) 是由 魏文博 陈娟娟 肖亮 于 2018-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多器官芯片及其制备方法和应用,本多器官芯片内设有至少两个流体通道组,每个流体通道组内通过多孔膜分隔成两个独立的上层流体通道和下层流体通道,并且还设有连接通道,用于连接位于不同流体通道组内的上层流体通道和下层流体通道,即位于不同流体通道组内的上层流体通道和下层流体通道通过连接通道连接成一个流体通道,从而本芯片内具有至少三个独立的流体通道,同时这些独立的流体通道又可以通过多孔膜进行营养与物质交换,故本多器官芯片可以接种至少三种组织细胞,并且可以对每个流体通道内的不同组织细胞进行最适动态培养方式,从而实现多种组织器官的线性相互作用。本多器官芯片的结构简单,生产成本低。(The invention discloses a kind of multiple organ chips and its preparation method and application, at least two fluid channel groups are equipped in this multiple organ chip, two independent top fluid channels and lower layer's fluid channel are separated by perforated membrane in each fluid channel group, and it is additionally provided with interface channel, for connecting the top fluid channel being located in the group of different fluid channel and lower layer's fluid channel, the top fluid channel and lower layer's fluid channel being located in the group of different fluid channel connect into a fluid channel by interface channel, to have at least three independent fluid channels in this chip, these independent fluid channels can carry out nutrition and mass exchange by perforated membrane again simultaneously, therefore this multiple organ chip can be inoculated at least three kinds of histocytes, and most suitable dynamic cultivation mode can be carried out to the different tissues cell in each fluid channel, To realize the linear interaction of Various Tissues organ.The structure of this multiple organ chip is simple, and production cost is low.)

一种多器官芯片及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及器官仿生技术领域，具体涉及一种多器官芯片及其制备方法和应用。

背景技术

药物研发是一个漫长且耗资巨大的过程，大多数新药未能顺利进入临床，其主要原因是现有基于体外细胞培养技术以及动物模型都不能真实反映人体内的微环境。为了解决这一难题，2012年美国国立卫生研究中心(NIH)、美国食品和药品管理局(FDA)和美国国防部高级研究计划局(DARPA)联合发起了器官芯片(organ-on-chip)的研发工作。

经过几年的研究，已经有许多仿生器官芯片被设计制备出来，并开始尝试用于药物筛选、毒理分析等。在器官芯片的基础上，研究者又提出来人体芯片(human-on-chip)，通过将不同器官有机的结合到一块芯片内，从而更好的模拟药物等在体内的作用以及代谢过程。

目前，已有一些研究组和公司已经开发出多器官芯片，该芯片流通通道在下层，将不同细胞接种在商品化的transwell里，并结合下层的流体形成多器官连用。

现有多器官芯片只是将不同组织细胞接种在不同区域内，没有考虑到不同组织的三维结构，会造成一些组织细胞功能的弱化或缺失，如TISSUSE公司的2-organ-chip，是二维细胞培养，并且培养在transwell中的细胞处于相对静态环境中。

现有另一些多器官芯片，如Hesperos公司的10-Organ Chip，虽然按照不同器官的体积设计相应器官培养室的大小，但该芯片设计与组装十分复杂，同时，该芯片选用的重力来操控液体且使用同一种培养基，这种方法难以满足不同组织所特有的流体环境与营养环境。

发明内容

本发明提供一种结构简单、能够同时培养多种组织细胞，并实现多器官联用的器官芯片及其制备方法和应用。

根据第一方面，一种实施例中提供一种多器官芯片，具有至少两个流体通道组和至少一个连接通道，流体通道组包括对应设置的上层流体通道和下层流体通道，上层流体通道和下层流体通道之间设有多孔膜，多孔膜将上层流体通道和下层流体通道分隔开，连接通道的两端分别与位于不同流体导通组的上层流体通道和下层流体通道连接。

根据第二方面，一种实施例中提供一种多器官芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备上层芯片和下层芯片；

封接组装：将多孔膜封接在上层芯片和下层芯片之间，形成多器官芯片。

根据第三方面，一种实施例中提供了一种制备多器官联用系统的方法，利用上述的多器官芯片进行

任选地，包括如下步骤：

分别利用70％的酒精和紫外线射线对上述的多器官芯片进行灭菌处理；

将细胞外基质溶液注入到所以流体通道内对多孔膜和流体通道进行修饰，修饰后用无血清的培养基或PBS清洗通道；

根据所要构建的多器官联用模型准备不同的组织细胞，并分别接种到相应的流体通道内，静止2小时以上使细胞黏附与修饰后的流体通道内生长；

不同组织细胞同时接种到芯片内，或者根据不同细胞的生长、分化以及成熟的情况，按照时间顺序依次接种到相应的流体通道内；

对不同流体通道内的组织细胞选用相应的培养基，并利用相应的流体速度进行灌流培养，以模拟不同组织器官的微环境；

培养在不同流体通道内的组织细胞，通过多孔膜或直接进行物质交换，从而在芯片内形成多器官联用系统。

依据上述实施例的多器官芯片及其制备方法和应用，本多器官芯片内设有至少两个流体通道组，每个流体通道组内通过多孔膜分隔成两个独立的上层流体通道和下层流体通道，并且还设有连接通道，用于连接位于不同流体通道组内的上层流体通道和下层流体通道，即位于不同流体通道组内的上层流体通道和下层流体通道通过连接通道连接成一个流体通道，从而本芯片内具有至少三个独立的流体通道，同时这些独立的流体通道又可以通过多孔膜进行营养与物质交换，故本多器官芯片可以接种至少三种组织细胞，并且可以对每个流体通道内的不同组织细胞进行最适动态培养方式，从而实现多种组织器官的线性相互作用。本多器官芯片的结构简单，生产成本低。

附图说明

图1为实施例一中多器官芯片的上层芯片和下层芯片对半翻开的结构示意图；

图2为实施例一中多器官芯片的截面结构示意图；

图3为其他实施例中多器官芯片的上层芯片和下层芯片对半翻开的结构示意图；

图4为其他实施例中多器官芯片的截面结构示意图；

图5为实施例二中多器官芯片制备方法的流程图；

图6为实施例二中上层芯片和下层芯片制备方法的流程图；

图7为实施例二中多孔膜封接的流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例一：

本实施例提供了一种多器官芯片，本多器官芯片为三层结构，具有三个独立的流体通道，可同时动态培育三种器官细胞，适用于药物筛选、食品安全等生物医学领域研究。

如图1所示，本实施例的多器官芯片包括上层芯片110和下层芯片120，上层芯片110的下表面具有两个开放的上层流体通道111和112，下层芯片120的上表面具有两个开放的下层流体通道121和122，上层流体通道111和112与下层流体通道121和122对应设置，形成两个流体通道组，上层流体通道111与下层流体通道121对应组成一个流体通道组，上层流体通道112与下层流体通道122对应组成另一个流体通道组。上层芯片110还设有开放的连接通道130，本实施例中，连接通道130由上层流体通道112延伸而成，连接通道130的一端与上层流体通道112的端部连接导通，另一端延伸至与下层流体通道121的端部连接导通。

如图2所示，本实施例的多器官芯片的上层芯片110和下层芯片120之间封接有多孔膜140，上层芯片110和下层芯片120上开放的流体通道均围合封闭，多孔膜140将上层流体通道和下层流体通道分隔开，并通过多孔膜140进行流体通道间的物质交换。连接通道130将上层流体通道112和下层流体通道121连接成一个流体通道，从而本多器官芯片具有三个独立的流体通道，分别为上层流体通道111、上层流体通道112与下层流体通道121连接成的流体通道、下层流体通道122，三个流体通道可通过多孔膜140实现物质交换，可以将至少三种组织细胞接种在本多器官芯片的独立流体通道内，可以模拟三种组织间的相互作用。在连接通道130内与下层流体通道121的对接处可设置多孔膜140，或在连接通道130内不设置多孔膜140。

本实施例中，在上层芯片110上打有六个孔，分别与三条独立流体通道的两端对应，使得三条独立流体通道分别具有各自的流体出入口。

在其他实施例中，如图3和图4所示，上层芯片110和下层芯片120中分别有三个上层流体通道和三个下层流体通道，组成三个流体通道组，并在两组相邻的两个下层流体通道的下层流体通道和上层流体通道之间设有连接通道，上层芯片110和下层芯片120中间封接多孔，在本多器官芯片内形成4个独立的流体通道，且相邻流体通道到之间可以通过多孔膜140进行物质交换。本多器官芯片可以在4个独立的流体通道内接种至少4种组织细胞，模拟4中器官的相互作用。

在其他实施例中，在上层流体通道和下层流体通道内设置其他不同数量的流体通道，并可以按照所需不同器官的体积设计通道尺寸，以满足更多数量器官细胞的模拟，提高芯片的通量。也可将连接通道130设置在下层芯片120上，将下层芯片的下层流体通道延长设置形成。

本实施例中，上层流体通道和下层流体通道的长度约为5-15毫米，宽约为0.5-1毫米，高约为0.1-0.5毫米。上层芯片110和下层芯片120为PDMS、SEBS、PMMA、PS或PE等材质。

多孔膜140上通孔的孔径约为0.22-10微米，通孔的直径为0.5-1.5毫米，多孔膜140为高分子材料膜或生物材料膜。高分子材料膜至少包括PC、硝酸纤维和PET，生物材料膜至少包括海藻酸、壳聚糖、胶原和明胶。

在本实施例中，多器官芯片通过两个流体通道组和连接通道的设置，形成三个独立的流体通道，三个流体通道可通过多孔膜140实现物质交换，可以将至少三种组织细胞接种在本多器官芯片的独立流体通道内，可以模拟三种组织间的相互作用。并且本多器官芯片的结构简单，生产成本低。

实施例二：

本实施例提供了一种多器官芯片的制备方法，本制备方法主要采用软光刻技术制备上述实施例一中的多器官芯片。

如图5所示，本实施例的多器官芯片的制备方法主要包括如下步骤：

S100：制备上层芯片和下层芯片；

S200：封接组装。

步骤S200中，将多孔膜封接在所述上层芯片和下层芯片之间，形成多器官芯片。

具体的，如图6所示，步骤S100(制备上层芯片和下层芯片)包括如下步骤：

S101：在玻璃或硅片的基底表面旋涂光刻胶，并进行前烘；

本实施例中优选SU-8光刻胶，SU-8光刻胶是一种环氧型的、近紫外光负光刻胶，SU-8光刻胶在近紫外光范围内光吸收率低，使得在光刻胶厚度上都具有较好的曝光均匀性，能够得到图形边缘近乎垂直的结构。

SU-8光刻胶光刻的机理如下：光刻胶中的光引发剂吸收光子发生了化学反应，生产一种强酸，其作用是前烘过程中作为酸催化剂促进交联反应。只有在曝光区域的光刻胶中才会产生强酸，故只有在曝光区域内才发生交联反应，未曝光的区域不发生交联反应，而光刻胶发生交联反应后不溶于显影液，而光刻胶未发生交联反应的溶于显影液，因此显影后的光刻胶形成与掩膜图案相反的图形。

本步骤中，旋涂SU-8光刻胶的厚度为200微米，与上层流体通道和下层流体通道的高度对应。前烘的温度为95℃，时间为2小时。

S102：将具有上下层芯片结构图案的掩膜固定于附有光刻胶的基底表面；

掩膜具有上下层芯片结构图案,上下层芯片结构图案上具有上层流体通道结构和下层流体通道结构，图案与上层芯片和下层芯片的流体通道对应，掩膜用于隔档紫外光，从而将掩膜上图案复制到SU-8光刻胶上。

S103：光源垂直照射附有掩膜和光刻胶的玻璃或硅片进行曝光，并进行后烘；

紫外光穿过掩膜上的图案照射到SU-8光刻胶上，SU-8光刻胶被曝光的区域将发生交联，交联后的区域不溶于显影液。本实施例中，光源为紫外光光源，用于发射紫外光进行曝光。

本步骤中，后烘的温度为95℃，时间为10分钟。

S104：自然冷却后，采用乳酸乙酯显影液去除未曝光的光刻胶，形成上下层流体通道结构的模板，并进行坚膜；

本步骤中，通过显影液去除未曝光的SU-8光刻胶，显影后的SU-8光刻胶形成与掩膜相反的图形结构，再坚膜加固，坚膜的温度为180℃，时间为2小时。

S105：通过具有上下层芯片结构的模板制备上层芯片和下层芯片。

本步骤中，通过上层流体通道结构、下层流体通道结构和连接通道结构相反结构的光刻胶模板制备出PDMS材质的上层芯片和下层芯片，上层芯片和下层芯片各包含两条独立的流体通道，并且在上层芯片指定位置打孔，形成上下层流体通道的出入孔，而下层芯片不打孔。最终完成制备成上层芯片和下层芯片。

如图7所示，步骤S200(封接组装)包括如下步骤：

S201：将多孔膜封接在上层芯片上；

通过热压或键合的方式将多孔膜固定在上层芯片上，

S202：将下层芯片对准封接在多孔膜的另一侧，形成多器官芯片。

将下层芯片与附有多孔膜的上层芯片对准，通过热压或键合的方式固定，下层芯片封接在多孔膜的另一侧。多孔膜为PC膜，也可为PDMS等材质的膜。

在相邻下层流体通道与上层流体通道的交汇处设有通孔，通孔处的多孔膜可以保留，也可以移除通孔处的多孔膜。

本实施例提供的多器官芯片的制备方法，主要采用软光刻技术制备多器官芯片，制备效率高，并选用SU-8光刻胶进行制备，能够制备出结构精度高的芯片。

实施例三：

本实施例提供了一种制备多器官联用系统的方法，本方法为对多器官芯片的应用。

本实施例制备多器官联用系统的方法，利用实施例一中的含有三个独立流体通道的多器官芯片进行，构建多器官联用体系，具体包括如下步骤：

S301：分别利用70％的酒精和紫外线射线对实施例一中所述的芯片进行灭菌处理；

S302：将细胞外基质溶液(I型胶原、基质胶matrigel等)从芯片上层的两个流体通道入口注入到通道内对多孔膜进行修饰；将细胞外基质溶液(I型胶原、基质胶matrigel等)从芯片上层与下层流体通道相同的流体入口注入芯片下层流体通道对下层流体通道进行修饰，修饰后用无血清的培养基或PBS清洗通道；

S303：将肠细胞(Caco-2)按照10⁶个/ml的浓度接种到芯片上层流体通道内111，静止2小时以上使细胞黏附于修饰后的多孔膜140上生长；

S304：对肠细胞(Caco-2)进行灌流培养，5-7天后肠细胞(Caco-2)将分化成熟，在芯片上层形成肠道微组织；

S305：再将血管内皮细胞(HUVEC)按照10⁶个/ml的浓度接种到芯片上层流体通道内112，静止2小时以上使细胞黏附于修饰后的多孔膜140上生长；

S306：再将肝细胞(HepG2)按照10⁶个/ml的浓度接种到芯片下层流体通道内122，静止2小时以上使细胞黏附于修饰后的下层通道底面；

S307：对三种细胞同时进行灌流培养，在芯片内形成肠-血管-肝三器官联用系统，并可以应用于药物吸收、代谢、以及药代动力学等相关研究工作。

“肠-血管-肝”三器官联系统用是模拟体内的吸收代谢功能。首先，肠细胞在芯片内形成的肠组织具有吸收功能，可将肠器官流体通道内的物质通过多孔膜运输到血管通道内，此过程为模拟吸收功能；进入血管的物质再透过血管，进入到肝通道内，模拟血液循环的过程；最后，吸收的物质到了肝通道内，被培养的肝细胞代谢后形成代谢产物。本芯片构建了模拟了人体吸收代谢的通量，芯片将多个器官串联在一起，形成是一个单相的通路。实验时，可以根据所要构建的代谢通路，将所涉及的组织分别接种在相连的通道内。

本实施例的肠-血管-肝三器官联用系统用于考察口服药物通过肠吸收、肝代谢后对肾脏是否具有副作用。

在其他实施例中，多器官联用系统可用于人体其他器官的联用，人体拥有10种以上的器官类型，包括肝、肠、心、肾、脑、肺，以及生殖系统、免疫系统、血管系统和皮肤等。根据体内器官之间运行的先后顺序，将多种器官模型组装有机的整合到一块芯片内。例如：模拟口服药物的代谢过程，可以在芯片内构建肠-肝-靶器官-副作用器官的联用，其中靶器官可以包括：心脏、脑、肺、肾、血脑屏障、胎盘屏障等，副作用器官可以包括：肝、肾、心脏等。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。