阅读说明：本技术 基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌及其构建方法与应用 (Neurosporene high production bacteria and its construction method and application based on Du Shi algae metabolic pathway ) 是由 姜建国 陈浩宏 常旭 吴芳纯 于 2019-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌及其构建方法与应用,涉及基因工程菌领域。本发明第一次实现全部利用来自杜氏藻(如杜氏巴氏藻或杜氏盐藻)的类胡萝卜素途径的基因来构建工程菌。当杜氏藻为杜氏巴氏藻时,所述链孢红素高产工程菌的链孢红素的产率为2.4mg/g(细胞干重)；当杜氏藻为杜氏盐藻时,所述链孢红素高产工程菌的链孢红素的产率为3.1mg/g(细胞干重)。本发明采用的载体的启动子都是T7启动子,包含lacZ调控元件,其在IPTG作用的大肠杆菌BL21(DE3)中能够高表达,这有利于链孢红素的大量积累,可用于实际应用生产。(The present invention discloses a kind of neurosporene high production bacteria based on Du Shi algae metabolic pathway and its construction method and application, is related to genetic engineering bacterium field.The present invention is realized all of the gene of the carotenoid approach from Du Shi algae (such as Du Shi Pasteur algae or Dunaliella salina) for the first time constructs engineering bacteria.When Du Shi algae is Du Shi Pasteur algae, the yield of the neurosporene of the neurosporene high production bacteria is 2.4mg/g (dry cell weight)；When Du Shi algae is Dunaliella salina, the yield of the neurosporene of the neurosporene high production bacteria is 3.1mg/g (dry cell weight).The promoter for the carrier that the present invention uses all is T7 promoter, includes lacZ controlling element, high can be expressed in the e. coli bl21 (DE3) of IPTG effect, this is conducive to a large amount of accumulation of neurosporene, can be used for practical application production.)

基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌及其构建方法与 应用

技术领域

本发明涉及基因工程菌领域，涉及植物类胡萝卜素代谢途径载体的构建克隆系统，特别涉及一种基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌及其构建方法与应用；具体涉及一种杜氏藻(如杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)、杜氏盐藻(Dunaliella saline))中牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)、八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)基因的cDNA并构建出高产链孢红素的工程菌。

背景技术

类胡萝卜素分子是含8个异戊二烯单位的萜类化合物，其作为有机色素广泛存在于植物的叶绿体和有色体中，以及其它的一些光合组织中，比如藻类，部分细菌和真菌中。在特定条件下，杜氏藻细胞中类胡萝卜素含量可达到细胞干重的14％。其高含量可能跟酶的转化效率有很大的关系。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌。

本发明的另一目的在于提供上述基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌，基于杜氏巴氏藻(Dunaliellabardawil)代谢途径时，所述链孢红素高产工程菌含有编码GenBank：APW83740.1所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)基因、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因、编码GenBank：ADD52599.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因、编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因和编码SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)基因；

基于杜氏盐藻(Dunaliella saline)代谢途径时，所述链孢红素高产工程菌含有编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)基因、编码GenBank：AAB51287.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因、编码GenBank：CAA75094.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因、编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因和编码SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)基因；

优选的，基于杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)代谢途径时，编码GenBank：APW83740.1所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)基因的核苷酸序列为如GenBank：KX231795.1所示的核苷酸序列；其中，GenBank：APW83740.1与GenBank：KX231795.1中的来源Dunaliella salina记载有误，实际来源应该是Dunaliellabardawil；

编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

编码GenBank：ADD52599.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因的核苷酸序列为如GenBank：GQ923693.1所示的核苷酸序列；其中，GenBank：ADD52599.1与GenBank：GQ923693.1中的来源Dunaliella salina记载有误，实际来源应该是Dunaliellabardawil；

编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

编码SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；

优选的，基于杜氏盐藻(Dunaliella saline)代谢途径时，编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；

编码GenBank：AAB51287.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因的核苷酸序列为如GenBank：U91900.1所示的核苷酸序列；其中，GenBank：U91900.1中的来源Dunaliella bardawil记载有误，实际来源应该是Dunaliella saline；

编码GenBank：CAA75094.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因的核苷酸序列为如GenBank：Y14807.1所示的核苷酸序列；其中，GenBank：Y14807.1中的来源Dunaliella bardawil记载有误，实际来源应该是Dunaliella saline；

编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；

编码SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；

所述的基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用相关基因工程手段从杜氏藻中克隆到牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)、八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)；

(2)将Ggps和Psy构建在pACYduet-1载体上，氯霉素抗性，得到重组载体pACYduet-ggps-psy；将Pds和Zds构建在pCDFduet-1载体上，链霉素抗性，得到重组载体pCDFduet-pds-zds；将Ziso构建在pETduet-1载体上，氨苄抗性，得到重组载体pETduet-ziso；

(3)然后将步骤(2)构建的三个重组载体共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌。

优选的，所述的杜氏藻为杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)或杜氏盐藻(Dunaliella saline)。

优选的，重组载体构建时，在5个目的基因的N端(5′端)均连接有rbs(核糖体结合位点)序列，或者，均连接有T7启动子(T7_promoter)序列和rbs(核糖体结合位点)序列。

所述的基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌在生产链孢红素中的应用。

当杜氏藻为杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)时，所述链孢红素高产工程菌的链孢红素的产率为2.4mg/g(细胞干重)。

当杜氏藻为杜氏盐藻(Dunaliella saline)时，所述链孢红素高产工程菌的链孢红素的产率为3.1mg/g(细胞干重)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明第一次实现全部利用来自杜氏藻(如杜氏巴氏藻或杜氏盐藻)的类胡萝卜素途径的基因来构建工程菌。而杜氏藻(如杜氏巴氏藻或杜氏盐藻)是已知的产链孢红素最高的植物之一。本发明采用的载体的启动子都是T7启动子，包含lacZ调控元件，其在IPTG作用的大肠杆菌BL21(DE3)中能够高表达，这有利于链孢红素的大量积累，可用于实际应用生产。

附图说明

图1是本发明pACYduet-Dbggps-Dbpsy(A)和pCDFduet-Dbpds-Dbzds(B)构建图。

图2是本发明pETduet-Dbziso构建图。

图3是本发明基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌与普通大肠杆菌BL21(DE3)颜色比较；其中，A是基于杜氏巴氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌；B是基于杜氏盐藻代谢途径的链孢红素高产工程菌。

图4是链孢红素液相图；其中，A是实施例1；B是实施例2。

图5是本发明pACYduet1-Dsggps-Dspsy构建图。

图6是本发明pCDFduet1-Dspds-Dszds构建图。

图7是本发明pETduet1-Dsziso构建图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1.制备线性化载体

(1)用NcoI和HindIII(购自Thermo Fisher Scientific)双酶切质粒pACYduet-1，pCDFduet-1和pETduet-1(购自EMD Biosciences)。37℃水浴3h。酶切反应体系如下：

10×Buffer 5μL、两种酶各1μL、质粒10μL、Add dH₂O To 50μL。

(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

(3)酶切之后，采用PCR纯化试剂盒纯化线性化载体。

2.PCR扩增目的片段

(1)以杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)(购自中科院水生生物研究所淡水藻种库，编号FACHB-847)反转录的cDNA为模板，使用Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(高保真酶，购自Takara)，进行PCR反应。

(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

(3)用OMEGA公司的胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收目的片段，纯化PCR产物。测序结果如GenBank：KX231795.1、SEQ ID NO：1、GenBank：GQ923693.1、SEQ ID NO：3、5所示，对应编码的氨基酸序列如GenBank：APW83740.1、SEQ ID NO：2、GenBank：ADD52599.1、SEQ ID NO：4、6所示。

3.In-Fusion克隆

用NcoI和HindIII双酶切质粒pACYduet-1并***用引物Pac_dbggps_F和Pac_dbggps_R扩增得到的Dbggps，得到pACYduet-Dbggps；再用NdeI和EcoRV双酶切pACYduet-Dbggps并***用引物Pac_dbpsy_F和Pac_dbpsy_R扩增得到的Dbpsy，得到pACYduet-Dbggps-Dbpsy。引物序列如表1所示。

用NcoI和HindIII双酶切质粒pCDFduet-1并***用引物Pcd_dbpds_F和Pcd_dbpds_R扩增得到的Dbpds，得到pCDFduet-Dbpds；再用NdeI和EcoRV双酶切pCDFduet-Dbpds并***用引物Pcd_dbzds_F和Pcd_dbzds_R扩增得到的Dbzds，得到pCDFduet-Dbpds-Dbzds。引物序列如表1所示。

用NcoI和HindIII双酶切质粒pETduet-1并***用引物Pet_dbziso_F和Pet_dbziso_R扩增得到的Dbziso，得到pETduet-Dbziso。引物序列如表1所示。

(1)建立In-Fusion(购自Takara)克隆反应体系：

5X In-Fusion HD Enzyme Premix	2μL
		线性化载体	1μL
纯化的PCR片段	2μL
		dH<sub>2</sub>O	5μL
Total	10μL

(2)50℃孵育15min，然后置于冰上。

(3)连接产物分别转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氯霉素(CmR或CamR)、链霉素(Sm)或氨苄青霉素(Ap或Amp)的相应平板上。在37℃生化培养箱中分别倒置培养12～16h。注意培养时间不宜过长，否则抗性失效，生长出卫星菌落，给筛选阳性克隆造成困难。

表1构建重组质粒的引物

4.质粒的提取

参照OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒的说明书，提取重组质粒pACYduet-Dbggps-Dbpsy(图1A)、pCDFduet-Dbpds-Dbzds(图1B)、pETduet-Dbziso(图2)。

(1)10000g，1min离心，收集菌体。(2)加入250μL SolutionⅠ，涡旋十几秒，混匀。(3)加入250μL SolutionⅡ，上下颠倒4～6次，室温放置2min。(4)加入350μL SolutionⅢ，轻轻摇匀，10000g，10min离心。(5)转上清至Hibind柱，10000g，1min离心。(6)弃掉滤液，加入500μL Buffer HB，10000g，1min离心。(7)弃掉滤液，加入700μL DNA Wash Buffer，10000g，1min离心。(8)重复洗一次(步骤(7))。(9)10000g，空管离心2min。(10)弃掉收集管将HiBind柱套进干净的1.5mL EP管，加入50～100μL灭菌水(60℃预热)洗脱DNA，静置1～2min后，10000g，1min离心。

5.转化大肠杆菌BL21(DE3)

将提取的重组质粒pACYduet-Dbggps-Dbpsy、pCDFduet-Dbpds-Dbzds和pETduet-Dbziso共转化到大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有CmR、Sm和Ap抗生素的平板上，在37℃生化培养箱中倒置培养12～16h。经过筛选获得目的菌株，即基于杜氏巴氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌，如图3A所示，白色为BL21(DE3)对照菌株，土黄色的为高产链孢红素菌株。

6.转化子的培养

将目的菌株接种于50mL已灭菌的LB液体培养基中(加入氯霉素、氨苄青霉素、链霉素抗性)，于200rpm，37℃下振荡培养6h。加入IPTG进行诱导，培养6小时。

7.提取转化子的类胡萝卜素

(1)将24mL菌液于4℃，8000rpm下离心2min，弃上清。(2)用去离子水重新悬浮大肠杆菌细胞，4℃，8000rpm离心2min，弃上清。(3)重复步骤(2)。(4)加6mL丙酮至大肠杆菌沉淀，涡旋振荡分散。(5)55℃水浴20min，每隔5min振荡一次。(6)将混合物于4℃，8000rpm下离心20min，收集上清。(7)用丙酮定容至6mL，-20℃保存。

8.HPLC定性分析转化子的类胡萝卜素成分

(1)将流动相用0.22μm孔径滤膜进行抽滤处理，接着超声处理60min去除液体中的气泡。

(2)将类胡萝卜素提取物以及链孢红素标准品溶液，用0.2μm孔径的聚碳酸酯滤膜进行过滤处理。

(3)调节色谱柱(C30YMC carotenoid column,5μm,250*4.6mm)温度在25℃，以1.0mL/min的流速用甲醇冲洗至平衡(约2h)。

(4)改为用流动相甲基叔丁基醚(A相)/甲醇(B相)(梯度洗脱：0min，90％A相和10％B相；10min，60％A相和40％B相；20min 50％A相和50％B相；25min，10％A相和90％B相；29.5min，90％A相和10％B相)，以1mL/min的流速进行洗柱，直至平衡。

(5)将浓度为100μg/mL的链孢红素标准品存储液稀释为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL等不同浓度的工作液，用HPLC仪测定473nm波长下工作液的峰面积，根据结果绘制标准曲线。

(6)上样20μL，在波长473nm下检测40min。

结果如图4A所示，表明在18.2min左右出现了链孢红素的特征峰，这与标准品的出峰时间是一致的，另外根据该峰面积，结合得到的标准曲线方程：y＝63.124x-0.4755(x为峰面积，y为链孢红素的含量)，再根据细胞的干重，我们可以计算出链孢红素的产率为2.4mg/g(细胞干重)。

实施例2

1.制备线性化载体

(1)用Asc I和Sal I(购自Thermo Fisher Scientific)双酶切质粒pACYduet-1，pCDFduet-1和pETduet-1(购自EMD Biosciences)。37℃水浴3h。酶切反应体系如下：

10×Buffer 5μL、两种酶各1μL、质粒10μL、Add dH₂O To 50μL。

(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

(3)酶切之后，采用PCR纯化试剂盒纯化线性化载体。

2.PCR扩增目的片段

(1)以杜氏盐藻(Dunaliella saline)(购自Culture Collection of Algae andProtozoa，英国；编号CCAP 19/18)反转录的cDNA为模板，使用Takara的PrimeSTAR HS DNAPolymerase(高保真酶，购自Takara)，进行PCR反应。

(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

(3)用OMEGA公司的胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收目的片段，纯化PCR产物。测序结果如SEQ ID NO：7、GenBank：U91900.1、GenBank：Y14807.1、SEQ IDNO：9、11所示，对应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8、GenBank：AAB51287.1、GenBank：CAA75094.1、SEQ ID NO：10、12所示。

3.In-Fusion克隆

用Asc I和Sal I双酶切质粒pACYduet-1并***用引物Pac_dsggps_F和Pac_dsggps_R扩增得到的Dsggps，得到pACYduet1-Dsggps；再用NdeI和EcoRV双酶切pACYduet1-Dsggps并***用引物Pac_dspsy_F和Pac_dspsy_R扩增得到的Dspsy，得到pACYduet1-Dsggps-Dspsy。引物序列如表2所示。

用Asc I和Sal I双酶切质粒pCDFduet-1并***用引物Pcd_dspds_F和Pcd_dspds_R扩增得到的Dspds，得到pCDFduet1-Dspds；再用NdeI和EcoRV双酶切pCDFduet1-Dspds并***用引物Pcd_dszds_F和Pcd_dszds_R扩增得到的Dszds，得到pCDFduet1-Dspds-Dszds。引物序列如表2所示。

用Asc I和Sal I双酶切质粒pETduet-1并***用引物Pet_dsziso_F和Pet_dsziso_R扩增得到的Dsziso，得到pETduet1-Dsziso。引物序列如表2所示。

(1)建立In-Fusion(购自Takara)克隆反应体系：

5X In-Fusion HD Enzyme Premix	2μL
		线性化载体	1μL
纯化的PCR片段	2μL
		dH<sub>2</sub>O	5μL
Total	10μL

(2)50℃孵育15min，然后置于冰上。

(3)连接产物分别转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氯霉素(CmR或CamR)、链霉素(Sm)或氨苄青霉素(Ap或Amp)的相应的平板上。在37℃生化培养箱中分别倒置培养12～16h。注意培养时间不宜过长，否则抗性失效，生长出卫星菌落，给筛选阳性克隆造成困难。

表2构建重组质粒的引物

4.质粒的提取

参照OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒的说明书，提取重组质粒pACYduet1-Dsggps-Dspsy(图5)、pCDFduet1-Dspds-Dszds(图6)、pETduet1-Dsziso(图7)。

(1)10000g，1min离心，收集菌体。(2)加入250μL SolutionⅠ，涡旋十几秒，混匀。(3)加入250μL SolutionⅡ，上下颠倒4～6次，室温放置2min。(4)加入350μL SolutionⅢ，轻轻摇匀，10000g，10min离心。(5)转上清至Hibind柱，10000g，1min离心。(6)弃掉滤液，加入500μL Buffer HB，10000g，1min离心。(7)弃掉滤液，加入700μL DNA Wash Buffer，10000g，1min离心。(8)重复洗一次(步骤(7))。(9)10000g，空管离心2min。(10)弃掉收集管将HiBind柱套进干净的1.5mL EP管，加入50～100μL灭菌水(60℃预热)洗脱DNA，静置1～2min后，10000g，1min离心。

5.转化大肠杆菌BL21(DE3)

将提取的重组质粒pACYduet1-Dsggps-Dspsy、pCDFduet1-Dspds-Dszds和pETduet1-Dsziso共转化到大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有CamR、Sm和Amp抗生素的平板上，在37℃生化培养箱中倒置培养12～16h。经过筛选获得目的菌株，即基于杜氏盐藻代谢途径的链孢红素高产工程菌，如图3B所示，白色为BL21(DE3)对照菌株，土黄色的为高产链孢红素菌株。

6.转化子的培养

将目的菌株接种于50mL已灭菌的LB液体培养基中(加入氯霉素、氨苄青霉素、链霉素抗性)，于200rpm，37℃下振荡培养6h。加入IPTG进行诱导，培养6小时。

7.提取转化子的类胡萝卜素

(1)将24mL菌液于4℃，8000rpm下离心2min，弃上清。(2)用去离子水重新悬浮大肠杆菌细胞，4℃，8000rpm离心2min，弃上清。(3)重复步骤(2)。(4)加6mL丙酮至大肠杆菌沉淀，涡旋振荡分散。(5)55℃水浴20min，每隔5min振荡一次。(6)将混合物于4℃，8000rpm下离心20min，收集上清。(7)用丙酮定容至6mL，-20℃保存。

8.HPLC定性分析转化子的类胡萝卜素成分

(1)将流动相用0.22μm孔径滤膜进行抽滤处理，接着超声处理60min去除液体中的气泡。

(2)将类胡萝卜素提取物以及链孢红素标准品溶液，用0.2μm孔径的聚碳酸酯滤膜进行过滤处理。

(3)调节色谱柱(C30YMC carotenoid column,5μm,250*4.6mm)温度在25℃，以1.0mL/min的流速用甲醇冲洗至平衡(约2h)。

(4)改为用流动相甲基叔丁基醚(A相)/甲醇(B相)(梯度洗脱:0min，90％A相和10％B相；10min，60％A相和40％B相；20min 50％A相和50％B相；25min，10％A相和90％B相；29.5min，90％A相和10％B相)，以1mL/min的流速进行洗柱，直至平衡。

(5)链孢红素的标准曲线参照实施例1步骤8(5)。

(6)上样20μL，在波长473nm下检测40min。

结果如图4B所示，结果表明在18.2min左右出现了链孢红素的特征峰，这与标准品的出峰时间是一致的，另外根据该峰面积，结合得到的标准曲线方程：y＝63.124x-0.4755(x为峰面积，y为链孢红素的含量)，再根据细胞的干重，可以计算出链孢红素的产率为3.1mg/g(细胞干重)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 基于杜氏藻代谢途径的链孢红素高产工程菌及其构建方法与应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Psy

<400> 1

atgacgctgt caatgttgga cgcgcgaagg atggcacagc gaacagcaac ttcctcctcc 60

tcctctccta gcatcatata tgccccatcg cccataagca atcgcagcgg caggcgcgca 120

gcagcgaatc acggcatcag gaatggtagt cgcagagcag caggccggat gggactctgc 180

agcactgtgc aagtgaactg cacgctcgcg atgccccagc ccaaccacgg ccagaagatg 240

cgattgcagc agcagcagca gcaacaactg cagcagcagc agcaacagca actatcggga 300

aagcaggtgg aggagcaggc gatgctgcag tgcataaaga ccgctcagtc agtgcccccc 360

tccaccggac tcctcaatcc tcgcggcctg cgatggcagg gcagcagctt ggaagcagcg 420

tacgagcgat gtggggcggt gtgcagcgag tacgccaaga ccttctacct cggtactcag 480

ctcatgacac cagtgcaggc caggtgcatc tgggccatct atgtgtggtg ccgccgcaca 540

gatgagctgg tggatggccc caatgcatca aagatcacgc ctcaggccct agacagatgg 600

gaggagcgcc ttgaaagcat gttccaaggc aagccctatg atgtgctgga cgcggcgctc 660

acagacacca tctccaaatt ccctctggag gtgcaaccct tcagagacat gatcgagggc 720

atgcgaatgg acctcttcaa gtcgcggtat cacacctttg atgagctgta cgagtactgc 780

tatcgtgtgg cgggcacagt ggggctgatg accatgccag tgatggggat tgatcccaac 840

tacaagggtc caattgacaa ggtctacaag gccgcccttg cgctgggtac ggcaaaccag 900

ctcaccaaca ttctgcgaga tgtgggagag gacatcagag agcgtgaccg tatctacttg 960

cccctggatg agctcaagca gttcggcatc tccgaagagg aggtaaaagc aggtatccac 1020

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cggtggccag tgtggtcagc gctgatcctt taccgccaaa tcttggatgt cattgagaag 1200

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ttgccgatgg ccttgttccg ggccttggtg cccaagaaca aataa 1305

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Psy

<400> 2

Met Thr Leu Ser Met Leu Asp Ala Arg Arg Met Ala Gln Arg Thr Ala

1 5 10 15

Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ile Ile Tyr Ala Pro Ser Pro Ile

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Ser Asn Arg Ser Gly Arg Arg Ala Ala Ala Asn His Gly Ile Arg Asn

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Gly Ser Arg Arg Ala Ala Gly Arg Met Gly Leu Cys Ser Thr Val Gln

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Val Asn Cys Thr Leu Ala Met Pro Gln Pro Asn His Gly Gln Lys Met

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Gly Leu Arg Trp Gln Gly Ser Ser Leu Glu Ala Ala Tyr Glu Arg Cys

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Gly Ala Val Cys Ser Glu Tyr Ala Lys Thr Phe Tyr Leu Gly Thr Gln

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Leu Met Thr Pro Val Gln Ala Arg Cys Ile Trp Ala Ile Tyr Val Trp

165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

Ser Lys Phe Pro Leu Glu Val Gln Pro Phe Arg Asp Met Ile Glu Gly

225 230 235 240

Met Arg Met Asp Leu Phe Lys Ser Arg Tyr His Thr Phe Asp Glu Leu

245 250 255

Tyr Glu Tyr Cys Tyr Arg Val Ala Gly Thr Val Gly Leu Met Thr Met

260 265 270

Pro Val Met Gly Ile Asp Pro Asn Tyr Lys Gly Pro Ile Asp Lys Val

275 280 285

Tyr Lys Ala Ala Leu Ala Leu Gly Thr Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile

290 295 300

Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ile Arg Glu Arg Asp Arg Ile Tyr Leu

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Pro Leu Asp Glu Leu Lys Gln Phe Gly Ile Ser Glu Glu Glu Val Lys

325 330 335

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340 345 350

Ala Phe Met Lys Phe Gln Ile Lys Arg Ala Arg Glu Tyr Phe Gln Glu

355 360 365

Ala Glu Asp Gly Val Asp Tyr Leu Asp Val Lys Ala Arg Trp Pro Val

370 375 380

Trp Ser Ala Leu Ile Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Val Ile Glu Lys

385 390 395 400

Asn Asp Tyr Asp Asn Phe Ser Met Arg Ala Tyr Val Pro Lys Ser Lys

405 410 415

Lys Phe Ala Ser Leu Pro Met Ala Leu Phe Arg Ala Leu Val Pro Lys

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Asn Lys

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Ziso

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<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Ziso

<400> 4

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Leu Ser Gly Leu Gln Thr Ser Ser Lys Pro Leu Ile Ser Lys Ser Pro

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Leu Val Ala Arg Pro Pro Cys Ile Arg Ile Ser Glu Arg Cys Pro Val

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Leu Glu Asn Ser Val Trp Ser Arg Arg Arg Ala Glu Val Cys Val Arg

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Gly Glu Gln Leu Ile Gly Ala Arg Ala Tyr Arg Val Ile Phe Ala Leu

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180 185 190

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195 200 205

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Met Val Gly Gln Leu Ile Trp Cys Ala Ala His Thr Leu Trp Ile Gly

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Asn Ser Phe Met Leu Val Thr Ser Ala Gly Leu Met Ala His His Leu

275 280 285

Phe Gly Cys Trp His Gly Asp Arg Arg Leu Ser Ala Lys Tyr Gly Glu

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Ile Trp Glu Gly Arg Gln Val Leu Pro Ala Asp Tyr Tyr Lys Glu Phe

325 330 335

Leu Arg Ala Pro Tyr Phe Ala Val Thr Ala Phe Thr Leu Gly Ala Tyr

340 345 350

Phe Ala His Pro Ile Met Gln Ser Ala Ser Phe Tyr Leu Arg Trp

355 360 365

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Zds

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<211> 582

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Zds

<400> 6

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Leu Lys Asp Val Pro Leu Lys Ser Leu Tyr Pro Asp Glu Pro Ala Pro

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85 90 95

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Val Asp Ile Tyr Asp Gln Arg Ser Trp Val Gly Gly Lys Val Ala Ser

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Leu Glu Asn Leu Leu Val Lys Glu His Thr His Thr Phe Cys Asn Asn

165 170 175

Asp Gly Asp Val Arg Glu Leu Asp Phe Arg Phe Glu Val Gly Gly Gln

180 185 190

Lys Ile Gly Ala Pro Phe His Gly Leu Lys Ala Phe Phe Thr Thr Pro

195 200 205

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Val Arg Asn Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Asp Trp Phe Lys Ser His

245 250 255

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325 330 335

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580

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Ggps

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<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Ggps

<400> 8

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Pro Arg Ile Arg Pro Ala Asn Val Arg Gln Gly Arg His Gln Ala Phe

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Ser Phe Asp Phe Lys Ser Tyr Met Lys Glu Arg Ala Val Met Val Asn

65 70 75 80

Asp Ala Leu Asp Lys Ala Leu Pro Gln Arg Tyr Pro Glu Val Leu Leu

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Ser Pro Thr Asn His Lys Lys Tyr Gly Glu Asp Ile Ala Ile Leu Ala

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Gly Asp Ala Leu Leu Ser Phe Ala Phe Glu His Val Ala Arg Ala Thr

180 185 190

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<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Ziso

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gcccttgtca gcctgcccct ggccatcgtg gcggtggtgt atttcatcaa ccacagatat 600

gatggcatac ccttatggga tctcaggggt gtgacgggag tgcatgagct ggtgtggacc 660

ctcaacttca tttccttcta cttcctgtac ccgtccacct tcaacatcct tgaggtggct 720

gcagtggatg agcccaagct ccacatgtgg gaaaccggca tcatgcgaat cactcgtcac 780

ccacaaatgg tagggcaggc catctggtgt gcagcgcaca cgctgtggat cgggaacagc 840

ttcatgctgg tgacttcggc aggcctcatg gctcaccacc ttttcgggtg ctggcatggt 900

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<211> 373

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Ziso

<400> 10

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Val Ser Arg Ser Pro Ile Leu Ala Lys Thr Pro Pro Cys Ile Arg Asn

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Ala Gly Leu Val Gly Glu Asp Ala Ala Ala Phe Asp Val Ser Gln Gln

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180 185 190

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325 330 335

Asp Phe Tyr Lys Glu Phe Leu Arg Ala Pro Tyr Phe Ala Val Thr Ala

340 345 350

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370

<211> 1752

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Zds

<400> 11

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gccatcgctg cgccccctgc acctccaaag accacaccca aggagtggac cacccaggat 180

cttagcaagg tggccctgaa agacaggcct ctgaagtccc tgtacccgga tgagcccgcc 240

ccaccaaagc caggtgatcc caagctacgc gtggccatcg tgggcagtgg actggctgga 300

ctgtccacag cagtggagct gctagaccag gggcatgagg tggacatcta tgaccagcga 360

ccctttctag gaggcaaagt ggcttcatgg gtagacaagg atggcaacca catagagatg 420

ggcttgcatg tcttcttcgg gtgctaccac aaccttttcc gactgatggc caagtgcggt 480

gtactggaaa acttgctggt caaggatcac acccacacct tttgcaacgc tgatggggac 540

gtcagggagc ttgacttccg ctttgaagct ggaggacaga agattggggc cccattccat 600

ggcctgaaag ccttctttac cacccctcag ctcactgtgg ccgacaaggc acaaaatgca 660

ttggcactgg gcacgagccc tatcgtgcgc gccttgatag atcctgaggg gggtatgcaa 720

gatgtgagga acctagacaa cattagcttc tgggactggt tcaagagcca tggcggatca 780

gagctctcca tgaagcgtat gtgggacccc attgcctacg ctttgggctt cttggactgc 840

aaggacatca gtgcgcgctg catgttgaca atcttccaat tttttgccac caagaccgac 900

gcttctgtcc tccgcatgct taacggatct cctggggaga ggctgttgaa gcccatcgtt 960

aactacattg agtccaaggg tggccgcatc cacctgcgcc agggttgcaa ggaagtactc 1020

tacgaggatg gccctgacgg cacacctgtg gtgactggca tgcgcatggg ccgggatggc 1080

caaattgtga aagctgatgc ctatgtggct gccttggatg ttcctggggc caagcagctc 1140

ttaccgcagg cgtggaggaa gtaccctcaa tttgacaaca tctacagcct gattggcgtg 1200

cctgtgatca ccgttcagct gcgatacaat ggatgggtga ccgagatgca ggacccagag 1260

aaggtcaagc agctgaccca gccccaaggc atcaacaact tgctatacag ccctgatgcg 1320

ttctactcct gctttgctga cctcgctctt gtgagccctg tggagtactt caaggagggc 1380

caggggtcgc tcatgcaagt cgtgattaca ccagcggccc cctacatgcc atgggaaaac 1440

aaggccattg ctgaggaggc tgaccgccag acccgccggc tgttccccag cgcgcgcaac 1500

ttggacatga tctggcacag tgttgtgaag atcggccagt ccctgtacca ggaggcccca 1560

ggcatggacc ctttcaggcc tgagcaggcc acgcctgtgc ccaacttctt cttggcaggc 1620

agttacacca agcaagacta catcgactcc atggagggtg ccaccctgtc aggccgacaa 1680

tgtgctggcg aggtcgtgaa agccgtgccc cggatccaga gcctatcggt ggcgccactg 1740

gcaagcattt ga 1752

<211> 583

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Zds

<400> 12

Met Leu Gly Leu His Gly Lys Asp Ala Leu Gln Ala Gly Arg Thr Asn

1 5 10 15

Gln Gly Pro Pro Val Arg Thr Ser Phe Val Gln Ser Thr Arg Thr Arg

20 25 30

Arg Arg Thr Arg Cys Thr Thr His Ala Ile Ala Ala Pro Pro Ala Pro

35 40 45

Pro Lys Thr Thr Pro Lys Glu Trp Thr Thr Gln Asp Leu Ser Lys Val

50 55 60

Ala Leu Lys Asp Arg Pro Leu Lys Ser Leu Tyr Pro Asp Glu Pro Ala

65 70 75 80

Pro Pro Lys Pro Gly Asp Pro Lys Leu Arg Val Ala Ile Val Gly Ser

85 90 95

Gly Leu Ala Gly Leu Ser Thr Ala Val Glu Leu Leu Asp Gln Gly His

100 105 110

Glu Val Asp Ile Tyr Asp Gln Arg Pro Phe Leu Gly Gly Lys Val Ala

115 120 125

Ser Trp Val Asp Lys Asp Gly Asn His Ile Glu Met Gly Leu His Val

130 135 140

Phe Phe Gly Cys Tyr His Asn Leu Phe Arg Leu Met Ala Lys Cys Gly

145 150 155 160

Val Leu Glu Asn Leu Leu Val Lys Asp His Thr His Thr Phe Cys Asn

165 170 175

Ala Asp Gly Asp Val Arg Glu Leu Asp Phe Arg Phe Glu Ala Gly Gly

180 185 190

Gln Lys Ile Gly Ala Pro Phe His Gly Leu Lys Ala Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Pro Gln Leu Thr Val Ala Asp Lys Ala Gln Asn Ala Leu Ala Leu Gly

210 215 220

Thr Ser Pro Ile Val Arg Ala Leu Ile Asp Pro Glu Gly Gly Met Gln

225 230 235 240

Asp Val Arg Asn Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Asp Trp Phe Lys Ser

245 250 255

His Gly Gly Ser Glu Leu Ser Met Lys Arg Met Trp Asp Pro Ile Ala

260 265 270

Tyr Ala Leu Gly Phe Leu Asp Cys Lys Asp Ile Ser Ala Arg Cys Met

275 280 285

Leu Thr Ile Phe Gln Phe Phe Ala Thr Lys Thr Asp Ala Ser Val Leu

290 295 300

Arg Met Leu Asn Gly Ser Pro Gly Glu Arg Leu Leu Lys Pro Ile Val

305 310 315 320

Asn Tyr Ile Glu Ser Lys Gly Gly Arg Ile His Leu Arg Gln Gly Cys

325 330 335

Lys Glu Val Leu Tyr Glu Asp Gly Pro Asp Gly Thr Pro Val Val Thr

340 345 350

Gly Met Arg Met Gly Arg Asp Gly Gln Ile Val Lys Ala Asp Ala Tyr

355 360 365

Val Ala Ala Leu Asp Val Pro Gly Ala Lys Gln Leu Leu Pro Gln Ala

370 375 380

Trp Arg Lys Tyr Pro Gln Phe Asp Asn Ile Tyr Ser Leu Ile Gly Val

385 390 395 400

Pro Val Ile Thr Val Gln Leu Arg Tyr Asn Gly Trp Val Thr Glu Met

405 410 415

Gln Asp Pro Glu Lys Val Lys Gln Leu Thr Gln Pro Gln Gly Ile Asn

420 425 430

Asn Leu Leu Tyr Ser Pro Asp Ala Phe Tyr Ser Cys Phe Ala Asp Leu

435 440 445

Ala Leu Val Ser Pro Val Glu Tyr Phe Lys Glu Gly Gln Gly Ser Leu

450 455 460

Met Gln Val Val Ile Thr Pro Ala Ala Pro Tyr Met Pro Trp Glu Asn

465 470 475 480

Lys Ala Ile Ala Glu Glu Ala Asp Arg Gln Thr Arg Arg Leu Phe Pro

485 490 495

Ser Ala Arg Asn Leu Asp Met Ile Trp His Ser Val Val Lys Ile Gly

500 505 510

Gln Ser Leu Tyr Gln Glu Ala Pro Gly Met Asp Pro Phe Arg Pro Glu

515 520 525

Gln Ala Thr Pro Val Pro Asn Phe Phe Leu Ala Gly Ser Tyr Thr Lys

530 535 540

Gln Asp Tyr Ile Asp Ser Met Glu Gly Ala Thr Leu Ser Gly Arg Gln

545 550 555 560

Cys Ala Gly Glu Val Val Lys Ala Val Pro Arg Ile Gln Ser Leu Ser

565 570 575

Val Ala Pro Leu Ala Ser Ile

580

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tttaacttta ataaggagat ataccatggc cgcccatcaa atgca 45

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacttaagca ttatgcggcc gcaagcttct agttttggcg gtagc 45

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agttaagtat aagaaggaga tatacatatg acgctgtcaa tgttg 45

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtttctttac cagactcgag ttatttgttc ttgggcacca a 41

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttaactttaa taaggagata taccatgcag gttatgcagg gca 43

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acttaagcat tatgcggccg caagctttta gaaccaaggg aag 43

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agtataagaa ggagatatac atatgttggg gctgca 36

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcgatcgcgt ggccggccga tatcttacat gctcgga 37

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cacagccagg atccgaattc gatggcgagc ttgtgtagag ctg 43

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgcggccgc aagcttctac catctcaaat agaagctg 38

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tccgaattcg agctcggcga tggccgccca tcagatgc 38

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cggccgcaag cttgtcgatt agttttgacg gtagccaatg tac 43

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtataagaag gagatataca tatggcaatg accctgtcta tgctggacg 49

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atcgcgtggc cggccgattt acttgttctg gttctggggc 40

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tccgaattcg agctcggcga tgcagaccat gcagggcag 39

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cggccgcaag cttgtcgatt agaaccaagg gaaggtgact g 41

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gtataagaag gagatataca tatggcaatg ctgggactgc acggtaa 47

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atcgcgtggc cggccgattc aaatgcttgc cagtggcg 38

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tccgaattcg agctcggcga tggcaagctt gtgtgcagg 39

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttgtcgacct gcaggcgcgt caccacccca ggtagaagct 40