转基因絮凝微藻的构建及其制备方法
阅读说明：本技术 转基因絮凝微藻的构建及其制备方法 (Construction and preparation method of transgenic flocculation microalgae ) 是由 郭锁莲 邹蒙 张平 张硕硕 于 2019-01-02 设计创作，主要内容包括：转基因絮凝微藻的构建及其制备方法,涉及一种生物基因构建及其制备方法,具体而言,本发明涉及构建可诱导表达絮凝基因的表达载体,将其转入微藻中,获得转基因自絮凝微藻。本发明所获得的转基因藻表现出正常生长,而在收获期通过热诱导表现出自絮凝现状,利于微藻收集以及下游生物炼制的处理。本发明包括诱导型絮凝微藻的构建及其在微藻采收中的应用。本发明成功构建了微藻转化平台。通过本发明能够有效的将酵母絮凝基因<I>FLO1</I>重组到不同藻株中,并通过筛选获得基因突变藻株,实现了微藻转化基因工程技术的重点突破。(The invention relates to construction and a preparation method of transgenic flocculation microalgae, in particular to construction of an expression vector capable of inducing expression of a flocculation gene, and the expression vector is transferred into the microalgae to obtain the transgenic self-flocculation microalgae. The transgenic algae obtained by the invention shows normal growth, and shows self-flocculation status through heat induction in the harvest period, thereby being beneficial to microalgae collection and downstream biorefinery treatment. The invention comprises the construction of the induction type flocculation microalgae and the application thereof in microalgae recovery. The invention successfully constructs a microalgae transformation platform. By the invention canEfficient gene for flocculating yeast FLO1 Recombining the strain into different strains, and obtaining the gene mutation strain through screening, thereby realizing key breakthrough of the microalgae transformation gene engineering technology.)
技术领域
本发明涉及一种生物基因构建及其制备方法，特别是涉及一种转基因絮凝微藻的构建及其制备方法。
背景技术
微藻多为单细胞或简单多细胞的光合微生物，可以利用空气中的二氧化碳、工业废气中的二氧化碳或者碳酸盐来生产有机物，因此可用于食品、饲料及精细化学品的生产。随着世界经济的快速发展，能源的消耗和供应不足的矛盾日益突出，以石油为基础的化石燃料已经明显不能满足人类日益增长的能源需求，而且化石燃料的使用是全球温室效应中二氧化碳的主要来源，因此，寻求新型清洁能源的开发和利用对于缓解能源危机-保护环境以及经济的可持续发展具有重要的战略意义。而受技术和资源等因素的限制，核能、风能和太阳能等自然能源，还无法替代石油等传统化石能源。
生物柴油作为近年来再生能源的新生力量，因其热值接近石油，而且对环境友好（N、S含量低），发展迅速，在能源市场所占比例稳步提升，但是原料不足俨然已经成为国内外生物柴油大规模生产的瓶颈。目前主要以大豆、甘蔗以及玉米淀粉等油料作物为原料来炼制生物柴油，由于油料作物油脂面积产油率不高，生物柴油的大规模生产必然会导致这类可食用原料的大面积种植进而影响粮食生产。
同油料作物相比，微藻作为大力发展生物柴油的优质原料具有以下几个优点：（1）微藻生长速度快，多数藻类油脂含量高，多为低不饱和自然脂肪，如栅藻（Scenedesmussp.）油脂含量为20-21%（w/w），油脂产率为41-54（mg/l/天），小球藻（Chlorella sp.）油脂含量为19-22%（w/w），油脂产率在45（mg/l/天）左右；（2）同油料作物相比，微藻培养不需要占用耕地；（3）微藻拥有跟高等植物类似的CO2固定系统并将其转化成碳水化合物以及脂类，如甘油三酯（TGA）；（4）微藻能吸收工业生产等排放的二氧化碳同时释放氧气，对于降低温室效应维持环境稳定有重要作用。
除了能作为生物柴油的原料外，微藻本身还含有高附值产品。栅藻（Scenedesmussp.）和小球藻（Chlorella sp.）蛋白干重含量分别为50-56%、51-58%。微藻还可以用来发酵生产沼气，丙酮丁醇；从微藻体内提取纯化的ω-3脂肪酸是高价值的食品添加剂；有报道称小球藻内含有大量的色素，而藻株内的色素能作为药膏内的螯合剂以及溃疡和损伤组织的恢复起着重要作用，同时也是食品颜色的添加剂的天然原料；由于藻株本身含有蛋白等多种营养物质，可以作为鱼饵、家禽家畜饲料以及农作物的肥料等。
微藻不仅可以作为生物柴油炼制的优质原料，还是多种高附值产品的加工厂。但目前存在的问题是微藻生物柴油的生产成本过高。其中，微藻采收的成本占生产成本的比重很大，限制了微藻能源及精细化学品的工业化生产。
由于微藻自身特点，如大小约为5到50μm，并且细胞密度低，为15到108g/L，含水量很大，目前微藻采收的方法主要有气浮法，过滤法，离心法及化学絮凝法。气浮法耗能大成本高；过滤法依赖于藻细胞大小，不适用大规模微藻收集；而基于藻密度不同于培养液采用的离心法，沉淀中会含有大量水分，增加下游处理费用；虽然目前化学絮凝能达到较好的微藻收集效果，而且有些已经工业化，但是大量金属离子以及难降解高聚合物的添加无疑是对环境的二次污染；虽然有报道微生物絮凝剂在微藻采收中应用，但生物安全性未知。因此，开发微藻低成本采收方法是进行微藻生物炼制及大规模工业化生产微藻能源的重要保证。
某些微藻具有细胞自絮凝的能力，推测是在培养过程中，藻体合成分泌某种物质从而使自身沉降。同传统絮凝方法相比，微藻细胞的自絮凝无需外源物质加入，无能耗无污染，环境友好。微藻多以非絮凝种类为主，天然絮凝藻株并不多，通过基因工程的方法改造现有的非絮凝藻株让其表现出絮凝形状从而达到微藻收集的目的。利用微藻自絮凝进行微藻采收是有应用前途的微藻收集方法，目前鲜有关于将絮凝基因转入非絮凝微藻的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转基因絮凝微藻的构建及其制备方法，本发明成功构建了微藻转化平台。通过本发明能够有效的将酵母絮凝基因FLO1重组到不同藻株中，并通过筛选获得基因突变藻株，实现了微藻转化基因工程技术的重点突破。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
转基因絮凝微藻的构建，包括一种表达载体，所述表达载体含有来自酵母的絮凝基因，与所述絮凝基因操作性连接的、位于所述絮凝基因上游的诱导型启动子和筛选标记基因之间；所述絮凝基因选自：
（1）编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和
（2）在严格条件下与（1）所限定的核苷酸序列杂交且编码具有絮凝活性的蛋白质的核苷酸序列。
所述的转基因絮凝微藻的构建，所述载体含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、HSP70A启动子和氯霉素抗性基因。
所述的转基因絮凝微藻的构建，所述表达载体选自：
（1）SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和
（2）与SEQ ID NO:3具有至少80％序列相同性的核苷酸序列。
所述的转基因絮凝微藻的构建，所述转基因絮凝微藻的构建包括转基因自絮凝藻类细胞，所述细胞稳定转化了表达载体，并具有可诱导的自沉降性能。
所述的转基因絮凝微藻的构建，所述藻类细胞，藻选自栅藻。
所述的转基因絮凝微藻的构建，所述藻类细胞，藻类细胞为保藏编号为保藏号为CGMCC No. 5905小球藻藻细胞。
一种转基因絮凝微藻的制备方法，所述方法包括：
（1）将如上所述表达载体转入所述微藻；和
（2）筛选具备絮凝性能的微藻。
所述的一种转基因絮凝微藻的制备方法，所述方法包括：
(a) 收集对数生长期的微藻细胞，重悬在渗透缓冲液中；
(b) 热击(1)中获得的细胞热击，于冰上放置；
(c) 将(2)中处理后的细胞与权利要求1-4中任一项所述的表达载体和鲑鱼精DNA混合，并于冰上放置；
(d) 将细胞重悬，对其实施超声波介导法或电击法处理；和
(e) 将步骤（d）的细胞转入新鲜配制的DM培养基中暗培养，然后转入含有抗生素的DM液体培养基中培养，筛选获得所述转基因自絮凝微藻。
所述的转基因絮凝微藻的构建及其制备方法，一种转基因絮凝微藻的表达载体在制备转基因自絮凝藻类细胞中应用。
本发明的优点与效果是：
本发明成功构建了微藻转化平台。通过本发明能够有效的将酵母絮凝基因FLO1重组到不同藻株中，并通过筛选获得基因突变藻株。与现有的技术相比，本发明实现了微藻转化基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：
1．本发明证明了HSP70A启动子在栅藻中可启动外源基因的表达。
2．在筛选标记方面，本发明的实验证明淡水栅藻藻株对氯霉素敏感，采用一种可行的选择标记基因和报告基因组合是本发明的一技术特点。
3．本发明构建了酵母絮凝基因的微藻表达载体pSLG06，并实现了外源基因在栅藻和小球藻中的稳定表达。
附图说明
图1显示表达载体构建的示意图；
图2显示克隆获得酵母絮凝基因FLO1；
图3显示抗生素筛选转化子；
其中，1：野生型栅藻细胞；2：转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子；3：转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子。
图4显示扫描电镜观察栅藻细胞表型变化；
1,4：野生型栅藻细胞；2,5：转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子；3,6：转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子。
图5显示荧光电镜观察栅藻表型变化；
其中，左：野生型栅藻细胞；中：转入pCAMBIA 1302- HSP的转化子；右：转入pCAMBIA1302- HSP -FLO1的转化子。
图6显示PCR 和 RT-PCR 分析酵母絮凝基因FLO1在转基因栅藻细胞中的表达。
其中，左图为PCR分析酵母絮凝基因 FLO1在转基因栅藻细胞中表达情况；右图为RT-PCR酵母絮凝基因 FLO1在转基因栅藻细胞中表达情况。图中，M：1kb ladder marker(TaKaRa Bio Inc., Japan)；W：野生型栅藻细胞；T, T1转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的栅藻细胞；C：转入pCAMBIA 1302-HSP的栅藻细胞；P：质粒pCAMBIA 1302-HSP-FLO1。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
本发明的目的是建立微藻改造平台及其在微藻采收中的应用。
本发明首先将酵母絮凝基因FLO1重组到诱导型启动子和报告基因gfp基因之间，然后***含有选择标记基因的质粒中，构建转化用的载体，通过电转的方法转质粒入示例性的非絮凝淡水小球藻，经过抗生素筛选和荧光检测，获得阳性转化子。
本发明所获得的转基因藻表现出正常生长，而在收获期通过热诱导表现出自絮凝现状，利于微藻收集以及下游生物炼制的处理。本发明建立的转化平台转化效率高，适用于不同藻株，而且所获得的基因工程藻株具有遗传稳定性。
因此，本发明第一方面提供一种诱导型的表达载体，所述表达载体含有来自酵母的絮凝基因，与所述絮凝基因操作性连接的、位于所述絮凝基因上游的诱导型启动子和抗性筛选标记基因。
在一个具体实施例中，所述来自酵母的絮凝基因是酵母絮凝基因FLO1、FLO5、FLO9或FLO10。在一个具体实施例中，所述酵母絮凝基因如CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1所示。
在一个具体实施例中，所述絮凝基因选自：
（1）编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和
（2）在严格条件下与（1）所限定的核苷酸序列杂交且编码具有絮凝活性的蛋白质的核苷酸序列。
在一个具体实施例中，所述载体含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、HSP70A启动子和氯霉素抗性基因。
在一个具体实施例中，所述表达载体选自：
（1）SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和
（2）与SEQ ID NO:3具有至少80％序列相同性的核苷酸序列。
本发明第二方面提供一种转基因自絮凝藻类细胞，所述细胞稳定转化了本发明所述的表达载体，并具有自沉降性能。
在一个具体实施例中，所述藻选自小球藻。
在一个具体实施例中，所述藻类细胞为保藏编号为CGMCC No. 5905的淡水小球藻细胞。
本发明第三方面提供一种制备转基因自絮凝微藻的方法，所述方法包括：
（1）将本发明所述的表达载体转入所述微藻；和
（2）筛选具备絮凝性能的微藻。
在一个具体实施例中，本发明制备转基因自絮凝微藻的包括：
(a) 收集对数生长期的微藻细胞，重悬在渗透缓冲液中；
(b) 热击(1)中获得的细胞热击，于冰上放置；
(c) 将(2)中处理后的细胞与本发明所述的表达载体和鲑鱼精DNA（否）混合，并于冰上放置；
(d) 将细胞重悬，对其实施超声波介导法或电击法处理；和
(e) 将步骤（d）的细胞转入新鲜配制的DM培养基中暗培养，然后转入含有抗生素的DM液体培养基中培养，筛选获得所述转基因自絮凝微藻。
本发明第四方面提供本发明所述表达载体在制备转基因自絮凝藻类细胞中的应用。
本发明的絮凝基因包括酵母絮凝基因FLO1（SEQ ID NO:1）、FLO5、FLO9和FLO10。在一个具体实施例中，所述酵母絮凝基因如CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1所示。在一具体实施例中，本发明的絮凝基因编码本申请SEQ ID NO:2或CN 200910200097.X的SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。
本发明包括与本发明絮凝基因高度同源的核苷酸序列，或在严格条件下与本发明絮凝基因杂交的核苷酸序列。提到核苷酸序列时，本文所用的“高度同源”可以指与所提及序列的相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。本发明的核苷酸序列可以是本发明絮凝基因（例如本发明的SEQ ID NO：1和CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1）的简并变异体。如本文所用，“简并变异体”在本发明中是指编码包含本发明SEQ ID NO：2或CN 200910200097.X的SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但与本发明SEQ ID NO：1或CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。
在相同性分析中可辅助使用易于获得的计算机程序，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff编辑，5 Suppl.，3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC)，它适用于Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl. Math.，2：482-489，1981)。可从Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版，从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)获得测定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。使用制造者建议的和上述Wisconsin Sequence AnalysisPackage所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可使用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定的核苷酸序列与参比序列的同源性百分数。
本发明还涉及本发明絮凝基因（如本发明SEQ ID NO:1或CN 200910200097.X的SEQ ID NO:1）的变异体，其编码与本发明SEQ ID NO：2或CN 200910200097.X的SEQ ID NO:2有相同的氨基酸序列的絮凝基因的片段、类似物、衍生物和变异形式。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明脂肪酶的多核苷酸。
本发明还包括与本发明絮凝基因对应的RNA序列，和在严格条件下与本发明絮凝基因或所述RNA序列杂交的分子。
如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列，或者可以是与(a)中所限定序列的互补性为至少50%、优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上的序列。
“编码序列”或“编码”选定多肽的序列，是指当处于适当的调节序列的控制下时，一种核酸分子在体外或体内被转录(对于DNA)和翻译(对于mRNA)成一种多肽。该编码序列的界限可由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。转录终止序列可以位于该编码序列的3'端。
“可操作性连接”指元件的排列，其中所述成分被排成一定的形状，以便执行它们所需的功能。因而，可操作性连接于编码序列的给定的启动子，在正确的转录因子等存在时，能使该编码序列有效表达。该启动子不需要与该编码序列邻接，只要它起到指导该序列表达的功能即可。因此，例如不参与翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，与可转录的内含子一样；并且仍可认为该启动子序列“可操作性连接”于该编码序列。
本发明的载体除含有编码序列外，还可含有各种控制元件。“控制元件”指帮助与其连接的编码序列表达的多核苷酸序列。该术语包括启动子、转录终止序列、上游调节结构域、聚腺苷酸化信号、非翻译区域(包括5'-UTR和3'-UTR)，适当时还有前导序列和增强子，这些序列共同地为宿主细胞中的编码序列的转录和翻译创造条件。
“启动子”在本文中指能结合宿主细胞中的RNA聚合酶并启动与之操作性连接的下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调节区域。用于本发明的启动子序列包括以高于背景值的可检测的水平启动感兴趣的基因的转录所需的最小数量的碱基或元件。在该启动子序列中有转录启始位点以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核细胞启动子常常(但不总是)含有“TATA”框和“CAT”框。本发明使用的表达载体的启动子可为HSP，它的使用使目的基因在微藻中可诱导表达。
控制序列在RNA聚合酶结合启动子序列时“指导转录”细胞中的编码序列，并将该编码序列转录成mRNA，之后该mRNA被翻译成由该编码序列编码的多肽。
本文中，“表达盒”或“表达构建物”指能指导感兴趣的序列或基因的表达的装配。该表达盒包括上述控制元件，如操作性连接于感兴趣的序列或基因(以指导其转录)的启动子，该表达盒还常常包括多腺苷酸化序列。在本发明的某些实施例中，在此所述的表达盒可被包含在本发明的表达载体（即质粒构建物）中。除了该表达盒的组分外，该质粒构建物还含有一种或多种可选择的标记物、使该质粒构建物以单链DNA(如M13复制源)存在的信号、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制源(如SV40或腺病毒复制源)。
“转化”在本文中指将外源多核苷酸（例如本发明所述的表达载体）***宿主细胞中。可用本领域熟知的各种基因送递的方法，将包含感兴趣的核苷酸序列的核酸分子稳定地整合入宿主细胞基因组中或在合适的宿主细胞中的稳定的附加型元件上维持。参见如美国专利No.5,399,346。表达载体导入受体微藻细胞的方法可包括电击法、超声法等方法。
“宿主细胞”是已被转化的细胞，或者能被外源DNA序列转化的细胞。各种藻类细胞可用于本发明，包括但不限于微藻类，如绿藻门小球藻属中的蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa），普通小球藻（Chlorella vulgaris），椭圆小球藻（Chlorellaellipsoidea），Chlorella emersonii，Chlorella sorokiniana，Chlorellasaccharophila，Chlorella regularis，Chlorella minutissima，Chlorellaprotothecoides，Chlorella zofingiensis，以及绿藻门中的Brachiomonassubmarina，Chlamydobonasreinhardtii，Chlamydomonasacidophila，Haematococcuspluvialis，Haematococcuslacustris，Scenedesmusobliquus，Spongiococcum exetriccium，Tetraselmis suecica，Tetraselmis chuii，Tetraselmis tetrathele，Tetraselmisverrucosa， Micractinium pusillum；硅藻门的Cylindrotheca fusiformis，Nitzschialaevis，Nitzschia alba，Nitzschia fonticola，Navicula incerta，Naviculapelliculosa；蓝藻门的Anabaena variabilis；金藻门的Poterioochromonasmalhamensis；甲藻门的Amphidinium carterae，Crypthecodinium cohnii；裸藻门的Euglena gricilis；和红藻门的Galdieria sulphuraria。适用于本发明的微生物还包括被孢霉属（Mortierella），破囊壶菌属（Thraustochytrium），裂殖壶菌属（网粘菌纲）（Schizochytrium（Labyrinthulomycetes）），吾肯氏壶藻属（Ulkenia）等。本发明特别优选的是栅藻（Scenedesmus sp.）和小球藻（Chlorella sp.）。
本发明中，一旦制备或分离了编码序列，就可将这些序列克隆入任何合适的载体或复制子中。对本领域技术人员而言，各种克隆载体是已知的，且适当的克隆载体的筛选只是选择问题。合适的载体包括(但并非限制于)：质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或当与适当的控制元件结合时能复制的病毒。
然后将克隆序列置于合适的控制元件的控制下，这取决于用于表达的系统。因此，可以将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选地操纵子的控制下，从而由合适的转化体将感兴趣的DNA序列转录到RNA中。该编码序列可以包含或不包含信号肽或前导序列(随后可由宿主在翻译后加工除去)。
除了控制序列外，可以添加调节序列，从而可以相对于宿主细胞的生长调节序列的表达。调节序列是本领域技术人员已知的，其实例包括那些能导致应答化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)启动或关闭基因表达的调节序列。载体中还可存在其它类型的调节元件。例如，可以使用增强子元件以增加构建物的表达水平。实例包括SV40早期基因增强子(Dijkema等(1985)EMBO J.4:761)；从Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)衍生的增强子/启动子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777)；和从人CMV衍生的元件(Boshart等，(1985)Cell 41:521)，如CMV内含子A序列中包括的元件(美国专利No.5,688,688)。表达盒中还可包括在合适的宿主细胞中自主复制的复制起点、一种或多种可选择的标记物、一个或多个限制酶切位点、高拷贝数量的势能和强启动子。
构建表达载体，使具体的编码序列位于该具有适合调节序列的载体中，与控制序列有关的编码序列的位置和取向使编码序列在控制序列的“控制”下转录(即，结合于控制序列中DNA分子的RNA聚合酶转录该编码序列)。可能需要对编码感兴趣分子的序列进行修饰来实现此目的。例如，在一些情况中可能需要修饰该序列，从而使其连接于适合取向的控制序列，即维持读框。在***到载体之前，控制序列和其它调节序列可能连接于编码序列。或者，可以将编码序列直接克隆入已包含控制序列和合适的限制酶切位点的表达载体中。
在其它实施例中，适用于本发明的酵母菌的絮凝基因可包括FLO1（SEQ ID NO：1）、FLO5、FLO9、FLO10（ZhaoXQ, Li Q, He LY, Li F, Que WW, Bai F, Exploration of anatural reservoir of flocculating genes from various Saccharomyces cerevisiaestrains and improved ethanol fermentation using stable genetically engineeredflocculating yeast strains, Process Biochemistry, 2011.in press, FranziskaHeine, Frank Stahl, Heike Str äuber, Claudia Wiacek, Dirk Benndorf, CorneliaRepenning, Frank Schmidt, Thomas Scheper, Martin von Bergen, Hauke Harms,Susann Müller. Prediction of flocculation ability of brewing yeast inoculatesby flow cytometry, proteome analysis, and mRNA profiling. Cytometry Part A2009.75A: 140-147.）等基因或者序列相似的功能基因，例如，如前文所述具有一定序列相同性或在严格条件下与这些絮凝基因杂交的核苷酸序列，这些基因编码可糖基化的絮凝蛋白。可用这些絮凝基因来构建本发明的表达载体，然后转入藻类细胞中，筛选得到稳定表达絮凝蛋白、具有絮凝性能的藻类细胞。
因此，本申请提供一种获得转基因自絮凝微藻的方法，该方法包括：（1）从絮凝酵母克隆絮凝基因，并用所述絮凝基因构建表达载体；和（2）将表达载体（通过例如电击处理）转化入微藻细胞中；从而可获得转基因自絮凝微藻。
进一步的，本发明的方法还可包括：（3）复苏和确认转基因絮凝微藻；和任选的，（4）采收转基因絮凝微藻的细胞。
絮凝基因的克隆包括从酵母菌或者其他生物细胞中扩增具有细胞自絮凝功能的絮凝基因，本发明以从絮凝酵母中克隆的FLO1基因为例进行絮凝基因表达载体的构建（具体可参见CN 200910200097.X，本文以引用的方式将该文纳入本文）。
表达载体可包括pCAMBIA1301等植物基因工程表达载体，以及其他可在微藻中使用的表达载体，表达载体的必要遗传学元件包括启动子，抗性基因，多克隆位点等。本发明使用的为含有以pCAMBIA1301为基础改造的含有HSP 诱导型启动子，GFP报告基因，氯霉素抗性基因CAT的表达载体。
表达载体导入受体微藻细胞的方法可包括电击法、超声法等方法。本发明提供一种微藻（例如小球藻）的遗传转化方法或转基因自絮凝微藻的制备方法，具体步骤包括：
(a) 收集对数生长期的微藻细胞，重悬在渗透缓冲液中；
(b) 热击(1)中获得的细胞热击，于冰上放置；
(c) 将(2)中处理后的细胞与本发明所述的表达载体和鲑鱼精DNA（否）混合，并于冰上放置；
(d) 将细胞重悬，对其实施超声波介导法或电击法处理；和
(e) 将步骤（d）的细胞转入新鲜配制的DM培养基中暗培养，然后转入含有抗生素的DM液体培养基中培养，筛选获得所述转基因自絮凝微藻。
本发明使用的渗透缓冲液可以是本领域常用的渗透缓冲液。示例性的渗透缓冲液含有例如0.2M-0.3M的甘露醇，0.2M-0.3M的山梨醇和10-15%甘油。通常以大约107-108个细胞每毫升的细胞密度重悬微藻细胞。
热击通常在例如38-45℃的温度下进行。在一具体实施例中，在42℃进行热击。热击时间通常控制在大约1-10分钟左右。热击后于冰上放置数分钟（例如3-8分钟，例如5分钟）。
然后，将冰上放置数分钟的细胞与本发明的表达载体和鲑鱼精DNA混合。混合的量可根据实际情况选择。在一具体实施例中，将大约400微升的细胞溶液与大约10μg/mL的本发明表达载体以及大约25μg/mL的鲑鱼精DNA混合，混合后通常置于冰上数分钟（例如3-8分钟，例如5分钟）。
然后，将细胞重悬，对其实施电击法处理。对于电击处理，可吸取适量（例如0.4-1mL）重悬的细胞放入预冷电击小杯中，按照设置的各种条件组合进行电击.在其它条件不变的情况下，分别梯度改变高渗缓冲液浓度、表达载体、脉冲电压和脉冲持续时间这4个参数，对电击参数进行优化。一种优化的电击转换条件为：表达载体浓度50g/mL，高渗缓冲液浓度0.2 mol/L，脉冲距离为2 mm，脉冲电压为2 Kv，脉冲持续时间为3ms。
电击法处理后，将细胞转入适量（例如10-30 毫升）新鲜配制的DM培养基中，在25℃下进行暗培养，培养时间大约18-36（例如24小时）小时，然后转入含有抗生素例如（50 μg/mL氯霉素）的DM液体培养基中。
示例性的中DM培养基的成分为(克/升)：Ca(NO3)2•4H2O, 1.00; KH2PO4, 0.26;MgSO4•7H2O, 0.55; KCl, 0.25; FeSO4•7H2O, 0.02; EDTA•2Na, 0.2; H3BO3, 0.0029;ZnCl2, 0.00011; MnCl2•4H2O, 0.00181; (NH4)6Mo7O24•4H2O, 0.000018; CuSO4•5H2O,0.00008。
转基因絮凝微藻的复苏和确认包括将转化后的微藻涂布在含有氯霉素的平板上，调取单克隆，在含有氯霉素的液体培养基中培养7-14天，此时细胞为绿白色，然后转入不含有抗生素的液体培养基中继续培养7-14天，细胞生长状态可逐渐转变成活跃，细胞转绿，并可观察到絮凝性状，此时再更换培养基，转化子的絮凝性状逐渐增强，可明显观察到絮凝细胞团（可见图4）。由于报告基因可监测转化效率，在荧光显微镜下可观察到，含有绿色荧光蛋白的空载体在栅藻细胞中发出绿色荧光，证明转化成功，此外，可观察到絮凝细胞团内的绿色荧光（图6），证明酵母菌絮凝基因的表达。
微藻的自絮凝采收包括将含有自絮凝基因的微藻细胞，在45℃处理30min细胞聚集成团迅速自沉降，而对照游离藻种在同样的处理条件下没有出现自沉降现象，因此证明构建获得诱导表达的转基因絮凝藻，可通过细胞自沉降采收，方便而简单。
实施例1：絮凝基因的克隆和表达载体的构建
（1）目的基因克隆（可参见CN 200910200097.X中实施例1和3的方法）
根据实验室絮凝酵母SPSC01的絮凝基因 FLO1序列设计引物：
Infusion3_F: GGACTCTTGACCATGGATGACAATGCCTCATCGCTATATG（SEQ ID NO:4）；和
Infusion3_R: CTCACATCTACCATGGTTAAATAATTGCCAGCAATAAGGAC（SEQ ID NO:5）。
PCR反应程序如下: 95℃变性5 min, 95℃变性30, 55℃退火30 s, 72°C延伸5min，10 个循环, 随后进行20个如下的循环95°C变性30 s, 60℃退火30 s72℃延伸5min, 最后 72℃延伸10 min,用的是全式金的 Taq High Fidelity (HiFi) PCRSuperMix Ⅱ(TransGenBiotech, Beijing, China)。如图3所示克隆获得5.2 Kb酵母絮凝基因FLO1（SEQ ID NO:1）。
（2）表达载体的构建
本研究采用植物中广泛应用的表达载体pCAMBIA1302作为载体骨架，其基因序列中含有强启动子HSP70A及报告基因gfp，在原核生物中的筛选标记卡那抗性基因，真核中的筛选标记潮霉素抗性基因。经过小球藻的敏感性测试，发现其对氯霉素敏感，因此通过Infusion方法将pCAMBIA1302载体上潮霉素抗性基因替换成氯霉素抗性基因，随后又将酵母的絮凝基因连接到载体强启动子HSP70A下游，报告基因gfp上游，具体流程如图1所示。
实施例2：表达载体通过电击处理转化入微藻细胞
目前应用于微藻转化方法有激光微束穿孔法、电击法、基因枪法、农杆菌侵染法、微玻璃珠研磨法等，本研究分别使用了超声波介导法和电击法对微藻进行了转化。
电击法转化栅藻
I.受体材料的准备
取培养到指数期的非絮凝小球藻培养液150 mL，5000 rpm离心10 min，收集藻细胞。用预冷的高渗缓冲液(0.2 mo1/L甘露醇，0.2 mo1/L山梨醇，10%甘油)洗藻体3次，最后一次冰上放置1 h，5000 rpm离心10 min，收集藻细胞，加电击缓冲液调细胞数至108个/ml，42℃热击10 min,冰浴5 min后，加入终浓度为50 g/mL的实施例1所构建的表达载体与25μg/mL的鲑精DNA混合均匀，冰上放置5-10 min，待超声或电击处理。
II.电击处理
吸取0.4 mL混合好的培养细胞放入预冷电击小杯中，按照设置的各种条件组合进行电击，每种处理重复三次。
电击参数的优化实验：在其它条件不变的情况下，分别梯度改变高渗缓冲液浓度、表达载体、脉冲电压和脉冲持续时间这4个参数。
优化后，电击转化条件的各种处理组合为：实施例1制备的表达载体浓度50 g/mL，高渗缓冲液浓度0.2 mol/L，脉冲距离为2 mm，脉冲电压为2 Kv，脉冲持续时间为3 ms。
实施例3：转基因微藻的复苏和确认
(1) 转基因微藻的复苏
转化完毕，用培养液清洗两次，取0.4 mL混合细胞吸入内含新鲜液体培养基的锥形瓶中，其中一瓶置于适宜条件下连续光照培养18-24 h，另一瓶置于适宜条件下黑暗培养18-24 h。
(2) 转基因絮凝微藻的筛选
b1将复苏培养的部分藻液转入含适合浓度抗生素的新鲜液体培养基中，另取少量藻液离心后涂布于含适合浓度的抗生素的固体培养基；一个月后挑取第一次在抗性平板上长出的转化子藻落，转接于含有适合浓度的液体培养基扩增培养后，接种于无抗生素的固体培养基上，每过一个月挑取单克隆，把单克隆的一半在无抗生素的液体培养基中扩大培养，另一半接种于无抗生素的固体培养基上，筛选稳定的转基因微藻。
从图4中可以看出野生型的小球藻不能在含有抗生素的培养基中生长，转基因栅藻可以在含有抗生素的培养基正常生长；转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子培养14天在45℃处理出现了细胞絮凝性状，而转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子同样条件下处理并没有此现象，说明酵母絮凝基因FLO1在pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子中表达，并引起絮凝这一现象产生。
（3）转基因絮凝微藻的确认
扫描电镜观察转基因絮凝微藻的表型变化
从图4中可以看出培养14天在45℃热处理30min,野生型的栅藻和转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子藻细胞呈分散状态存在，而转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子细胞聚集在一起形成一个较大颗粒与肉眼可见的细胞絮凝性状相一致，从放大倍数较大的图片中可以看出，在细胞表面有层物质，推测这种物质与细胞絮凝性状有关。
利用荧光显微镜进行观察，培养14天45℃热处理30min的藻株，在蓝光激发下，野生型未转化的藻细胞由于自身叶绿体的荧光呈红色；转基因微藻由于报告基因gfp的表达呈绿色，图5中3的现象是由于未转化的藻细胞粘附在成功表达絮凝基因的转化子上，这种现象与宏观肉眼看到的以及扫描电镜观察到的结果完全一致，进一步证明了絮凝基因的表达。
在六个月的培养过程中，每两周进行无抗培养，进而得到稳定的转化子。提取野生型栅藻细胞、转基因藻细胞的DNA和RNA，进行PCR及RT-PCR分析。得到的结果如图6所示，在PCR和RT-PCR的电泳图中，转入pCAMBIA1302-HSP-FLO1的转化子有和质粒pCAMBIA 1302-HSP-FLO1同样大小的电泳条带。结果表明酵母基因FLO1只在转入pCAMBIA 1302-HSP-FLO1的转化子有表达，而野生型藻细胞和转入pCAMBIA 1302-HSP的转化子没有表达。
序列表
<110> 沈阳化工大学
<120> 转基因絮凝微藻的构建及其制备方法
<130> 123
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5217
<212> DNA
<213> 絮凝酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
atgacaatgc ctcatcgcta tatgtttttg gcagtcttta cacttctggc actaattaat 60
gtggcctcag gagccacaga ggcgtgctta ccagcaggcc agaggaaaag tgggatgaat 120
ataaattttt accagtattc attgaaagat tcctccacat attcgaatgc agcatatatg 180
gcttatggat atgcctcaaa aactaaacta ggttctgtcg gaggacaaac tgatatctcg 240
attgattata atattccttg tgttagttca tcaggcacat ttccttgtcc tcaagaagat 300
tcctatggaa actggggatg caaaggaatg ggtgcttgtt ctaatagtca aggaattgca 360
tactggagta ctgatttatt tggtttctat actaccccaa caaacgtaac cctggaaatg 420
acaggttatt ttttaccacc acagacgggt tcttacacat tcaagtttgc tacagttgac 480
gactctgcaa ttctatcagt aggtggtgct accgcgttcg actgttgtgc tcaacagcaa 540
ccgccgatca catccacaaa ctttacgatt aacggtatca aaccatgggg tggaagtttg 600
ccacctaatg ttgaaggaac agtctacatg tatgctggat tctactaccc aatgaaggtt 660
gtttactcaa atgctgtttc ttggggtaca cttccaatta gtgtgacact gcctgatggt 720
acagctgtca gtgatgactt cgagggatac gtgtattcct ttgatgatga tttgactcaa 780
tctgattgta ccattccaga tccttcaaac tatactatag caggcctaat caccaccacc 840
actgaaccat ggactggtac tttcacttct acatccactg agatgactac tgtcactggt 900
accaacagtc aaccaactga tgaaaccgtt attgttatca gaactccaac tagtgagggt 960
ttgattacaa ccaccactga accatggact ggcactttca cttctacatc tactgagatg 1020
accaccgtca ccggtaccaa cggtcaacca actgacgaaa ccgtgattgt tatcagaact 1080
ccaactagtg agggtttgat tacaaccacc actgaaccat ggactggtac tttcacttct 1140
acatctactg agatgaccac cgtcaccggt actaacagtc aaccaactga tgaaaccgtt 1200
attgttatca gaactccaac tagtgagggt ttgattacaa ccaccactga accatggact 1260
ggcactttca cttctacatc tactgagatg accaccgtca ccggtactaa cggtcaacca 1320
actgacgaaa ccgtgattgt tatcagaact ccaaccagtg aaggtttgat tacaaccacc 1380
actgaagcat ggactggtac tttcacttct acatctactg agatgaccac cgtcaccggt 1440
accaacggtc aaccaactga cgaaaccgtt attgttatca gaactccaac tagtgagggt 1500
ttgattacaa ccaccactga accatggact ggtactttca cctctacgtc tactgagatg 1560
accaccgtca ccggtactaa cggtcaacca actgatgaaa ccgttattgt tatcagaact 1620
ccaaccagtg aaggtctaat cagcaccacc actgaaccat ggactggcac tttcacttct 1680
acatctactg agatgaccac cgtcaccggt accaacggtc aaccaactga tgaaaccgtg 1740
attgttatca gaactccaac cagtgaaggt ttgattacaa ccaccactga accatggaat 1800
ggcactttca cttcgacttc cactgaggtt accaccatca ctggaaccaa cggtcaacca 1860
actgacgaaa ctgtgattgt cattagaact ccaactagtg agggtttgat tactacaact 1920
accgaaccat ggactggtac tttcacttct acatctactg aggttaccac cgtcaccggt 1980
actaatggtc aaccaactga cgaaaccgtt attgttatca gaactccaac tagtgagggt 2040
ttgattacaa ccgccactga accatggact ggtactttca cttctacatc tactgagatg 2100
accaccgtca ccggtactaa cggtcaacca actgatgaaa ccgttattgt tatcagaact 2160
ccaaccagtg aaggtttgat tacaaccacc actgaaccat ggaatggcac tttcacttcg 2220
acttccactg aggttaccac catcactgga accaacggtc aaccaactga cgaaactgtg 2280
attgtcatta gaactccaac tagtgagggt ttgattacta caactaccga accatggact 2340
ggtactttca cttctacatc tactgaggtt accaccgtca ccggtaccaa cggtcaacca 2400
actgacgaaa ccgttattgt tatcagaact ccaactagtg agggtttgat tacaaccacc 2460
accgaaccat ggactggcac tttcacttcg acttccactg agatgaccac catcaccggt 2520
accaacggtc aaccaactga cgaaactgtg attgtcatta gaactccaac tagtgagggt 2580
ttgattacaa ccaccactga accatggact ggtactttca cttctacatc tactgaggtt 2640
accaccgtca ccggtaccaa cggtcaacca actgacgaaa ccgttattgt tatcagaact 2700
ccaactagtg agggtttgat tacaaccacc actgaaccat ggactggcac tttcacttct 2760
acatctactg agatgaccac cgtcaccggt actaacggtc aaccaactga tgaaactgtg 2820
attgttatca gaactccaac cagtgaaggt ttggttacaa ccaccactga accatggaat 2880
ggtactttca cttctacatc tactgagatg accaccgtca ccggtaccaa cggtcaacca 2940
actgacgaaa ccgtgattgt tatcagaact ccaaccagtg aaggtttggt tgcaaccacc 3000
actgaaccat gggctggcac tttcacctct acatccactg agatgaccac cgtcaccggt 3060
actaacggtc aaccaactga cgaaaccgtg attgttatca gaactccaac cagtgaaggt 3120
ttggttgcaa ccaccactga accatggact ggcactttca cctctacatc cactgagatg 3180
accaccgtca ccggtactaa cggtcaacca actgacgaaa ccgtgattgt tatcagaact 3240
ccaaccagtg aaggtttggt tgcaaccacc actgaaccat ggactggcac tttcacctct 3300
acatccactg agatgaccac catcaccggt actaatggtc aaccaactga cgaaaccgtt 3360
attgttatca gaactccaac tagtgagggt ttgattacaa ccaccaccga accatggact 3420
ggcactttca cttcgacttc cactgagatg accaccatca ccggtaccaa cggtcaacca 3480
actgacgaag ctgtgattgt cattagaact ccaactagtg agggtttggt tactacaact 3540
accgaaccat ggactggtac tttcacttcg acttccactg ggatgaccac cgtcaccggt 3600
actaacggtc aaccaactga cgaaaccgtg attgttatca gaactccaac cagtgaaggt 3660
ttggttacaa ccaccactga accatggact ggtactttta cttcgacttc cactgaaatg 3720
tctactgtca ctggaaccaa tggcttgcca actgatgaaa ctgtcattgt tgtcaaaact 3780
ccaactactg ccatctcatc cagtttgtca tcatcatctt caggacaaat caccagctct 3840
atcacgtctt cgcgtccaat tattacccca ttctatccta gcaatggaac ttctgtgatt 3900
tcttcctcag taatttcttc ctcagtcact tcttctctag tcacttcatc tccagtcatt 3960
tcttcttcat tcatttcttc ctctgtcatt tcttcctcta caacaacctc cgcttctata 4020
ttctctgaat catctaaatc atccgtcatt ccaaccagta gttccacctc tggttcttct 4080
gagagcgaaa cgagttcagc tagttctgcc tcttcttcct cttctatctc ttctgaatca 4140
ccaaagtcta catattcgtc ttcatcatta ccacctgtta ccagtgcaac aacaagtcag 4200
gaaattactt cttccttacc acctgttacc agtgcgacag caagccagga aactgcttct 4260
tcattaccac ctgctaccac tacaaaaacg agcgaacaaa ccactttggt taccgtgaca 4320
tcctgcgaat ctcatgtgtg cactgaatcc atctcctctg cgattgtttc cacggccacc 4380
gttactgtta gcggcgtcac aacagagtat accacatggt gccctatttc taccacagag 4440
acaacaagac aaaccaaagg gacaacagag caaaccacag aaacaacaaa acaaaccacg 4500
gtagttacaa tttcttcttg tgaatctgac atatgctcta aaactgcttc tccagccatt 4560
gtgtctacaa gcactgctac tattaacggc gttaccacgg aatacacaac atggtgtcct 4620
atttccacca cagaatcgaa gcaacaaact acgctagtta ctgttacttc ctgcgaatct 4680
ggtgtgtgtt ccgaaactgc ttcacctgcc attgtttcga cggccacggc tactgtgaat 4740
gatgttgtta cggtctatcc tacatggaga ccacagacta cgaatgaaga gtctgtcagc 4800
tctaaaatga acagtgctac cagtgagaca acaaccaata ctgtagctgc tgaaacgact 4860
accaatactg gagctgctga gacaactacc agtactggag ctgctgagac gaaaacagta 4920
gtcacctctt cgctttcaag atctaatcac gctgaaacac agacggcttc cgcgaccgat 4980
gtgattggtc acagcagtag tgttgtttct gtatccgaaa ctggcaacac caagagtcta 5040
acaagttccg ggttgagtac tatgtcgcaa cagcctcgta gcacaccagc aagtagcatg 5100
gtaggatcta gtacagcttc tttagaaatt tcaacgtatg ctggcagtgc caacagctta 5160
ctggccggta gtggtttaag tgtcttcatt gcgtccttat tgctggcaat tatttaa 5217
<210> 2
<211> 1738
<212> PRT
<213> 絮凝酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 2
Met Thr Met Pro His Arg Tyr Met Phe Leu Ala Val Phe Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ile Asn Val Ala Ser Gly Ala Thr Glu Ala Cys Leu Pro Ala
20 25 30
Gly Gln Arg Lys Ser Gly Met Asn Ile Asn Phe Tyr Gln Tyr Ser Leu
35 40 45
Lys Asp Ser Ser Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Tyr Met Ala Tyr Gly Tyr
50 55 60
Ala Ser Lys Thr Lys Leu Gly Ser Val Gly Gly Gln Thr Asp Ile Ser
65 70 75 80
Ile Asp Tyr Asn Ile Pro Cys Val Ser Ser Ser Gly Thr Phe Pro Cys
85 90 95
Pro Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Asn Trp Gly Cys Lys Gly Met Gly Ala
100 105 110
Cys Ser Asn Ser Gln Gly Ile Ala Tyr Trp Ser Thr Asp Leu Phe Gly
115 120 125
Phe Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Val Thr Leu Glu Met Thr Gly Tyr Phe
130 135 140
Leu Pro Pro Gln Thr Gly Ser Tyr Thr Phe Lys Phe Ala Thr Val Asp
145 150 155 160
Asp Ser Ala Ile Leu Ser Val Gly Gly Ala Thr Ala Phe Asp Cys Cys
165 170 175
Ala Gln Gln Gln Pro Pro Ile Thr Ser Thr Asn Phe Thr Ile Asn Gly
180 185 190
Ile Lys Pro Trp Gly Gly Ser Leu Pro Pro Asn Val Glu Gly Thr Val
195 200 205
Tyr Met Tyr Ala Gly Phe Tyr Tyr Pro Met Lys Val Val Tyr Ser Asn
210 215 220
Ala Val Ser Trp Gly Thr Leu Pro Ile Ser Val Thr Leu Pro Asp Gly
225 230 235 240
Thr Ala Val Ser Asp Asp Phe Glu Gly Tyr Val Tyr Ser Phe Asp Asp
245 250 255
Asp Leu Thr Gln Ser Asp Cys Thr Ile Pro Asp Pro Ser Asn Tyr Thr
260 265 270
Ile Ala Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe
275 280 285
Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Ser Gln
290 295 300
Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly
305 310 315 320
Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr
325 330 335
Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp
340 345 350
Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr
355 360 365
Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu
370 375 380
Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Ser Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val
385 390 395 400
Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr
405 410 415
Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr
420 425 430
Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile
435 440 445
Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Ala Trp
450 455 460
Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly
465 470 475 480
Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro
485 490 495
Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr
500 505 510
Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly
515 520 525
Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu
530 535 540
Gly Leu Ile Ser Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser
545 550 555 560
Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr
565 570 575
Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile
580 585 590
Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Asn Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr
595 600 605
Glu Val Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr
610 615 620
Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr
625 630 635 640
Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Val Thr
645 650 655
Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val
660 665 670
Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Ala Thr Glu Pro
675 680 685
Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr
690 695 700
Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr
705 710 715 720
Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Asn Gly
725 730 735
Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Val Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn
740 745 750
Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser
755 760 765
Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr
770 775 780
Ser Thr Ser Thr Glu Val Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro
785 790 795 800
Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu
805 810 815
Ile Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser
820 825 830
Thr Glu Met Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu
835 840 845
Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr
850 855 860
Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Val
865 870 875 880
Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile
885 890 895
Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr Glu
900 905 910
Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val
915 920 925
Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg
930 935 940
Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Asn
945 950 955 960
Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr
965 970 975
Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr
980 985 990
Ser Glu Gly Leu Val Ala Thr Thr Thr Glu Pro Trp Ala Gly Thr Phe
995 1000 1005
Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln
1010 1015 1020
Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly
1025 1030 1035 1040
Leu Val Ala Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr
1045 1050 1055
Ser Thr Glu Met Thr Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp
1060 1065 1070
Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Val Ala
1075 1080 1085
Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu
1090 1095 1100
Met Thr Thr Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val
1105 1110 1115 1120
Ile Val Ile Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Thr
1125 1130 1135
Glu Pro Trp Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Thr Thr
1140 1145 1150
Ile Thr Gly Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Ala Val Ile Val Ile
1155 1160 1165
Arg Thr Pro Thr Ser Glu Gly Leu Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp
1170 1175 1180
Thr Gly Thr Phe Thr Ser Thr Ser Thr Gly Met Thr Thr Val Thr Gly
1185 1190 1195 1200
Thr Asn Gly Gln Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Ile Arg Thr Pro
1205 1210 1215
Thr Ser Glu Gly Leu Val Thr Thr Thr Thr Glu Pro Trp Thr Gly Thr
1220 1225 1230
Phe Thr Ser Thr Ser Thr Glu Met Ser Thr Val Thr Gly Thr Asn Gly
1235 1240 1245
Leu Pro Thr Asp Glu Thr Val Ile Val Val Lys Thr Pro Thr Thr Ala
1250 1255 1260
Ile Ser Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gln Ile Thr Ser Ser
1265 1270 1275 1280
Ile Thr Ser Ser Arg Pro Ile Ile Thr Pro Phe Tyr Pro Ser Asn Gly
1285 1290 1295
Thr Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser
1300 1305 1310
Leu Val Thr Ser Ser Pro Val Ile Ser Ser Ser Phe Ile Ser Ser Ser
1315 1320 1325
Val Ile Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Ser Ile Phe Ser Glu Ser
1330 1335 1340
Ser Lys Ser Ser Val Ile Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ser
1345 1350 1355 1360
Glu Ser Glu Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ile
1365 1370 1375
Ser Ser Glu Ser Pro Lys Ser Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Leu Pro Pro
1380 1385 1390
Val Thr Ser Ala Thr Thr Ser Gln Glu Ile Thr Ser Ser Leu Pro Pro
1395 1400 1405
Val Thr Ser Ala Thr Ala Ser Gln Glu Thr Ala Ser Ser Leu Pro Pro
1410 1415 1420
Ala Thr Thr Thr Lys Thr Ser Glu Gln Thr Thr Leu Val Thr Val Thr
1425 1430 1435 1440
Ser Cys Glu Ser His Val Cys Thr Glu Ser Ile Ser Ser Ala Ile Val
1445 1450 1455
Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Ser Gly Val Thr Thr Glu Tyr Thr Thr
1460 1465 1470
Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu Thr Thr Arg Gln Thr Lys Gly Thr
1475 1480 1485
Thr Glu Gln Thr Thr Glu Thr Thr Lys Gln Thr Thr Val Val Thr Ile
1490 1495 1500
Ser Ser Cys Glu Ser Asp Ile Cys Ser Lys Thr Ala Ser Pro Ala Ile
1505 1510 1515 1520
Val Ser Thr Ser Thr Ala Thr Ile Asn Gly Val Thr Thr Glu Tyr Thr
1525 1530 1535
Thr Trp Cys Pro Ile Ser Thr Thr Glu Ser Lys Gln Gln Thr Thr Leu
1540 1545 1550
Val Thr Val Thr Ser Cys Glu Ser Gly Val Cys Ser Glu Thr Ala Ser
1555 1560 1565
Pro Ala Ile Val Ser Thr Ala Thr Ala Thr Val Asn Asp Val Val Thr
1570 1575 1580
Val Tyr Pro Thr Trp Arg Pro Gln Thr Thr Asn Glu Glu Ser Val Ser
1585 1590 1595 1600
Ser Lys Met Asn Ser Ala Thr Ser Glu Thr Thr Thr Asn Thr Val Ala
1605 1610 1615
Ala Glu Thr Thr Thr Asn Thr Gly Ala Ala Glu Thr Thr Thr Ser Thr
1620 1625 1630
Gly Ala Ala Glu Thr Lys Thr Val Val Thr Ser Ser Leu Ser Arg Ser
1635 1640 1645
Asn His Ala Glu Thr Gln Thr Ala Ser Ala Thr Asp Val Ile Gly His
1650 1655 1660
Ser Ser Ser Val Val Ser Val Ser Glu Thr Gly Asn Thr Lys Ser Leu
1665 1670 1675 1680
Thr Ser Ser Gly Leu Ser Thr Met Ser Gln Gln Pro Arg Ser Thr Pro
1685 1690 1695
Ala Ser Ser Met Val Gly Ser Ser Thr Ala Ser Leu Glu Ile Ser Thr
1700 1705 1710
Tyr Ala Gly Ser Ala Asn Ser Leu Leu Ala Gly Ser Gly Leu Ser Val
1715 1720 1725
Phe Ile Ala Ser Leu Leu Leu Ala Ile Ile
1730 1735
<210> 3
<211> 15406
<212> DNA
<213> 絮凝酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 3
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ttaatgtggc ctcaggagcc acagaggcgt gcttaccagc aggccagagg aaaagtggga 120
tgaatataaa tttttaccag tattcattga aagattcctc cacatattcg aatgcagcat 180
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aagattccta tggaaactgg ggatgcaaag gaatgggtgc ttgttctaat agtcaaggaa 360
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ttgacgactc tgcaattcta tcagtaggtg gtgctaccgc gttcgactgt tgtgctcaac 540
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ctggtaccaa cagtcaacca actgatgaaa ccgttattgt tatcagaact ccaactagtg 960
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agatgaccac cgtcaccggt accaacggtc aaccaactga cgaaaccgtg attgttatca 1080
gaactccaac tagtgagggt ttgattacaa ccaccactga accatggact ggtactttca 1140
cttctacatc tactgagatg accaccgtca ccggtactaa cagtcaacca actgatgaaa 1200
ccgttattgt tatcagaact ccaactagtg agggtttgat tacaaccacc actgaaccat 1260
ggactggcac tttcacttct acatctactg agatgaccac cgtcaccggt actaacggtc 1320
aaccaactga cgaaaccgtg attgttatca gaactccaac cagtgaaggt ttgattacaa 1380
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ccggtaccaa cggtcaacca actgacgaaa ccgttattgt tatcagaact ccaactagtg 1500
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gaactccaac cagtgaaggt ctaatcagca ccaccactga accatggact ggcactttca 1680
cttctacatc tactgagatg accaccgtca ccggtaccaa cggtcaacca actgatgaaa 1740
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caactaccga accatggact ggtactttca cttctacatc tactgaggtt accaccgtca 1980
ccggtactaa tggtcaacca actgacgaaa ccgttattgt tatcagaact ccaactagtg 2040
agggtttgat tacaaccgcc actgaaccat ggactggtac tttcacttct acatctactg 2100
agatgaccac cgtcaccggt actaacggtc aaccaactga tgaaaccgtt attgttatca 2160
gaactccaac cagtgaaggt ttgattacaa ccaccactga accatggaat ggcactttca 2220
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ctgtgattgt cattagaact ccaactagtg agggtttgat tactacaact accgaaccat 2340
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ccggtaccaa cggtcaacca actgacgaaa ctgtgattgt cattagaact ccaactagtg 2580
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ccggtactaa cggtcaacca actgacgaaa ccgtgattgt tatcagaact ccaaccagtg 3660
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gctctatcac gtcttcgcgt ccaattatta ccccattcta tcctagcaat ggaacttctg 3900
tgatttcttc ctcagtaatt tcttcctcag tcacttcttc tctagtcact tcatctccag 3960
tcatttcttc ttcattcatt tcttcctctg tcatttcttc ctctacaaca acctccgctt 4020
ctatattctc tgaatcatct aaatcatccg tcattccaac cagtagttcc acctctggtt 4080
cttctgagag cgaaacgagt tcagctagtt ctgcctcttc ttcctcttct atctcttctg 4140
aatcaccaaa gtctacatat tcgtcttcat cattaccacc tgttaccagt gcaacaacaa 4200
gtcaggaaat tacttcttcc ttaccacctg ttaccagtgc gacagcaagc caggaaactg 4260
cttcttcatt accacctgct accactacaa aaacgagcga acaaaccact ttggttaccg 4320
tgacatcctg cgaatctcat gtgtgcactg aatccatctc ctctgcgatt gtttccacgg 4380
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ccattgtgtc tacaagcact gctactatta acggcgttac cacggaatac acaacatggt 4620
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tgaatgatgt tgttacggtc tatcctacat ggagaccaca gactacgaat gaagagtctg 4800
tcagctctaa aatgaacagt gctaccagtg agacaacaac caatactgta gctgctgaaa 4860
cgactaccaa tactggagct gctgagacaa ctaccagtac tggagctgct gagacgaaaa 4920
cagtagtcac ctcttcgctt tcaagatcta atcacgctga aacacagacg gcttccgcga 4980
ccgatgtgat tggtcacagc agtagtgttg tttctgtatc cgaaactggc aacaccaaga 5040
gtctaacaag ttccgggttg agtactatgt cgcaacagcc tcgtagcaca ccagcaagta 5100
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tgttgaatta gatggtgatg ttaatgggca caaattttct gtcagtggag agggtgaagg 5340
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catcctcggc cacaagttgg aatacaacta caactcccac aacgtataca tcatggccga 5700
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ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag 6600
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gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc 6720
accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc accaggcgcg accgcccgga gctggccagg 6780
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gccaagccct tacgacatat gggccaccgc cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat 7980
tgaggtcacg gatggaaggc tacaagcggc ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac 8040
gcgcatcggc ggtgaggttg ccgaggcgct ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc 8100
ccgtatcacg cagcgcgtga gctacccagg cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga 8160
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aaaactcatt tgagttaatg aggtaaagag aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt 8280
gccggccgtc cgagcgcacg cagcagcaag gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg 8340
ccagccatga agcgggtcaa ctttcagttg ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg 8400
tacgcggtac gccaaggcaa gaccattacc gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta 8460
ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg 8520
catggaaaat caagaacaac caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac 8580
gggcggttgg ccaggcgtaa gcggctgggt tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac 8640
ccccaagccc gaggaatcgg cgtgacggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg 8700
cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac 8760
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tccgctacga gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca 9060
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gataccggga agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg 9180
tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct 9240
gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc 9300
gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg 9360
aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg agctagctga ttggatgtac cgcgagatca 9420
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tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg 9660
cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat 9720
ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag 9780
gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg 9840
ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt 9900
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ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag 10020
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ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag 10140
ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc 10200
ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 10260
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ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 10560
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agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 10680
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tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 10800
tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 10860
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cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 11100
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gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 11220
agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 11280
ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact 11340
aaaacaattc atccagtaaa atataatatt ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca 11400
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atggagtgtc ttcttcccag ttttcgcaat ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt 11700
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tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat acagctcgat aatcttttca gggctttgtt 11820
catcttcata ctcttccgag caaaggacgc catcggcctc actcatgagc agattgctcc 11880
agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacct ttggaacagg cagctttcct tccagccata 11940
gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca 12000
tttttaaata taggttttca ttttctccca ccagcttata taccttagca ggagacattc 12060
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atctggattt tagtactgga ttttggtttt aggaattaga aattttattg atagaagtat 12720
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ataaggaagt tcatttcatt tggagagaac acgggggact cttgac 15406
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