阅读说明：本技术 一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法 (A method of based on signal cascade dual amplification system with highly sensitive and quick detection food-borne pathogens ) 是由 叶邦策 左鹏 李傲 于 2019-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法,该检测方法主要分为以下步骤：(1)将致病菌的多/单克隆抗体偶联至磁珠表面,获得免疫磁珠；(2)将该免疫磁珠与含有食源性致病菌的样品混合,通过抗原抗体反应特异性捕获致病菌；(3)利用引发序列修饰的致病菌适配体及DNA发卡结构探针以引发杂交链式反应,获得HCR产物(带有切口的双链DNA)；(4)向HCR产物中加入拉曼信号分子和拉曼基底,进行相应的SERS测定,实现信号的级联放大及输出。本发明对保障食品安全并预防食源性疾病的发生具有重大意义,同时对于其他生物分析也展现出了巨大的应用潜力。(The invention discloses a kind of based on signal cascade dual amplification system in the method for highly sensitive and quick detection food-borne pathogens, the detection method is broadly divided into following steps: (1) more/monoclonal antibody of pathogenic bacteria being coupled to magnetic bead surfaces, adaptive immune magnetic bead；(2) immunomagnetic beads are mixed with the sample containing food-borne pathogens, pathogenic bacteria is captured by antigen-antibody reaction specificity；(3) it is obtained HCR product (double-stranded DNA with notch) using the pathogenic bacteria aptamers and DNA hairpin structure probe that cause sequence modification with causing hybridization chain reaction；(4) Raman signal molecule and Raman substrate are added into HCR product, carries out corresponding SERS measurement, realizes Cascaded amplification and the output of signal.The present invention is of great significance to ensuring food safety and preventing food origin disease, has also shown huge application potential simultaneously for other biological analysis.)

一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性 致病菌的方法

技术领域

本发明涉及一种基于免疫HCR联合SERS以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法，属于食源性致病菌高灵敏且快速检测技术领域。

背景技术

近年来，沙门氏菌引发的食品安全问题依旧严峻。由于被沙门氏菌污染的食品并不会表现出明显的感官性状，因此很容易被人畜误食，造成食源性疾病的发生。通常，摄入量超过10⁵CFU的沙门氏菌即可使普通人感染，而对于免疫力低下或敏感人群而言，15～20CFU即可致病，因此开发出新型的检测方法以实现高灵敏地检测沙门氏菌显得至关重要。

传统的检测方法虽然被视为金标准，但却费时耗力，整个检测过程需要4～7天左右，不能满足即时且灵敏的检测目的；基于免疫学或分子生物学的检测方法如ELISA、PCR、LAMP等方法虽然在灵敏度上得到了极大改善，但却容易出现假阳性问题，因此特异性有待提高。核酸适配体是一段经体外筛选获得的寡核苷酸序列，可与靶标高亲和力强特异性结合，因而可被用于设计成适配体传感器。HCR作为一种恒温无酶的核酸扩增技术，由于具有低成本、易合成和稳定性高的优势，有望结合适配体传感器替代PCR作为信号放大的手段；另一方面，SERS具有显著的指纹识别能力和强大的信号放大能力，且无需对样品进行复杂的前处理，目前已被应用于多种分析方法中，若作为其他放大技术如HCR的信号输出方式，则有望进一步提高检测的灵敏度，同时缩短检测时长。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于免疫HCR联合SERS进行信号级联放大以高灵敏检且快速检测食源性致病菌的方法，具体技术方案如下：

一种基于信号级联双重放大系统以高灵敏且快速检测食源性致病菌的方法，是基于免疫杂交链式反应联合表面增强拉曼散射的信号级联双重放大系统以高灵敏快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于，所述免疫杂交链式反应是免疫磁珠通过抗原抗体的特异性反应以捕获靶标菌，靶标菌再与对应的核酸适配体传感器反应延伸出HCR产物，最终体系形成了一个“免疫磁珠-靶标菌-DNA双链”的三明治夹心结构复合物。

所述表面增强拉曼散射是，所用的拉曼信号分子嵌入DNA双链中而淬灭拉曼特征谱峰信号；相反，处于游离状态的拉曼信号分子则通过静电作用与纳米银颗粒结合形成热点而生成拉曼特征谱峰，且信号强度与靶标菌的数量在一定范围内存在相关关系。

所述磁珠为表面修饰了活性基团的磁珠，所述抗体为抗靶标菌多克隆抗体或单克隆抗体。

所述抗靶标菌免疫磁珠的制备方法如下：

取适量修饰了活性基团的磁珠，加入适量缓冲液清洗几次以除去原保存液，然后加入新鲜配制的活化溶液室温振荡半小时以活化磁珠表面的活性基团；加入抗靶标菌多/单克隆抗体，室温振荡孵育一段时间，除去剩余的抗体溶液，再用PBST清洗两次，最后将获得的免疫磁珠存储于BSA封闭液中并保存备用。

所述免疫磁珠捕获靶标菌的方法如下：

取适量免疫磁珠存储液，于磁力架上除去多余的溶液，再用PBST清洗2～3次，除去多余的BSA，然后加入含有靶标菌的样品，室温孵育一定时间，最后用PBST清洗1～2次，获得免疫磁珠-靶标菌复合物。

所用DNA序列如下：

所述制备HCR方法如下：

向上述免疫磁珠-靶标菌复合物中加入引发序列修饰的适配体，孵育一段时间，除去未结合的适配体后再加入发卡结构的探针H1和H2，孵育一段时间以引发杂交链式反应，除去未反应的探针后，最终获得免疫磁珠-靶标菌-适配体HCR延伸产物的复合物。

所述表面增强拉曼散射检测方法如下：

设置好拉曼仪的测定条件；向上述免疫磁珠-靶标菌-适配体HCR延伸产物的复合物中加入过量拉曼信号分子，混匀，避光孵育一段时间；再加入适量纳米银胶体，混匀，避光孵育一段时间；取适量体系于玻璃板上，避光条件下扣除背景后测定。

本发明以检测鼠伤寒沙门氏菌为例，基于免疫磁珠捕获样品中鼠伤寒沙门氏菌的方法，捕获方法包括以下步骤：

(1)将抗鼠伤寒沙门氏菌抗体与磁珠偶联，得到抗鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠；

(2)将抗鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠与含有靶标菌的样品混合，通过抗原抗体特异性反应捕获样品中的靶标菌；

进一步的，所述磁珠为表面修饰了羧基基团的磁珠。

进一步的，所述抗鼠伤寒沙门氏菌抗体为为抗鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体或单克隆抗体。

进一步的，步骤(1)所述抗鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠的制备方式如下：

取适量羧基磁珠，加入MES缓冲液(pH 6)清洗2次以除去原保存液，然后加入新鲜配制的EDC溶液室温振荡半小时以活化羧基磁珠表面的羧基基团；加入PBS缓冲液稀释后的抗鼠伤寒沙门氏菌多/单克隆抗体，室温振荡孵育一段时间，除去剩余的抗体溶液，再用PBST清洗两次，最后将获得的免疫磁珠存储于BSA封闭液中并保存于4℃备用。

步骤(2)所述免疫磁珠捕获鼠伤寒沙门氏菌的方法如下：

将步骤(1)所得的免疫磁珠与含有鼠伤寒沙门氏菌的样品混合孵育一段时间，形成免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌的复合物。

本发明还提供了一种基于免疫HCR联合SERS以高灵敏检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，检测步骤如下：

(1)向上述免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌的复合物中加入引发序列修饰的适配体，孵育一段时间后，形成免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-适配体的复合物，同时暴露出引发序列；然后加入发卡结构的探针H1和H2，孵育一段时间，延伸出不同长度的带有切口的双链DNA，最终形成“免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-适配体HCR延伸产物”的复合物；

(2)取适量免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-适配体HCR延伸产物复合物，加入过量DAPI(拉曼信号分子)，避光孵育一段时间后，加入纳米银胶体，避光孵育一段时间后，进行拉曼测定。

上述含有鼠伤寒沙门氏菌的样本可包括液态食品样品如牛奶、肉汤等，固态食品样品如肉类，禽蛋等。

本发明的创新之处在于，对适配体修饰一段引发序列构成适配体传感器，使之既可特异性识别并结合靶标菌，又可暴露出引发序列以引发杂交链式反应，作为一次信号放大；同时联合表面增强拉曼散射技术，实现信号进一步放大与输出；最终可高灵敏且快速地检测食品样品中的鼠伤寒沙门氏菌，对于确保食品安全并预防食源性疾病的发生具有重大意义。

附图说明

图1为制备的免疫磁珠的表征结果。

图2为实施例免疫磁珠捕获鼠伤寒沙门氏菌的结果。

图3为制备的纳米银胶体的紫外可见吸收光谱及粒径分布图。

图4为HCR条件优化的结果。

图5为各梯度靶标菌的拉曼谱峰及与对应的SERS强度间的标准曲线。

图6为该方法的特异性验证结果。

表1为该方法与平板计数法的比较。

具体实施方式

基于免疫HCR联合SERS以高灵敏且快速检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

(1)取适量羧基磁珠，先用MES溶液清洗2～3次以除去原保存液，再用新鲜配制的EDC溶液室温振荡半小时，以活化羧基基团。

(2)取适量活化后的羧基磁珠，加入PBS缓冲液稀释后的抗鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体，室温振荡孵育一段时间。

(3)除去多余的抗体溶液，再用PBST清洗2次，将制得的免疫磁珠存储于BSA封闭液中，4℃保存备用。

(4)梯度稀释鼠伤寒沙门氏菌，将封闭后的免疫磁珠与含有鼠伤寒沙门氏菌的样品混合，室温孵育一段时间，获得免疫磁珠-靶标菌的复合物。

(5)向免疫磁珠-靶标菌的复合物中加入引发序列修饰的适配体，37℃条件下孵育一段时间，用PBST洗去未结合的适配体。

(6)向免疫磁珠-靶标菌-适配体的复合物中加入发卡结构的探针H1和H2，37℃条件下孵育一段时间，用PBST洗去未反应的探针。

(7)向免疫磁珠-靶标菌-适配体HCR延伸产物的复合物中加入过量DAPI拉曼信号分子，避光条件下孵育一段时间。

(8)加入适量纳米银胶体体系，避光条件下孵育几分钟后，取适量样品于玻璃板上，扣除背景后进行SERS测定，获得标准曲线。

(9)另取其他革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌及无菌对照组作比较，检测步骤同上述鼠伤寒沙门氏菌，以确定该方法的特异性情况。

(10)向食品样品中加入一定浓度的鼠伤寒沙门氏菌，获得加标样品，确定本方法与平板计数法的回收率。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不为本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明步骤或条件有所修改，均属于本发明的范围。

实施例中所用仪器和试剂：抗鼠伤寒沙门氏菌兔多克隆抗体(ab35156，Abcam，美国)；抗鼠伤寒沙门氏菌小鼠单克隆抗体([1E6]ab8274，Abcam，美国)；羧基磁珠(Invitrogen公司，美国)；MES(Acros Organics公司，美国)；BSA(Sigma Aldrich公司，美国)；样品混匀仪(Thermo Fisher公司，美国)；酶标仪(Bio-Tek，美国)；拉曼仪(B&W Tek，美国)；其余试剂均为常规试剂。

实施例1——免疫HCR联合SERS检测缓冲体系中的鼠伤寒沙门氏菌

1免疫磁珠的制备

1.1取200μg羧基磁珠于2mL离心管中，除去原保存溶液，加入200μL MES缓冲液(pH6)清洗两次，再用200μL新鲜配制的EDC溶液(10mg/mL)活化30分钟；

1.2用PBST清洗一次以避免磁珠聚集，加入200μL抗鼠伤寒沙门氏菌兔多克隆抗体溶液(40mg/mL)后于混匀仪上孵育3小时，未加入抗体的磁珠作为阴性对照；

1.3PBST清洗一次后，将免疫磁珠存储于800μLBSA封闭液(质量分数1％，溶剂为1×PBS缓冲液)中，4℃下保存备用，其表征结果见图1。

2免疫磁珠捕获鼠伤寒沙门氏菌

2.1取上述免疫磁珠200μL，除去封闭液后，再用PBST缓冲液清洗2次以除去多余的封闭蛋白；

2.2将鼠伤寒沙门氏菌原液梯度稀释，取梯度浓度菌液(10CFU/mL、10²CFU/mL、10³CFU/mL、10⁴CFU/mL、10⁵CFU/mL)各1mL于2mL离心管中，加入上述清洗后的免疫磁珠，于混匀仪上孵育40分钟，形成免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌的复合物；捕获结果见图2，经3次清洗后，对照组涂(沙门氏菌特异性培养基)平板后无菌生产，实验组则有菌生长。

3通过HCR实现信号放大

3.1适配体、探针H1和H2的储备液先升温至95℃并加热2分钟，然后退火至室温，保存于-4℃备用；

3.2向上述免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌复合物中加入190μL Tris-HCl缓冲液(20mMTris,0.5M NaCl,pH 7.8)和10μL适配体溶液(5μM)，37℃下震荡孵育50分钟，形成免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-适配体的复合物；

3.3使用200μLPBST缓冲液清洗2次，再加入160μLSSC缓冲液(120mM柠檬酸三钠,1.2M NaCl,pH 7)，20μLH1(10μM)和20μLH2(10μM)，37℃下震荡孵育1小时，形成免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌-适配体的HCR延伸产物。延伸结果见图3，图中弥散条带即为不同条件下延伸出的不同长度的DNA双链。

4通过SERS实现信号进一步放大与输出

4.1用改良的传统经典方法合纳米银胶体体系，最终胶体体系在485nm处存在最大吸收峰，粒径集中分布在65nm左右，见图4；

4.2SERS的测定条件设置为：激发光波长为785nm，激光功率100mW,积分时间10000ms；

4.3取20μLHCR产物，加入20μLDAPI溶液(2.86mM)，混匀，避光条件下孵育10分钟，再加入60μL纳米银胶体体系，混匀，避光条件下孵育5分钟；

4.4取上述10μL体系于玻璃板上，背景扣除后，测定。各梯度拉曼谱峰情况及标准曲线见图5，特异性验证试验结果见图6。

实施例2——免疫HCR联合SERS检测食品体系中的鼠伤寒沙门氏菌

1免疫磁珠的制备同实施例1

2食品样品预处理

2.1取10mL市售超高温灭菌牛奶，8000rpm离心8分钟后除去上层油脂，以每管1.35mL分装于2mL离心管中；

2.2取系列不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌菌液150μL于盛有1.35mL样品的离心管中，混匀，得到1.5mL加标样品；

3加标样品平板计数

对靶标菌浓度较大的加标样品再用PBS缓冲液进行梯度稀释，然后各组选取2～3个合适的连续梯度的样品100μL，涂布于LB固体培养基上，37℃培养24小时后计数，每个样品做三组平行。

4免疫磁珠捕获鼠伤寒沙门氏菌

4.1取免疫磁珠200μg，除去封闭液后，再用PBST缓冲液清洗2次以除去多余的封闭蛋白；

4.2取加标样品1mL于2mL离心管中，加入清洗后的免疫磁珠，于混匀仪上孵育40分钟，形成免疫磁珠-鼠伤寒沙门氏菌的复合物；

5通过HCR实现信号放大同实施例1。

6通过SERS实现信号转换与进一步放大同实施例1。

7该方法的结果与平板计数法的比较见表1。

表1