牛樟芝多糖在制备黄羽肉鸡抗lps应激饲料中的应用

文档序号:175577 发布日期:2021-11-02 浏览:23次 >En<

阅读说明:本技术 牛樟芝多糖在制备黄羽肉鸡抗lps应激饲料中的应用 (Application of antrodia camphorata polysaccharide in preparation of anti-LPS (low-cholesterol solution) stress feed for yellow-feather broilers ) 是由 蒋守群 叶金玲 林厦菁 王一冰 张盛 于 2021-09-09 设计创作,主要内容包括:本发明公开了一种牛樟芝多糖在制备黄羽肉鸡抗LPS应激饲料中的应用。研究了牛樟芝多糖在抗氧化、改善肠道健康和生长性能的作用机制,拓宽了牛樟芝多糖的用途,为牛樟芝多糖在养殖业的应用奠定了基础。(The invention discloses an application of antrodia camphorata polysaccharide in preparing anti-LPS stress feed for yellow-feathered broilers. The research on the action mechanism of the antrodia camphorata polysaccharide in resisting oxidation and improving the intestinal health and the growth performance widens the application of the antrodia camphorata polysaccharide, and lays a foundation for the application of the antrodia camphorata polysaccharide in the breeding industry.)

牛樟芝多糖在制备黄羽肉鸡抗LPS应激饲料中的应用

技术领域

本发明涉及家禽养殖技术领域,更具体地说是涉及牛樟芝多糖在制备黄羽肉鸡抗LPS 应激饲料中的应用。

背景技术

在正常生理条件下,肉鸡机体氧化与抗氧化常处于动态平衡中,但许多外源或内源性刺激均可导致机体处于氧化应激状态,对肉鸡的健康养殖造成严重的影响。肠道是动物体内最重要的消化器官,也是体内第一个遭受到氧化损伤的器官,致病性大肠杆菌可以破坏肠道微生物屏障,损伤鸡肠道黏膜结构,导致氧化应激,影响肠道健康。与此同时,在外界病原微生物侵染过程中,肝脏是清除内毒素的主要组织器官,且比其它器官对氧化应激更加敏感。许多研究也已经证实,肝脏损伤往往伴随着氧化应激,且氧化应激对肝脏损伤或肝脏疾病的发生和发展具有促进作用。近年来,研究学者通过建立氧化应激模型来探讨其影响作用并取得重要进展,这对于研究氧化应激机制和抗氧化应激添加剂的研制具有重要意义。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),也称作细菌内毒素,是革兰氏阴性菌细胞壁脂质双分子层的外层结构,是构建炎症反应较好的激活剂。众多研究学者通过腹腔或静脉注射LPS后发现,肉鸡发生了急性炎症反应,并促进炎症细胞因子的产生和炎症关键基因的表达,进而阻碍养分消化利用,最终导致肉鸡生长性能下降。

多糖主要是从植物和菌类等中提取的一种多聚糖,具有多种生物活性,能够提高机体免疫力和抗氧化水平,并具有抗肿瘤、抑菌和调节畜禽肠道健康等作用,同时具有安全低毒、不易产生耐药性、无污染和无残留的特性。牛樟芝(Antrodia cinnamomea)为台湾地区特有真菌品种,又名牛樟菇、樟芝、红牛樟芝、血灵芝等。多糖是牛樟芝的主要活性成分,且主体结构是葡萄糖,但其活性多糖是D-葡聚糖大分子结构。虽然多糖在肉鸡上的研究报道相对较多,但主要集中在黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)、枸杞多糖和藻类多糖(Algae-derived polysaccharide,ADP)等,牛樟芝多糖(Antrodia cinnamomeapolysaccharide,ACP)的研究报道较少。又因多糖具有提高机体抗氧化水平和抑菌的效果,而且还可以调节畜禽肠道健康,同时具有安全低毒和不易产生耐药性等的特性,所以,如果将牛樟芝多糖应用于黄羽肉鸡的抗LPS应激中能提高黄羽肉鸡抗氧化水平、改善其肠道健康和生长性能,则有利于牛樟芝多糖在黄羽肉鸡养殖生产中的开发利用。

因此,如何在黄羽肉鸡养殖生产中对牛樟芝多糖加以应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此,本发明提供了一种牛樟芝多糖在制备黄羽肉鸡抗LPS应激饲料中的应用。

为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:

牛樟芝多糖在制备黄羽肉鸡抗LPS应激饲料中的应用。

作为本发明优选的技术方案,牛樟芝多糖提高了LPS应激黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜中 T-SOD、GSH-Px和T-AOC活性;降低了LPS应激黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜中MDA的含量。

作为本发明优选的技术方案,牛樟芝多糖降低了LPS应激黄羽肉鸡血浆中炎症因子 TNF-α和IFN-r的表达水平;降低了LPS应激黄羽肉鸡空肠黏膜中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。

作为本发明优选的技术方案,牛樟芝多糖增加了LPS应激黄羽肉鸡空肠绒毛高度和绒隐比,降低了隐窝深度和肠壁厚度。

作为本发明优选的技术方案,牛樟芝多糖降低了LPS应激黄羽肉鸡空肠黏膜炎症反应相关基因TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA表达丰度;提高了LPS应激黄羽肉鸡空肠肠道屏障相关基因MUC2、Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达丰度。

作为本发明优选的技术方案,牛樟芝多糖提高了LPS应激黄羽肉鸡的肝脏指数、胰腺指数和法氏囊指数。

作为本发明优选的技术方案,牛樟芝多糖提高了LPS应激黄羽肉鸡肝脏中T-SOD、GSH-Px和T-AOC含量;降低了LPS应激黄羽肉鸡肝脏中MDA含量。

作为本发明优选的技术方案,牛樟芝多糖降低了LPS应激黄羽肉鸡肝脏炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。

作为本发明优选的技术方案,牛樟芝多糖降低了LPS应激黄羽肉鸡肝脏中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达丰度。

作为本发明优选的技术方案,牛樟芝多糖降低了LPS应激黄羽肉鸡肝脏中COX2和BAX的mRNA表达丰度;提高了Nrf2和SOD1的mRNA表达丰度。

经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明公开提供了一种牛樟芝多糖在制备黄羽肉鸡抗LPS应激饲料中的应用,牛樟芝多糖可有效缓解LPS诱导的生长抑制和肠道氧化损伤;能够提高肝脏指数和抗氧化酶活性,改善肝脏抗氧化功能,影响关键基因的mRNA表达丰度,且效果优于抗生素和裸藻粉。其作用机制可能与黄芪多糖类似,通过抑制LPS诱导的TLR4/NF-κB表达,进而抑制炎症反应的发生,提高机体抗氧化能力增强肠道黏膜屏障功能,充分发挥修复炎症损伤和促进生长性能的功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为实施例1中ACP对LPS应激黄羽肉鸡空肠形态结构的影响;

图2附图为实施例1中ACP对LPS应激黄羽肉鸡空肠炎症反应基因mRNA表达丰度的影响;A为TLR4基因表达丰度的结果图;B为NF-κB基因表达丰度的结果图;C为TNF-α基因表达丰度的结果图;D为IL-1β基因表达丰度的结果图;

图3附图为实施例1中ACP对LPS应激黄羽肉鸡空肠肠道屏障相关基因mRNA表达丰度的影响;A为MUC2基因表达丰度的结果图;B为Claudin-1基因表达丰度的结果图; C为ZO-1基因表达丰度的结果图;D为Occludin基因表达丰度的结果图;

图4附图为实施例2中ACP对LPS应激黄羽肉鸡肝脏中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达丰度的影响;A为TLR4基因表达丰度的结果图;B为MyD88基因表达丰度的结果图;C为NF-κB基因表达丰度的结果图;

图5附图为实施例2中ACP对LPS应激黄羽肉鸡肝脏抗氧化和抗损伤基因mRNA表达丰度的影响图;A为COX2基因表达丰度的结果图;B为Nrf2基因表达丰度的结果图; C为SOD1基因表达丰度的结果图;D为BAX基因表达丰度的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

实施例1牛樟芝多糖对黄羽肉鸡生长性能和空肠黏膜完整性的影响

实施例中用到的材料:LPS(055:B5,货号L4005)购于Sigma公司;牛樟芝多糖(ACP,有效成分为D-葡聚糖,含量为76.3%)由台湾地区台北佳时开生技股份有限公司提供;黄芪多糖(APS,富含黄芪多糖和黄芪甲苷,多糖含量为45%)购自北京生泰尔科技股份有限公司;裸藻粉(ADP,有效成分为β-1,3葡聚糖,含量为45%)购自珠海建明科技有限公司。

实施例中用到的试验饲粮

玉米-豆粕型基础饲粮,根据中国饲料成分表(第15版)配制饲粮,具体试验饲粮配方与营养水平见表1。基础饲粮营养水平参考广东省农业科学院动物科学研究所新编撰的NY/T 3645-2020《黄羽肉鸡营养需要量》,科学配制试验饲粮。各组饲粮营养水平保持一致,抗生素和其他添加剂按照不同添加水平等重量替代统糠。

表1基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础)

项目 含量
原料
玉米 60.50
豆粕 31.5
大豆油 1.70
L-赖氨酸盐酸盐 0.16
DL-蛋氨酸 0.17
石粉 1.22
磷酸氢钙 1.93
食盐 0.30
统糠 1.52
预混料 1.00
合计 100.00
营养水平
代谢能/(Kcal/kg) 2960
粗蛋白 21.50
赖氨酸 1.29
蛋氨酸 0.52
蛋氨酸+胱氨酸 0.93
苏氨酸 0.86
色氨酸 0.21
异亮氨酸 0.86
1.00
非植酸磷 0.47

预混料为1~21日龄阶段每千克饲粮提供VA 15000IU,VB1 1.8 mg,烟酸35mg,VB23.6 mg,VB6 3.5 mg,VB12 0.01 mg,VD3 3300 IU,VE 10IU, VK 0.5mg,生物素0.15mg,泛酸钙10mg,叶酸0.55mg,氯化胆碱2600mg,Fe 80mg,Cu 8mg,Mn 80mg,Zn 60mg,I 0.35mg,Se0.15mg。2)营养水平为计算值。

试验动物及分组

试验在广东省农业科学院动物科学研究所动物营养研究室试验场进行。选用1200只健康状况良好的9日龄快大型岭南黄羽肉鸡(母雏),逐只称重,根据体重一致原则分为8个处理组(每处理6重复,每重复25只鸡):

空白对照组、LPS应激组(LPS组)、LPS应激+20mg/kg维吉尼亚霉素 (LPS+抗生素组)、LPS应激+100mg/kg ACP(LPS+100mg/kg ACP)、LPS 应激+200mg/kg ACP(LPS+200mg/kgACP)、LPS应激+400mg/kg ACP (LPS+400mg/kg ACP)、LPS应激+400mg/kg APS(LPS+400mg/kg APS)、 LPS应激+200mg/kg ADP(LPS+200mg/kg ADP)。在第18日龄和第20日龄,空白对照组腹腔注射0.50mL的生理盐水,其他处理组分别腹腔注射0.50 mL的LPS(500μg/kg体重),试验期21天。

饲养管理

试鸡平养于封闭式鸡舍,地面铺放木屑,自由采食颗粒料和饮水,各组饲养管理和环境条件一致,按照常规操作程序和免疫流程进行饲养和免疫。试验期间人工控制舍内光照,每天保持23h光照,并自然通风。每天记录08:00、 14:00、20:00鸡舍温度和相对湿度。

生长性能测定

试验过程中,每天观察鸡只健康状况,一旦出现死鸡,立即称死鸡重和剩料量,以消除死鸡对试验结果的影响。记录死鸡数量,同时应立即查明原因,采取适当措施。试验开始和结束前1天19:00对试验鸡断料、供水,次日 07:00以重复为单位称重,统计耗料量,计算平均日采食量、平均日增重、料重比和存活率;结果见表2;

表2 ACP对LPS应激黄羽肉鸡生长性能的影响

注:.同行肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05);下表同。

由表2可知,与空白对照组相比,LPS显著降低了快大型黄羽肉鸡的FBW、 ADFI和ADG(P<0.05),而不同多糖对黄羽肉鸡的生长性能没有显著影响 (P>0.05)。与LPS相比,其他处理均显著提高黄羽肉鸡的ADFI(P<0.05),且ADP显著提高黄羽肉鸡的ADG(P<0.05)。与抗生素相比,不同多糖对黄羽肉鸡的FBW、ADFI和ADG没有显著影响(P>0.05)。此外,不同多糖各组组间相比对黄羽肉鸡的生长性能没有显著差异(P>0.05)。

样品的采集与指标检测

(1)常规指标检测

在第30日龄,每重复选取接近平均体重的2只鸡翅静脉采血5mL于加有肝素钠的抗凝管,3500r/min离心10min取上清。屠宰后取出空肠,用预冷的生理盐水清洗内容物,纵向剖开,刮去内层黏膜装入1.50mL离心管中, -80℃保存。常规制备空肠组织匀浆液,按照体积比加入9倍体积预冷的生理盐水,进行组织匀浆后低温离心(4℃,8000r/min,10min),取上清。利用BCA蛋白定量试剂盒(凯基,南京)测定上清中总蛋白浓度。利用黄嘌呤氧化酶法测定血浆总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性;二硫代二硝基苯甲酸 (DT-NB)比色法测定血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;铁(Fe) 氧化还原法测定血浆总抗氧化能力(T-AOC);TBA法测定血浆丙二醛(MDA) 含量,以上试剂盒购自南京建成生物工程研究所。采用放射免疫法测定上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素(IFN-r)白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10),所需试剂盒购自北京北方生物技术研究所。以上指标均在多功能酶标仪(Spectramax M-5,molecular devices公司,美国)上读数,各指标具体检测方法和结果计算均按照说明书进行。ACP对LPS氧化应激状态下黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜抗氧化能力的影响见表3;ACP对LPS应激黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜炎症因子的影响见表4;

表3 ACP对LPS应激黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜抗氧化能力的影响

由表3可知,与空白对照组相比,LPS显著降低了快大型黄羽肉鸡血浆中T-AOC活性(P<0.05),显著提高了血浆和空肠黏膜中MDA的含量(P<0.05);抗生素和不同多糖对黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜中T-SOD和T-AOC活性没有显著影响(P>0.05);ACP (200mg/kg和400mg/kg)和APS显著提高了黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜中GSH-Px活性(P <0.05),但对T-AOC活性和MDA含量没有显著影响(P>0.05)。与LPS相比,ACP (200mg/kg和400mg/kg)显著提高了黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜中T-SOD、GSH-Px和 T-AOC活性(P<0.05);APS显著提高了血浆中T-SOD、GSH-Px和T-AOC活性(P< 0.05)和空肠黏膜中GSH-Px和T-AOC活性;不同多糖显著降低了血浆和空肠黏膜中MDA 的含量(P<0.05)。与抗生素相比,ACP(200mg/kg和400mg/kg)和APS显著提高了黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜中GSH-Px活性(P<0.05);不同多糖显著降低了血浆中MDA 的含量(P<0.05);ADP显著降低了血浆中MDA的含量并且显著提高空肠黏膜中GSH-Px 活性(P<0.05)。ACP组和APS组的各组间相比对血浆和空肠黏膜中的T-SOD活性、T-AOC 活性和MDA含量没有显著差异(P>0.05)。

表4 ACP对LPS应激黄羽肉鸡血浆和空肠黏膜炎症因子的影响

由表4可知,与空白对照组相比,LPS显著提高了血浆中炎症因子TNF-α和IFN-r的表达(P<0.05),并显著提高了空肠黏膜中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达(P<0.05),显著降低了空肠黏膜中抗炎因子IL-10的表达(P<0.05)。与LPS相比,抗生素、 ACP和APS显著降低了血浆中炎症因子TNF-α和IFN-r的表达(P<0.05),ACP和APS 显著降低了空肠黏膜中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达(P<0.05),但只有100mg/kg ACP显著提高了黏膜中抗炎因子IL-10的表达(P<0.05)。与抗生素相比,400mg/kg ACP 显著降低了空肠黏膜中炎症因子TNF-α的表达(P<0.05)。不同ACP组组间对血浆和空肠黏膜中的炎症因子的表达均没有显著差异(P>0.05),400mg/kg ACP组、APS组和 ADP组3个组别之间对血浆和空肠黏膜中的炎症因子表达也没有显著差异(P>0.05)。

(2)空肠组织形态检测

每组取出空肠后选取肠道中段1~2cm用生理盐水进行冲洗,将冲洗干净的肠段放入提前准备好的4%多聚甲醛保存过夜,进行常规石蜡包埋后,采用苏木精-伊红(HE)进行染色处理,制成石蜡切片。采用Motic-BA210 Digital数码显微镜对每组切片进行40×视野拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野,保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus6.0软件以40×标尺为标准,每张切片选取5根最完整的绒毛,分别测量绒毛高度(μm)、隐窝深度(μm)、肠壁厚度(μm)并计算绒隐比(绒毛高度/隐窝深度);结果见图1 和表5;

由图1可知,30日龄基础日粮组黄羽肉鸡空肠黏膜结构完整,层次清晰,肠绒毛排列整齐,绒毛间及隐窝之间界限分明。相对于空白对照组,30日龄LPS应激组黄羽肉鸡肠壁厚度增加,空肠黏膜结构紊乱、疏松,肠绒毛变短、破损,肠绒毛上皮细胞坏死、脱落,隐窝增加,且出现肥大,提示LPS可能影响位于隐窝部位的肠道干细胞进而影响隐窝部位细胞增殖分化,最终导致绒毛结构受损。相较于LPS组和抗生素组,不同ACP组表现为空肠绒毛高度增加、隐窝深度降低以及使肠壁变薄,并且其肠绒毛更密集和完整。相对于 ACP组和APS组,ADP组的空肠黏膜结构完整性较差。

表5 ACP对LPS应激黄羽肉鸡空肠组织形态的影响

由表5可知,与空白对照组相比,LPS应激组的空肠绒毛高度显著降低(P<0.05),隐窝深度显著增加(P<0.05),绒隐比显著降低(P<0.05),肠壁厚度显著变厚(P<0.05);ACP组和APS组的空肠绒毛高度、隐窝深度和绒隐比均没有显著差异(P>0.05)。与LPS 相比,抗生素组的空肠绒毛高度和绒隐比均没有显著变化(P>0.05),但是隐窝深度显著降低(P<0.05)和肠壁厚度显著降低(P<0.05);ACP组和APS组的空肠绒毛高度显著增加(P<0.05),隐窝深度显著降低(P<0.05),绒隐比显著增加(P<0.05),肠壁厚度也显著降低(P<0.05);ADP组的空肠绒毛高度没有显著变化(P>0.05),隐窝深度显著降低(P<0.05),绒隐比显著增加(P<0.05),肠壁厚度也显著降低(P<0.05)。与抗生素相比,ACP组和APS组的空肠绒毛高度没有显著变化(P>0.05),隐窝深度显著降低(P<0.05),绒隐比显著增加(P<0.05),肠壁厚度也显著降低(P<0.05)。相对于ADP组,100mg/kg ACP组的空肠绒毛高度没有显著变化(P>0.05),隐窝深度显著降低(P<0.05),绒隐比显著增加(P<0.05),肠壁厚度也显著降低(P<0.05);相对于200mg/kg ACP组、APS组和ADP组,100mg/kg ACP组的肠壁厚度显著降低(P< 0.05);ACP组和APS组的绒毛高度、隐窝深度和绒隐比相比均没有显著变化(P>0.05)。

(3)空肠结构完整性相关基因表达检测

空肠肠段清洗干净剪成两段放于1.50mL离心管,-80℃保存。总RNA的提取按照Trizol 试剂盒说明书进行操作,利用Nano-Drop-2000微量核酸测定仪检测RNA的总浓度和纯度。 RNA反转录严格按照试剂盒说明书进行。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应(Bio-RadCFX System)为20.0μL体系:iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad美国)10.0μL,上下游引物(10μmol/L)各1.0μL,cDNA模板2.0μL(10倍稀释),ddH2O 6.0μL,每个样品3个重复孔。从GenBank中获得所测基因的序列取保守区域设计引物,并选用管家基因β-actin基因作为内参基因。所需引物由上海生工生物有限公司合成,引物序列见表6,并用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA相对表达量;ACP对LPS应激黄羽肉鸡空肠炎症反应和肠道屏障关键基因mRNA表达丰度的影响结果见图2和图3;

由图2可知,与空白对照组相比,LPS显著提高了黄羽肉鸡空肠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA表达丰度(P<0.05)。与LPS和抗生素相比,ACP和APS显著降低了 TLR4、NF-κB和IL-1β的mRNA表达丰度(P<0.05),但对TNF-α的mRNA表达丰度没有显著影响(P>0.05)。与抗生素相比,ADP对空肠TLR4、TNF-α和IL-1β的mRNA表达丰度没有显著影响(P>0.05),但显著降低了NF-κB的mRNA表达丰度(P<0.05)。与空白对照组相比,ACP和APS对黄羽肉鸡空肠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA 表达丰度没有显著影响(P>0.05);ACP组和APS组各组间相比对黄羽肉鸡空肠TLR4、 NF-κB、TNF-α和IL-1β的mRNA表达丰度没有显著影响(P>0.05)。

由图3可知,与空白对照组相比,LPS显著降低了黄羽肉鸡空肠MUC2、Claudin-1、ZO-1和Occludin mRNA表达丰度(P<0.05)。与LPS相比,抗生素对MUC2、Claudin-1、 ZO-1和Occludin mRNA表达丰度没有显著影响(P>0.05);不同ACP显著提高了MUC2、 Claudin-1、ZO-1和Occludin mRNA表达丰度(P<0.05);APS显著提高了MUC2、Claudin-1 和OccludinmRNA表达丰度(P<0.05);ADP显著提高了Claudin-1mRNA表达丰度(P <0.05)。与抗生素相比,ACP(200mg/kg和400mg/kg)显著提高了MUC2、Claudin-1 和Occludin mRNA表达丰度(P<0.05);APS和ADP仅仅显著提高了Claudin-1mRNA 表达丰度(P<0.05)。但是,与空白对照组相比,不同ACP和APS对MUC2、ZO-1和 Occludin mRNA表达丰度没有显著影响(P>0.05);只有200mg/kg ACP显著提高了 Claudin-1mRNA表达丰度(P<0.05);ADP对Claudin-1、ZO-1和Occludin mRNA表达丰度没有显著影响(P>0.05)。但是不同ACP组和APS组各组间相比对黄羽肉鸡空肠 MUC2、Claudin-1、ZO-1和Occludin mRNA表达丰度没有显著影响(P>0.05)。

表6 qRT-PCR引物序列

实施例2牛樟芝多糖对LPS应激黄羽肉鸡脏器指数和肝脏抗氧化能力的影响

试验材料

LPS(055:B5,货号L4005)购于Sigma公司;牛樟芝多糖(ACP,有效成分为D-葡聚糖,含量为76.3%)由台湾地区台北佳时开生技股份有限公司提供;黄芪多糖(APS,富含黄芪多糖和黄芪甲苷,多糖含量为45%)购自北京生泰尔科技股份有限公司;裸藻粉(ADP,有效成分为β-1,3葡聚糖,含量为45%)购自珠海建明科技有限公司。

试验动物及设计同实施例1。

饲养管理同实施例1。

试验用饲粮同实施例1的表1。

指标测定与方法

样品的采集与指标测定

样品的采集

试验过程中,每天观察鸡只健康状况,在30日龄时,每组随机抽取2只肉仔鸡活体称重、屠宰,剖取肝脏、胰脏、脾脏、胸腺和法氏囊并剔除表面结缔组织和脂肪后称重,计算各自重量占屠体重的百分率,得到各器官指数。计算公式如下:器官指数(%)=(器官重量/屠体重)×100。结果见表7;

表7 ACP对LPS应激黄羽肉鸡脏器指数的影响(mg/g)

由表7可知,与空白对照组相比,LPS和抗生素对脏器指数没有显著影响(P>0.05),不同ACP显著提高了肝脏指数(P<0.05);只有ACP(200mg/kg和400mg/kg)显著提高了胰腺指数(P<0.05),APS和ADP对脏器指数没有显著影响(P>0.05)。与LPS 相比,不同多糖显著提高了肝脏指数和胰腺指数(P<0.05),但只有不同ACP显著提高了法氏囊指数(P<0.05)。与抗生素相比,ACP(200mg/kg和400mg/kg)显著提高了肝脏指数和胰腺指数(P<0.05)。400mg/kg ACP对肝脏指数和胰腺指数显著高于APS和 ADP(P<0.05)。但是,100mg/kg ACP组和200mg/kg ACP组、200mg/kg ACP组和400 mg/kg ACP组间相比对黄羽肉鸡的脏器指数均没有显著差异(P>0.05)。

另取0.50g肝脏于1.50mL离心管,剪碎,-80℃保存,备测下述相关指标。

抗氧化酶和炎症因子的检测

常规制备肝脏组织匀浆,按照体积比加入9倍体积预冷的生理盐水,进行组织匀浆后低温离心(4℃,8000r/min,10min),取上清。利用黄嘌呤氧化酶法测定肝脏中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性;二硫代二硝基苯甲酸(DT-NB)比色法测定肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;铁(Fe)氧化还原法测定肝脏中总抗氧化能力(T-AOC); TBA法测定肝脏中丙二醛(MDA)含量,以上试剂盒购自南京建成生物工程研究所。利用BCA蛋白定量试剂盒(凯基,南京)测定上清中总蛋白浓度;采用放射免疫法测定上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6),所需试剂盒购自北京北方生物技术研究所。以上指标均在多功能酶标仪(Spectra max M-5, molecular devices公司,美国)上读数,各指标具体检测方法和结果计算均按照说明书进行。ACP对LPS应激黄羽肉鸡肝脏抗氧化指标的影响见表8;ACP对LPS应激黄羽肉鸡肝脏炎症因子的影响见表9;

表8 ACP对LPS应激黄羽肉鸡肝脏抗氧化指标的影响

由表8可知,与空白对照组相比,LPS显著降低了黄羽肉鸡肝脏中GSH-Px活性(P <0.05),且显著提高了MDA含量(P<0.05);其他处理对T-SOD活性没有显著影响(P >0.05);400mg/kg ACP显著提高了黄羽肉鸡肝脏中GSH-Px活性(P<0.05);不同ACP 显著提高了肝脏中T-AOC活性(P<0.05);400mg/kg ACP和APS显著降低了肝脏中 MDA含量(P<0.05)。与LPS相比,ACP(200mg/kg和400mg/kg)显著提高了黄羽肉鸡肝脏中T-SOD活性(P<0.05);抗生素和不同多糖均显著提高了黄羽肉鸡肝脏中GSH-Px 和T-AOC活性(P<0.05)。与LPS和抗生素相比,不同多糖均显著降低了肝脏中MDA 含量(P<0.05)。不同ACP组各组间相比对肝脏中T-SOD、GSH-Px和T-AOC活性没有显著影响(P>0.05)。

表9 ACP对LPS应激黄羽肉鸡肝脏炎症因子的影响(ng/g protien)

由表9可知,与空白对照组相比,LPS提高了肝脏炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,其中TNF-α和IL-1β达到显著性差异(P<0.05)。与LPS相比,不同多糖显著降低了黄羽肉鸡肝脏中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达(P<0.05)。与抗生素相比,不同多糖显著降低了黄羽肉鸡肝脏中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达(P<0.05);400mg/kg ACP显著降低了黄羽肉鸡肝脏中炎症因子IL-6的表达(P<0.05)。但不同ACP组各组间相比对肝脏炎症因子TNF-α和IL-1β的表达没有显著影响(P>0.05)。

基因表达检测

总RNA的提取按照Trizol试剂盒说明书进行操作,利用Nano-Drop-2000微量核酸测定仪检测RNA的总浓度和纯度。RNA反转录严格按照试剂盒说明书进行。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应(Bio-Rad CFX System)为20.0μL体系:iTaq Universal SYBR GreenSupermix(Bio-Rad美国)10.0μL,上下游引物(10μmol/L)各1.0μL,cDNA模板2.0μL (10倍稀释),ddH2O 6.0μL,每个样品3个重复孔。从GenBank中获得所测基因的序列取保守区域设计引物,并选用管家基因β-actin基因作为内参基因。所需引物由上海生工生物有限公司合成,引物序列见表10,并用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA相对表达量;结果见图4和图5;

由图4可知,与空白对照组相比,LPS显著提高了TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA 表达丰度(P<0.05),不同多糖有效缓解了LPS对TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达丰度的影响(P<0.05)。其中,不同ACP效果最佳(P<0.05)。但抗生素组和不同多糖组各组间相比对TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达丰度没有显著影响(P>0.05)。

由图5可知,与空白对照组相比,LPS显著提高了肝脏COX2和BAX的mRNA表达丰度(P<0.05),显著降低了肝脏Nrf2和SOD1的mRNA表达丰度(P<0.05)。与LPS 相比,抗生素和不同多糖显著降低了COX2的mRNA表达丰度(P<0.05),并显著提高了SOD1的mRNA表达丰度(P<0.05);不同多糖显著提高了肝脏Nrf2的mRNA表达丰度(P<0.05),抗生素和不同多糖(APS除外)显著降低了肝脏BAX的mRNA表达丰度 (P<0.05)。与抗生素相比,不同多糖对COX2、SOD1和BAX的mRNA表达丰度没有显著影响,但却显著提高了肝脏Nrf2的mRNA表达丰度(P<0.05)。ACP(200mg/kg和 400mg/kg)和ADP对肝脏Nrf2的mRNA表达丰度显著高于APS(P<0.05);不同ACP 对肝脏凋亡基因BAX的mRNA表达丰度显著低于APS组。但不同ACP组各组间相比对肝脏中COX2、Nrf2、SOD1和BAX的mRNA表达丰度没有显著影响(P>0.05)。

表10 qRT-PCR引物序列

上述试验数据均采用SPSS 17.0软件中的one-way ANOVA进行单因素方差分析,在差异显著的基础上进行Duncan氏法多重比较,显著水平为P<0.05。试验结果均用平均值±标准误(mean±S.E.)表示。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物科学研究所

<120> 牛樟芝多糖在制备黄羽肉鸡抗LPS应激饲料中的应用

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtctgaaat tgctgagctc aaat 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgacgttaa gccatggaag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctactgattg ctgctggagt tg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgctatgtg aagaggcgtt gt 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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cattcaacga ggagagctgc 20

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<212> DNA

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ttccttgcag caggaacaac 20

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<212> DNA

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ccaaagacag caggaggaga 20

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<212> DNA

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tggctagttt ctctcgtgca 20

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<212> DNA

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tgcccagcca atgaagag 18

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<212> DNA

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tcatcctgct ctgcctcatc t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gagaaattgt gcgtgacatc a 21

<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cctgaacctc tcattgcca 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtctgaaat tgctgagctc aaat 24

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gcgacgttaa gccatggaag 20

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agcattacca gggctgagtt 20

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tggtaccatg ccagcagtta 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctactgattg ctgctggagt tg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgcaacgata tggctgagag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctgcgattcg gttctggtat 20

<210> 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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gctttctccc gctctttctg 20

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ggtgctcact ttaatcctg 19

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<212> DNA

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tggcgtagac cttgcggata a 21

<210> 33

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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