阅读说明：本技术 一种甘露糖修饰的靶向纳米制剂 (A kind of targeted nano preparation of mannose-modified ) 是由 宋相容 魏于全 于 2019-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种甘露糖及其衍生物修饰的靶向纳米制剂。本发明所解决的技术问题是采用甘露糖及其衍生物修饰纳米制剂,制备得到的纳米制剂,提高了纳米制剂的靶向性,可用于疫苗递送、肿瘤靶向治疗、动脉硬化治疗及各种炎症性疾病等的治疗。(The present invention relates to pharmaceutical technology fields, and in particular to the targeted nano preparation of a kind of mannose and its Derivatives Modified.Technical problem solved by the invention is using mannose and its Derivatives Modified nanometer formulation, the nanometer formulation being prepared, the targeting for improving nanometer formulation can be used for the treatment of vaccine delivery, neoplasm targeted therapy, artery sclerosis treatment and various diseases associated with inflammation etc..)

一种甘露糖修饰的靶向纳米制剂

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种甘露糖修饰的靶向纳米制剂。

背景技术

近年来，基于药物受体介导的靶向药物传递系统已被广泛研究，靶向药物传递系统可提高其特异靶向性，克服药物体内分布广、毒副作用严重的问题。其中，凝集素受体是一类分布于细胞膜表面的糖蛋白、糖脂或糖复合物，能特异性识别并结合部分糖基。甘露糖受体是最重要的高效内吞凝集素受体，其功能包括清除内源性分子、促进抗原呈递、调节细胞激活和运输，其也与肿瘤的免疫逃逸和转移密切相关，主要表达于巨噬细胞，树突细胞和肿瘤细胞，可特异性识别甘露糖糖基分子。甘露糖基作为最有潜力的靶向基团，具有无毒、无免疫原性、生物相容性和生物可降解性良好等诸多优点，可广泛用于对药物传递系统的糖基化修饰。

Liu Ran等(Liu R,Li H,Gao X,et al.mannose-conjugated platinumcomplexes reveals effective tumor targeting mediated by glucose transporter[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,487(1):34-40.)合成了甘露糖修饰的铂复合物，发现其对人结肠癌细胞(HT29)具有更强的抑制作用，能延长白血病小鼠的寿命，但当给药量较大时该复合物具有明显的毒性，且该复合物由于没有长linker(如PEG链)连接导致其体内循环处于相对劣势。曾俊芬等(曾俊芬，黄岭，鲁建武，等.肺靶向羟基喜树碱脂质体的制备及其在小鼠体内的组织分布研究【J】.国医院药学杂志，2016，36(16)：1374-1379.)在制备脂质体的过程中添加了D-甘露糖和十八胺，得到了肺靶向羟基喜树碱脂质体，虽然结果显示在肺部滞留时间较普通注射剂显著延长，其相对摄取率60.72，肺靶向效率17.57，具有一定的肺靶向效果，但这种方法不能保证甘露糖一定暴露在外，与受体结合达到靶向效果，且其脂质体制备过程繁琐，条件不易控制，制备的脂质体粒径偏大，制剂学性质有待进一步优化。宿鹏飞等(宿鹏飞，单强，牛运祺，等.甘露衍生物修饰脂质体的脑靶向研究【J】.齐齐哈尔医学院学报，2015，36(9)：1249-1251.)用甘露糖修饰DSPE-PEG2000，并加入卵磷脂，胆固醇、DSPE-PEG2000，制备了甘露糖修饰的葛根素脂质体，并以鼠源性脑毛细血管内皮细胞BMVEC建立体外BBB模型，建立体内大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)动物模型，也就是先制备好脂质体后加入戊二醛和甘露糖，发现糖基化葛根素脂质体一定程度能够增强药物跨BBB并向梗死区富集，但这种合成方法只能合成一种材料，也不能保证甘露糖一定暴露在外，与受体结合达到靶向效果，且DSPE过于昂贵，难以实现广泛和推广。Wang Ning等(WangN,Wang T,Zhang ML,et al.Mannose derivative and lipid A dually decoratedcationic liposomes as an effective cold chain free oral mucosal vaccineadjuvant-delivery system[J].Eur J Pharm Biopharm,2014,88(1):194-206.)制备了甘露糖修饰的胆固醇，通过PEG1000将两者连接，能保证甘露糖基暴露在外部，与受体结合，但是方法不具有通用性，只能合成一种载体材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米制剂，具体为一种甘露糖及其衍生物修饰的靶向纳米制剂，通过甘露糖及其衍生物的修饰，可以提高所述纳米制剂的靶向性。

为解决上述问题，本发明采用以下方案：

一种甘露糖及其衍生物修饰的靶向纳米制剂，其由靶向配体甘露糖及其衍生物、纳米制剂和主药成分组成，可用于疫苗递送、肿瘤靶向治疗、动脉硬化治疗及各种炎症性疾病等的治疗。所述靶向配体甘露糖及其衍生物与纳米制剂有一定距离，可以保证甘露糖及其衍生物暴露在外，能充分地与受体结合，达到更好的靶向效果(如图13所示)。

进一步，所述靶向配体甘露糖及其衍生物与纳米制剂通过吸附的方式连接，所述主药成分包裹于纳米制剂之中或在纳米制剂表面或半***纳米制剂中。

进一步，所述甘露糖衍生物为甘露糖苷、甘露糖胺、甘露聚糖等中的一种或几种。

具体地，本发明提供的靶向纳米制剂，甘露糖衍生物为甲基-D-甘露糖苷、1-α甲酰甲基-甘露吡喃糖苷、4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷、4-硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃甘露糖苷、甘露糖-6-磷酸、氨基甲酰基-D-甘露糖、甘露糖胺、甘露聚糖等中的一种或几种。

进一步，所述靶向纳米制剂为脂质体、乳剂、纳米凝胶、核壳型纳米粒、HDL纳米粒、固脂纳米粒、聚合物胶束等中的一种或几种。

进一步，所述主药成分为小分子药物、蛋白多肽类药物或基因药物等中的一种或几种。

进一步，所述靶向配体甘露糖及其衍生物与纳米制剂的重量比为0.05％-40％。

较优的，所述靶向配体甘露糖及其衍生物与纳米制剂的重量比为1％-10％。

更优的，所述靶向配体甘露糖及其衍生物与纳米制剂的重量比为2％-5％。

进一步，所述靶向配体甘露糖及其衍生物的修饰方式为：制备纳米制剂之后再将甘露糖及其衍生物吸附到纳米制剂表面。

进一步，所述甘露糖及其衍生物吸附在纳米制剂表面的方式为：采用溶剂挥发法、高压均质法或微乳法制备纳米制剂后，加入含甘露糖及其衍生物的溶液，并在充分的混合过程中，使甘露糖及其衍生物通过分子间作用力或基团间的亲和力等方式吸附在纳米制剂表面。

所述溶剂挥发法是制备微球的一种方法，简单的过程就是，先配置合适浓度的高分子溶液，然后将高分子溶液在连续相乳化，逐渐挥发掉溶剂。在此过程，所述靶向甘露糖及其衍生物便可吸附在纳米制剂表面。

高压均质法是物料在高压下通过均质阀，以极高的流速喷出，撞击碰撞环，通过空穴、撞击、剪切效应使物料超微细化和分散乳化。物料的超微细化使粒径的表面积增大，所述靶向甘露糖及其衍生物通过分子间的作用力和基团间的亲和力便可吸附于表面。

微乳法：用于制备纳米粒子的体系一般是W/O型体系，常由4个组分组成助表面活性剂、表面活性剂、有机溶剂和水溶液。常用的表面活性剂有AOT、SDS、CTAB、TritonX。用作助表面活性剂的仍是中等碳链的脂肪醇，有些体系中可以不加表面活性剂。有机溶剂多为C₆-C₈直链烃或者环烷烃。

微乳法制备超细纳米颗粒的特点在于：离子表面包裹着一层表面活性剂分子，使离子间不易聚结，通过选择不同的表面活性剂分子可对离子的表面进行修饰，并进行控制微粒的大小。在此过程中纳米粒子的粒径的表面积增大，所述靶向甘露糖及其衍生物通过分子间的作用力和基团间的亲和力便可吸附于表面。

进一步，所述修饰纳米制剂的甘露糖及其衍生物为单个甘露糖及其衍生物或2～10个甘露糖及其衍生物，所述甘露糖及其衍生物吸附于纳米制剂的表面，具体为所述单个甘露糖及其衍生物或2～10个甘露糖及其衍生物通过吸附与纳米制剂或纳米制剂材料表面产生一定空间距离。

进一步，制备纳米制剂的材料为具有活性氨基或羟基中的至少一种，药学上可以接受的制备胶束、乳剂、纳米凝胶、核壳型纳米粒、HDL纳米粒、固脂纳米粒、脂质体、聚合物胶束等的载体材料，采用药学上可以接受的纳米制剂制备方法制得。

进一步，所述主药成分小分子药物为可包裹于纳米制剂中用于肿瘤靶向治疗、动脉硬化治疗及各种炎症性疾病等的治疗的功效性小分子。

某些实施例中，将编码特定肿瘤抗原的mRNA可包裹于靶向纳米制剂载体中，再导入体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主免疫系统产生对该肿瘤抗原的免疫应答可实现防治肿瘤的功能，且载有mRNA的靶向纳米制剂具有更好的肿瘤靶向性，有利于肿瘤的治疗。同样将抗肿瘤的化药和生物药、治疗动脉硬化和炎症性疾病的药物也可包裹于靶向纳米制剂载体中，起到更精准的的靶向治疗作用。

进一步，所述靶向配体甘露糖及其衍生物与纳米制剂通过偶联的方式连接，所述主药成分包裹于纳米制剂之中或在纳米制剂表面或半***纳米制剂中。

进一步，所述甘露糖衍生物为甘露糖苷、甘露糖胺、甘露聚糖等中的一种或几种。

具体地，本发明提供的靶向纳米制剂，甘露糖衍生物为甲基-D-甘露糖苷、1-α甲酰甲基-甘露吡喃糖苷、4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷、4-硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃甘露糖苷、甘露糖-6-磷酸、氨基甲酰基-D-甘露糖、甘露糖胺、甘露聚糖等中的一种或几种。

进一步，所述靶向纳米制剂为脂质体、乳剂、纳米凝胶、核壳型纳米粒、HDL纳米粒、固脂纳米粒、聚合物胶束等中的一种或几种。

进一步，所述主药成分为小分子药物、蛋白多肽类药物或基因药物等中的一种或几种。

进一步，所述靶向配体甘露糖及其衍生物与纳米制剂的重量比为0.05％-40％。

较优的，所述靶向配体甘露糖及其衍生物与纳米制剂的重量比为1％-10％。

更优的，所述靶向配体甘露糖及其衍生物与纳米制剂的重量比为2％-5％。

进一步，所述靶向配体甘露糖及其衍生物的修饰方式为：制备纳米制剂之后再将甘露糖及其衍生物偶联到纳米制剂表面；或先将甘露糖及其衍生物与制备纳米制剂的载体材料偶联之后再制备纳米制剂。

进一步，所述修饰纳米制剂的甘露糖及其衍生物为单个甘露糖及其衍生物或2～10个甘露糖及其衍生物，或由单个甘露糖及其衍生物和/或2～10个甘露糖及其衍生物与间隔基连接组成。

进一步，所述甘露糖及其衍生物与纳米制剂或制备纳米制剂的载体材料偶联方式为：直接偶联或通过一个间隔基偶联。

进一步，所述单个甘露糖及其衍生物或2～10个甘露糖及其衍生物的“羟基”或“氨基”端与纳米制剂或纳米制剂材料的“羟基”端或“羧基”端直接偶联，具体为所述单个甘露糖及其衍生物或2～10个甘露糖及其衍生物通过直接偶联于纳米制剂或纳米制剂材料表面产生一定的空间距离。

进一步，所述单个甘露糖及其衍生物或2～10个甘露糖及其衍生物的“羟基”或“氨基”端与间隔基的“羧基”端连接，通过间隔基与纳米制剂或纳米制剂材料的“羟基”端或“羧基”端偶联，具体为所述单个甘露糖及其衍生物或2～10个甘露糖及其衍生物通过间隔基与纳米制剂或纳米制剂材料表面偶联产生一定的空间距离。

进一步，所述间隔基为戊二醛、乙二胺、丙二酸、短链烷基链(比如-CH2-CH2-)、PEG、氨基酸、二肽、寡肽、多肽、硬脂酰、棕榈酰等中的一种或几种。

进一步，所述氨基酸为精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。二肽、寡肤、多肽的两端氨基酸选自以下的氨基酸组成：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；中间氨基酸选自20种任意氨基酸(比如RGD)。

进一步，所述主药成分小分子药物为可包裹于纳米制剂中用于肿瘤靶向治疗、动脉硬化治疗及各种炎症性疾病等的治疗的功效性小分子。

某些实施例中，将编码特定肿瘤抗原的mRNA可包裹于靶向纳米制剂载体中，再导入体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主免疫系统产生对该肿瘤抗原的免疫应答可实现防治肿瘤的功能，且载有mRNA的靶向纳米制剂具有更好的肿瘤靶向性，有利于肿瘤的治疗。同样将抗肿瘤的化药和生物药、治疗动脉硬化和炎症性疾病的药物也可包裹于靶向纳米制剂载体中，起到更精准的的靶向治疗作用。

进一步，制备纳米制剂的材料为具有活性氨基或羟基中的至少一种，药学上可以接受的制备胶束、乳剂、纳米凝胶、核壳型纳米粒、HDL纳米粒、固脂纳米粒、脂质体、聚合物胶束等的载体材料，采用药学上可以接受的纳米制剂制备方法制得。

具体的，载体材料为脂质、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、多聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、透明质酸(HA)、壳聚糖、明胶、泊洛沙姆、硬脂醇等中的一种或几种。具体地，制备脂质体、核壳型纳米粒的脂质材料为胆固醇、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、PC(磷脂酰胆碱)、EPG(卵磷脂酰甘油)、SPG(大豆磷脂酰甘油)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二亚油酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐)(DOTAP)等中的一种或多种。制备固脂纳米粒的固体脂质材料为硬脂酸、胆固醇、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三嵛酸甘油酯、月桂酸甘油酯、甘油棕榈酸硬脂酸脂、二十二酸单甘油酯、二十二烷酸双甘油酯、二十二烷酸三甘油酯、三豆蔻酸甘油酯、枸橼酸甘油酯、十八醇、棕榈酸、豆蔻酸、三嵛酸、月桂酸中的一种或几种。

本发明的有益效果：

1)本发明提供的所述纳米制剂可以保证甘露糖及其甘露糖衍生物暴露在外，能充分地与受体结合，达到更好的靶向效果，可应用于靶向药物的制备；

2)本发明提供的所述纳米制剂显示出良好的廓形，尺寸小，接近球形，有着良好的血清稳定性，细胞毒性小，可适用于药物(化药和生物药)的靶向给药系统，且转染效率显著高于商品化的Lipo 3K，可作为转染试剂使用，应用到科研以及商业中；

3)所述靶向载体的合成方法成本低廉，易于合成，可以进行不同配体链长靶向分子的合成，因此具有通用性，可以合成多种材料，且采用的点击反应有利于纯化和表征。

附图说明

附图1为甘露糖-PEG₁₀₀-Chol核磁验证结果图。

附图2为处方1脂质体的粒径图。

附图3为处方1脂质体的电位图。

附图4为处方1脂质体的TEM图。

附图5为脂质体转染结果。

附图6为荧光显微镜观察DC细胞中GFP的表达情况。

附图7为转染效率分析柱状图。

附图8为甘露糖-PEG₁₀₀₀-Chol的稳定性分析。

附图9为4℃存放下甘露糖-PEG₁₀₀₀-Chol的转染效率。

附图10为甘露糖-PEG₁₀₀₀-Chol在血清中的稳定性分析。

附图11流式细胞术检测甘露糖-PEG₁₀₀₀-Chol和Lipo 3K对于DC细胞的毒性。

附图12流式细胞术检测甘露糖-PEG₁₀₀₀-Chol和Lipo 3K对于DC细胞的毒性的数据统计分析柱状图。

图13为靶向纳米制剂的结构示意图。

图14为DC2.4细胞摄取靶向纳米粒研究。

图15为荧光显微镜观察BMDCs细胞中mRNA靶向脂质体复合物的摄取情况。

图16为荧光显微镜观察BMDCs细胞中mRNA靶向脂质体复合物的摄取情况的数据分析。

具体实施方式

以下实施例进一步描述本发明的制备过程和有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。

针对现有纳米制剂的不足，设计出一种甘露糖及其衍生物修饰的具有靶向性的纳米制剂。

本实施方式中，靶向纳米制剂由靶向配体甘露糖及其衍生物、纳米制剂和主药成分组成。

本实施方式中，靶向配体为甘露糖。

在其他实施方式中，靶向配体可以是甘露糖衍生物，可以是上述的甘露糖苷、甘露糖胺、甘露聚糖等中的一种或几种。具体地，甘露糖衍生物为甲基-D-甘露糖苷、1-α甲酰甲基-甘露吡喃糖苷、4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷、4-硝基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃甘露糖苷、甘露糖-6-磷酸、氨基甲酰基-D-甘露糖、甘露糖胺、甘露聚糖等中的一种或几种。

本实施方式中，纳米制剂为脂质体、HDL纳米粒、固脂纳米粒、聚合物胶束。

在其他实施方式中，纳米制剂可以是乳剂、纳米凝胶、核壳型纳米粒等中的一种或几种。

本实施方式中，纳米制剂包载的主药成分为小分子药物、蛋白多肽类药物或基因药物等中的一种或几种。

本实施方式中，由单个甘露糖及其衍生物和/或2～10个甘露糖及其衍生物修饰纳米制剂。

本实施方式中，靶向配体甘露糖及其衍生物与制备纳米制剂的载体材料偶联之后再制备纳米制剂。

在其他实施方式中，靶向配体甘露糖及其衍生物可以制备纳米制剂之后再将甘露糖及其衍生物吸附或偶联到纳米制剂表面。

本实施方式中，甘露糖及其衍生物与纳米制剂或制备纳米制剂的载体材料通过间隔基PEG偶联。

在其他实施方式中，甘露糖及其衍生物与纳米制剂或制备纳米制剂的载体材料直接偶联或通过其他间隔基偶联，其他间隔基可以是上述的戊二醛、乙二胺、丙二酸、短链烷基链(比如-CH2-CH2-)、PEG、氨基酸、二肽、寡肽、多肽等中的一种或几种。具体地，间隔基氨基酸为精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。二肽、寡肤、多肽的两端氨基酸选自以下的氨基酸组成：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；中间氨基酸选自20种任意氨基酸(比如RGD)。

在本实施方式中，PEG可以是未修饰的双端均为羟基的普通PEG，也可以是至少一端氨基化的PEG，PEG一端连接DSPE、胆固醇、棕榈酸。

在其他实施方式中，PEG一端也可以连接其他上述的具有活性氨基或羟基的，药学上可以接受的制备脂质体、HDL纳米粒、固脂纳米粒、聚合物胶束等的载体材料。具体地，所述载体材料选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、多聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、透明质酸(HA)、壳聚糖、明胶、泊洛沙姆、硬脂醇蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、PC(磷脂酰胆碱)、EPG(卵磷脂酰甘油)、SPG(大豆磷脂酰甘油)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二亚油酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐)(DOTAP)、硬脂酸、胆固醇、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三嵛酸甘油酯、月桂酸甘油酯、甘油棕榈酸硬脂酸脂、二十二酸单甘油酯、二十二烷酸双甘油酯、二十二烷酸三甘油酯、三豆蔻酸甘油酯、枸橼酸甘油酯、十八醇、豆蔻酸、三嵛酸、月桂酸等中的一种或几种。

在本实施方式中，制备的纳米制剂，采用静脉注射、皮下注射的方式送入体内。

在其他实施方式中，制备的纳米制剂，也可以采用腹腔注射、肌肉注射的方式送入体内。

在实施例中所涉及到的mRNA按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件实施得到。

以下为具体实施例。

实施例1载体材料的合成

甘露糖-PEG_n-Chol：以甘露糖-PEG100-Chol合成为例，其他不同长度PEG也按此合成路线合成。取二甘醇、对甲苯磺酰氯与三乙胺，溶于DCM中，室温反应24h，硅胶柱层析分离得产物TosOC₂H₄OC₂H₄OH(式Ⅰ)。取式Ⅰ的化合物与五乙酰化甘露糖和三氟化硼***(BF₃·Et₂O)，溶于DCM中，室温反应24h，硅胶柱层析分离得产物Aco-Mannose-OC₂H₄OC₂H₄OTos(式Ⅱ)。取式Ⅱ的化合物与叠氮钠，溶于DMF中，60℃反应24h，硅胶柱层析分离得固体产物Aco-Mannose-OC₂H₄OC₂H₄N₃(式Ⅲ)。取式Ⅲ的化合物溶于甲醇钠的甲醇溶液中，室温反应3h，浓缩得产物Mannose-OC₂H₄OC₂H₄N₃(式Ⅳ)。取胆固醇、溴丙炔和钠氢溶于***和DMF的混合溶液中，室温反应24h，硅胶柱层析分离得固体产物Chol-CH₂CCH(式Ⅴ)。取式Ⅳ的化合物、式Ⅴ的化合物和碘化亚铜溶于DMF中，室温反应24h，硅胶柱层析得到固体产物Mannose-Chol(式Ⅵ)。分析图1中各特征氢质子的化学位移δ(ppm)：5.30-5.42ppm(1个)分别为胆固醇中＝CH-氢的位移；7.92ppm(1个)为N-CH＝C中氢的位移，这些特征峰的存在，说明化合物式Ⅳ连接到化合物式Ⅴ片段上，通过¹H-NMR核磁结果可知甘露糖-PEG₁₀₀-Chol已经成功偶联，具体见图1。

甘露糖-PEG2000-DSPE：DSPE-PEG200-NH₂可以直接购买，称取5mg甘露糖，加入5ml乙醇使溶解。称取5mg DSPE-PEG-NH₂，溶于5ml氯仿-乙醇的混合溶剂(9:1，V/V)，在氮气保护条件下，滴加入0.5ml甘露糖的乙醇溶液，搅拌混匀后，加入100μl三乙胺，于40℃搅拌反应12h。反应结束后，减压旋蒸除去有机溶剂，加入去离子水使复溶，透析，除去未反应的甘露糖，冷冻干燥即得产物甘露糖-PEG2000-DSPE。

甘露糖-PEG2000-棕榈酸的合成：FmocNH-PEG-COOH溶于水，加入EDC·HCl和sulfo-NHS,室温搅拌10分钟，2-氨基乙基-α-D-吡喃甘露糖苷水溶解后加入上述反应体系中，室温反应48h，硅胶柱层析分离得产物(如式Ⅰ所示)。将化合物1溶于DCM，加入1-辛二醇，反应数小时，硅胶柱层析分离得产物(如式Ⅱ所示)。将化合物2与棕榈酸加入***和DMF的混合溶剂中，室温反应数小时，硅胶柱层析分离得固体产物甘露糖-PEG2000-棕榈酸，其结构式为

实施例2脂质体的制备

处方组成

注：处方1～处方5的主药为GFP-mRNA。

制备方法1：按上述处方称取不同重量配比的磷脂(主药为PTX时，与磷脂一同加入)，加入圆底烧瓶中，加入氯仿/乙醇＝1:1(v/v)溶解后，减压旋蒸去除有机溶剂，在瓶内壁形成一层薄膜，加入PBS7.4缓冲溶液水化，100W超声3min，得到脂质体。包裹pGFP时，可以将空白脂质体与pGFP在室温孵育得到，由甘露糖-PEG1000-Chol得到的纳米粒可记为MP1000-LPX。对得到的脂质体进行表征，结果显示脂质体的粒径大小为132.93±4.93nm、zeta电势为37.93±2.95mV，并观察到脂质体具有明显的脂膜结构，形状接近球形(图2-4)。

制备方法2(处方8)：按上述处方称取不同配比的磷脂，加入氯仿/***使溶解，再加入白蛋白的水溶液，超声得到乳浊液，旋蒸除尽有机溶剂，再加入PBS7.4缓冲液重新水化脂质体。

制备方法3：按上述处方称取不同配比的磷脂，加入圆底烧瓶中，加入氯仿/乙醇＝1:1(v/v)溶解后，减压旋蒸去除有机溶剂，在瓶内壁形成一层薄膜，加入含有靶向配体甘露糖及其衍生物的PBS(pH＝5.6)，37℃条件下旋转水合，将上述胶体溶液置-20℃冰箱冷冻，之后反复冻融3次即得以吸附方式连接的甘露糖修饰的纳米靶向制剂。

实施例3固脂纳米粒的制备

固体脂质纳米粒是以脂质为骨架材料制备而成的纳米结构载体，具有生理相容性、细胞亲和性、靶向性等特点。本实施例中，加入经甘露糖修饰的脂质，提高了固体脂质纳米粒的靶向性。

处方组成

制备方法：精密称取处方量的药物、脂质材料溶于乙醇中，恒温水浴搅拌形成油相；称取处方量的表面活性剂溶于纯净水中，恒温水浴加热形成水相；在搅拌条件下，将油相注入水相中，恒温搅拌乳化浓缩，乳化液浓缩到一定体积后，将其倾入恒温4℃冷水中搅拌固化，过0.45μm滤膜即得。

实施例4 HDL纳米粒的制备

HDL是一类组成、密度、颗粒大小不均一的脂蛋白。HDL中含量最多的载脂蛋白是ApoA-I，其疏水性的内核在体内运输胆固醇。重组高密度脂蛋白有内源性分离或体外合成的ApoA-I与磷脂、胆固醇等在体外重组形成，在生化特性和功能上与内源性HDL类似。高密度脂蛋白具有许多优良的特性：具有高度的安全性，高效的运载性(能够以三种方式载药：核心包埋，及亲脂性药物包埋与重组高密度脂蛋白的核心内；表面嵌入，及亲脂性药物***到磷脂单层中；蛋白键和)，靶向性。本实施例中，制备的HDL纳米粒中加入了甘露糖配体，进一步提高了纳米粒的靶向性。

处方组成

制备方法：与脂质体的制备方法类似，适用于制备脂质体的方法均可以用于HDL纳米粒的制备。

制备方法1：按上述处方称取不同配比的磷脂(脂溶性的主药DOX同时加入)，加入圆底烧瓶中，加入氯仿溶解后，减压旋蒸去除有机溶剂，在瓶内壁形成一层薄膜，加入PBS7.4缓冲溶液水化，100W超声3min，得到脂质体。称取处方量ApoA-I缓慢加入脂质体混悬液中，4℃静置孵育24h，再透析即得。

制备方法2：按上述处方称取不同配比的磷脂，加入圆底烧瓶中，加入氯仿溶解后，减压旋蒸去除有机溶剂，在瓶内壁形成一层薄膜，加入PLGA/PTX的纳米粒混悬液，100W超声3min，得到脂质体。称取处方量ApoA-I缓慢加入脂质体混悬液中，4℃静置孵育24h，再透析即得。

实施例5聚合物胶束的制备

处方组成

制备方法：取载体材料和主药溶于氯仿(根据溶解情况可以选择其他溶剂，如乙醇，或乙醇与氯仿的混合溶剂)，减压旋蒸去除有机溶剂，在瓶内壁形成一层薄膜，加入PBS7.4缓冲溶液水化，即得。

实施例6靶向纳米粒的摄取实验

转染前12小时，将平皿中Raw264.7细胞吹散，培养基重悬，计数，在24孔板的每个孔中接入1mL细胞悬液，密度为10×10⁴个/mL，于培养箱中孵育约12小时，备用。弃掉培养基，向各孔中分别加入终浓度为100ng/mL的脂多糖(LPS)，于37℃孵育约12小时刺激巨噬细胞。弃掉培养基，向各孔中分别加入终浓度为25ng/mL的不同制剂(实施例1-5的处方均已展开了实验，这里以处方1和处方3为例)，于37℃避光孵育约2小时，考察巨噬细胞对不同制剂的摄取情况。到达孵育时间点后，弃去培养基，并以冷的PBS洗2次；PBS收集24孔板中细胞，再以PBS洗细胞一次(1200rpm、5min)，最后置于流式细胞仪中分析结果。结果见图5，其从左到右分别为：Control，处方3，处方1。可见，加入了靶向配体甘露糖-PEG1000-Chol后，能显著增加细胞的转染效率。

实施例7纳米靶向制剂的转染效率

将DC2.4细胞与制备好的纳米靶向制剂在24孔板中同共孵育，其中纳米靶向制剂的N/P比为5。采用流式细胞术检测GFP阳性的DC2.4细胞的转染效率与平均荧光强度(MFI)。简而言之，DC2.4细胞是通过正向散射(FSC)和侧散射(SSC)捕获的。存活的DC2.4细胞显示在区域1(R1)，GFP阳性细胞显示在区域2(R2)。转染效率自动显示在R2。获得GFP阳性细胞中GFP表达的MFI使用FlowJo软件。计算MFI需要扣除未处理DC2.4细胞的背景值。进一步详细了解主药mRNA的体外转染动力学，所述甘露糖-PEG1000-Chol在DC2.4细胞上的转染效率在12～72h的表达也得到证实。

如图6和图7所示，甘露糖-PEG1000-Chol组诱导的GFP阳性细胞最多，比例高达52％，明显高于任何其他组别，通过计算得出甘露糖-PEG1000-Chol的转染效率为52.09±4.85％，远远超过商业使用的转染试剂Lipo 3K(11.47±2.31％)。

实施例8稳定性测试

对甘露糖-PEG1000-Chol修饰的纳米靶向制剂进行了稳定性研究，其稳定性由粒径大小、zeta电势和转染效率共同决定。结果显示，甘露糖-PEG1000-Chol修饰的纳米靶向制剂储存与4℃，甘露糖-PEG1000-Chol修饰的纳米靶向制剂的颗粒尺寸略有减小，但zeta电位没有减小(图8)，在4℃条件下保存3天，转染效率约为50％(图9)，其数据详见下表。同样在血清中，甘露糖-PEG1000-Chol孵育的mRNA未解离(图10)，同样，甘露糖-PEG100-Chol和甘露糖-PEG2000-Chol修饰的纳米靶向制剂同样具有良好的稳定性。

甘露糖-PEG1000-Chol修饰的纳米靶向制剂转染稳定性测试结果

实施例9细胞毒性实验

采用指定配方孵育24h以后，采用流式细胞术进行细胞毒性分析。其结果如图11-12所示，对照组、甘露糖-PEG1000-Chol组和Lipo 3K组的活细胞率分别为86.7±3.6％、86.7±1.7％和90.1±1.2％，早期和晚期凋亡无明显差异，总体来说表现良好，无明显细胞毒性，其数据详见下表。

细胞毒性试验结果

实施例10 DC2.4摄取靶向纳米粒研究

转染前12小时，将平皿中DC2.4细胞细胞吹散，培养基重悬，计数，在24孔板的每个孔中接入1mL细胞悬液，密度为10×10⁴个/mL，于培养箱中孵育约12小时，备用。弃掉培养基，向各孔中分别加入终浓度为100ng/mL的脂多糖(LPS)，分别于37℃和4℃孵育约12小时刺激DC2.4细胞。弃掉培养基，向各孔中分别加入终浓度为25ng/mL的不同制剂(LPX和MP₁₀₀₀-LPX)，分别于37℃和4℃避光孵育约2小时，考察DC2.4细胞在不同温度、不同制剂下的摄取情况。到达孵育时间点后，弃去培养基，并以冷的PBS洗2次；PBS收集24孔板中细胞，再以PBS洗细胞一次(1200rpm、5min)，最后置于流式细胞仪中分析结果。

结果如图14所示，不论是mRNA普通脂质体复合物还是mRNA靶向脂质体复合物，当摄取温度由37℃降低到4℃时，摄取均降低，提示DC2.4细胞对mRNA脂质体复合物的摄取存在能量依赖性，即随着温度降低，摄取降低。对比37℃的数据可以看出，DC2.4细胞可以更多的摄取mRNA靶向脂质体复合物，对比是否加入甘露糖的摄取数据可以看出，加入甘露糖后细胞对mRNA普通脂质体复合物的摄取无明细变化，而加入甘露糖后细胞对mRNA靶向脂质体复合物的摄取显著降低，说明DC2.4细胞更多的摄取mRNA靶向脂质体复合物主要时因为甘露糖受体介导的，相对应的数据结果详见下表。

DC2.4摄取试验结果

实施例11 BMDCs细胞摄取靶向纳米粒研究

转染前12小时，将平皿中BMDCs细胞吹散，培养基重悬，计数，在24孔板的每个孔中接入1mL细胞悬液，密度为10×10⁴个/mL，于培养箱中孵育约12小时，备用。弃掉培养基，向各孔中分别加入终浓度为100ng/mL的脂多糖(LPS)，分别于37℃和4℃孵育约12小时刺激BMDCs细胞。弃掉培养基，37℃培养的细胞分为对照组、细胞松弛素D组、菲律平组、渥曼青霉素组和氯丙嗪组，并向各组中分别加入终浓度为25ng/mL的MP₁₀₀₀-LPX；在4℃孵育的细胞中加入MP₁₀₀₀-LPX，以上分组分别于37℃和4℃避光孵育约2小时，考察BMDCs细胞在不同温度、不同药物作用下的摄取情况。到达孵育时间点后，弃去培养基，并以冷的PBS洗2次；PBS收集24孔板中细胞，再以PBS洗细胞一次(1200rpm、5min)，最后置于流式细胞仪中分析结果。

如图15-16所示，当摄取温度由37℃降低到4℃时，摄取降低，提示BMDCs对mRNA靶向脂质体复合物的摄取存在能量依赖性，即随着温度降低，摄取降低，此数据与DC2.4结果吻合。对比是否加入内吞抑制剂的摄取数据可以看出，加入细胞松弛素D和菲律平后细胞对mRNA靶向脂质体复合物的摄取无明显变化，而加入渥曼青霉素和氯丙嗪后细胞对mRNA靶向脂质体复合物的摄取均显著降低，说明BMDCs摄取mRNA靶向脂质体复合物除了具有能量依赖性还受胞饮(渥曼青霉素)和网格蛋白(氯丙嗪)介导内吞的影响，相关结果详见下表。

试验条件	摄取结果(×10<sup>4</sup>)
		Control	2.52±0.16
Cytochalasin-D	2.73±0.15
		Filipin	2.61±0.15
4°	1.29±0.25
		Wortmannin	1.47±0.17
Chloropromazine	0.42±0.10

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。