一种原位肝移植免疫耐受诱导方案的构建方法
阅读说明：本技术 一种原位肝移植免疫耐受诱导方案的构建方法 (Construction method of in-situ liver transplantation immune tolerance induction scheme ) 是由 周绍棠 陈国勇 刘方洲 汤高枫 赵会博 魏思东 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种原位肝移植免疫耐受方案及其动物模型的构建方法。其所述动物模型设计巧妙、合理、重复性好,符合大鼠原位肝移植术要求,和人肝移植相似。术后存活率高,重复性好,耐受率高达100％,在术后经肝功能检测,病理分析证实。能有效解决研究目标和肝移植完整复制过程所涉及时间久、死亡率高、人员和显微技术要求高等问题。同时可延伸到其他供-受体不同组合的耐受诱导的基础研究。(The invention discloses an in-situ liver transplantation immune tolerance scheme and a construction method of an animal model thereof. The animal model is ingenious and reasonable in design and good in repeatability, meets the requirements of rat orthotopic liver transplantation and is similar to human liver transplantation. The survival rate after operation is high, the repeatability is good, the tolerance rate is up to 100 percent, and the liver function detection and the pathological analysis after operation prove that. Can effectively solve the problems of long time, high death rate, high requirements on personnel and microtechnology, and the like in the complete replication process of research targets and liver transplantation. While extending to other basic studies of tolerance induction for different combinations of donor-receptor.)
技术领域
本发明涉及动物模型构建技术及其耐受诱导方案，具体是指原位肝移植术的动物模型的构建方法和免疫耐受诱导方案确定。
背景技术
肝移植是公认的治疗终末期肝病的唯一有效手段，但大数据研究结果报道肝移植受者长期生存几乎未有进展。病人未有更好长期生存(2年或以上生存率)收益。主要原因就是长期使用免疫抑制剂，免疫抑制剂的终生使用带来一系列并发症：肾功能不全发生于25％的受者；神经毒10％and 30％的受者；糖尿病9-18％；20-33％肾、26-40％肝、29％肺受者发生心血管疾病；移植的第4位死亡原因为感染，发生于2/3的受者；新生肿瘤11倍于常人，消化系疾病：12％受者，高脂血症：46％受者，血液系疾病：30％受者；发育、生活质量欠满意，经济耗费巨大：若一个肝移植受者生存15年，每年则花费6-7万，总计100万以上。耐受方案实施应用于人类，不仅可以大大减少前述相关并发症，还可以免除巨额费用100万元/人，中国每年肝移植例数为5000人次，每年节省费用总计50亿元。全世界肝移植每年约20000人，则总计约200亿，一肝二受，理论上移植受者增加一倍，则为400亿。
免疫(移植)耐受是指在完全停用免疫抑制剂情况下，移植物功能良好，无病理证实的慢性排斥反应(Banff标准)。对人类器官移植，该状态保持至少1年。对大鼠，4-6月即可。诱导器官移植耐受，被称为该领域的另一个圣杯。方法归纳为：1)T细胞的清除；2)共刺激通路的阻断；3)混合嵌合体的诱导；4)提高调节性T细胞。上述方案针对受体免疫系统进行干预，副作用极大。目前方案集中于供者特异性免疫无反应和持续的混和嵌合体维持。
目前通用的耐受模型采用全肝移植物，但世界范围都没有临床应用的方案。
因此，一种用于研究肝移植免疫耐受的方案，亟待研究解决。
发明内容
寻找用于研究和可能临床应用的免疫耐受方案是器官移植领域的最重要目标。为解决这个问题，我们从供体移植物着手，发明构建免疫耐受的新模型、新方案。其构建方法，包括以下步骤：
供体手术
(1)：选取在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下，饲养的体重为200～350g的SPF级大鼠(SD，Lewis)，手术前禁食12小时，但不禁水；
(2)：选取体重相差不大于30g大鼠作供体，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部剔毛，消毒；
(3)：将大鼠仰卧位固定于手术台，持续吸入异氟醚维持麻醉，横行切口打开大鼠腹腔，牵拉剑突暴露肝脏；
(4)：将肠管牵出腹腔左侧，并用湿纱布包裹肠道，游离右肾静脉水平下的腹主动脉；
(5)：暴露腹腔干上的腹主动脉，用血管夹阻断它；
(6)：用1号针头穿刺右肾静脉水平下的腹主动脉推注含低分子肝素625IU/Kg的生理盐水5ml，全身肝素化，逆行灌注肝脏；
(7)：在肠系膜上静脉剪一斜口，推注10ml乳酸林格氏液，再次灌注肝脏，剪开肾静脉水平下的下腔静脉放血至供体大鼠死亡，停止麻醉，多次向肝脏浇注0-40℃的生理盐水，防止肝脏复温；
(8)：结扎肠系膜上静脉分支和脾静脉，游离出肠系膜上静脉。游离腹腔干，结扎脾动脉，胃左动脉。保留肝外胆管5mm处，插入支撑管入胆道并固定。一并结扎幽门静脉和胃十二指肠动脉。游离并结扎左、右肾上腺静脉，用10-0丝线结扎右肾静脉，在左肾静脉水平切断下腔静脉；
(9)逆时针分离肝脏周围组织，紧贴肝脏结扎左膈下静脉，紧贴膈肌切断肝静脉，移出供肝，置入0-4℃的乳酸林格氏液；在后台，在门静脉和下腔静脉分别套上袖套管，如半肝(50％)移植物，结扎并剪除肝左叶，尾状叶，中叶的左半部分。如70％移植物，结扎并剪除肝左叶。
受体手术
(1)选取在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下，饲养的体重为200～350g的SPF级大鼠(BN，Lewis)，手术前禁食12小时，但不禁水；
(2)选取体重相差不大于30g大鼠作受体，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部剔毛，消毒；
(3)将大鼠仰卧位固定于手术台，持续吸入异氟醚维持麻醉，中间纵向切口打开大鼠腹腔，牵拉剑突暴露肝脏；左右肋弓用自制回形针拉钩牵拉；
(4)自肝胃韧带逆时针分离切断肝周组织，近膈肌结扎左膈下静脉，结扎左、右肾上腺静脉，骨骼化下腔静脉至右肾静脉水平，结扎肝固有动脉，在胆总管近端切断，用蚊式钳钳夹膈肌环，血管夹分别阻断门静脉，下腔静脉，切断门静脉，肝下下腔静脉，肝上下腔静脉，移出受体原肝；停止吸入异氟醚；
(5)原位放置供肝，一点法，自左向右用8-0血管线缝和肝上下腔静脉后壁，前壁，移出蚊式钳，换用哈巴狗血管夹阻断肝上下腔静脉。袖套管法连接门静脉后，移去门静脉血管夹，肝上下腔静脉蚊式钳恢复门静脉血流。袖套管法连接下腔静脉，恢复血流，经阴茎背静脉注射10ml生理盐水，帮助恢复血循环。在门静脉右侧，血管夹阻断肝总动脉，结扎胃十二指肠动脉，在肝总动脉用剪刀剪出斜口，将供肝动脉`血管支撑管插入肝总动脉，结扎固定后开放，恢复肝动脉血流，同法，连接胆道；
(6)用5-0线连续缝合正中切口后，涂上利多卡因胶浆减轻疼痛，间断缝合皮肤层。术中给予环孢素4mg/kg，皮下注射，腹腔注射头孢唑肟钠1.2ml。
(7)手术后，麻醉清醒后以红外线灯非直接照射大鼠保暖12小时，在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下继续饲养，观察大鼠的生存情况；
(8)术后实验组皮下注射粒细胞集落刺激因子100u/kg，一天一次，共5次；皮下注射头孢唑肟钠100mg/kg，一天一次，共3次；环孢素4mg/kg，一天一次，共9次。对照组皮下注射头孢唑肟钠100mg/kg，一天一次，共3次；环孢素4mg/kg，一天一次，共9次；
每天观察大鼠活动，饮水，尿量，尿色，伤口等。
采用以上方法后，本发明具有如下优点：本发明设计合理、巧妙，50％肝移植模型，临床广泛采用。操作简单、重复性好，很好地模拟临床，符合大鼠原位肝移植术后免疫耐受特点：肝移植物功能正常，移植物没有急性，慢性排斥反应，结构正常。存活率高。耐受率100％。能有效解决现有研究目标必须完整复制肝移植过程的时间久、死亡率高、人员技术要求高；以及耐受方案的有效性、简单性、重复性、操作性等问题。
附图说明
图1A，B，C是全肝移植物和植入后(对照组1)。
图1D，E，F是半肝移植物处理和植入后((对照组2，耐受组)。
图2是本发明的大鼠原位肝移植术后免疫耐受大鼠生存情况。将移植物出现慢性排斥反应或相关死亡，并经病理证实记为生存终点，计算从移植术至生存终点为生存时间。
图3是大鼠原位肝移植术后3组实验大鼠的肝功能情况。
图4是本发明的大鼠原位肝移植术后免疫耐受移植物HE染色对比图。
具体实施方式
实施例一：肝移植术
供体手术
(1)：选取在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下，饲养的体重为200～350g的SPF级大鼠(SD，Lewis)，手术前禁食12小时，但不禁水；
(2)：选取体重相差不大于30g大鼠作供体，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部剔毛，消毒；
(3)：将大鼠仰卧位固定于手术台，持续吸入异氟醚维持麻醉，横行切口打开大鼠腹腔，牵拉剑突暴露肝脏；
(4)：将肠管牵出腹腔左侧，并用湿纱布肠道，游离右肾静脉水平下的腹主动脉；
(5)：暴露腹腔干上的腹主动脉，用血管夹阻断它；
(6)：用1号针头穿刺右肾静脉水平下的腹主动脉推注含低分子肝素625IU/Kg的生理盐水5ml，全身肝素化，逆行灌注肝脏；
(7)：在肠系膜上静脉剪一斜口，推注10ml乳酸林格氏液，再次灌注肝脏，剪开肾静脉水平下的下腔静脉放血至供体大鼠死亡，停止麻醉，多次向肝脏浇注0-4℃的生理盐水，防止肝脏复温；
(8)：结扎肠系膜上静脉分支和脾静脉，游离出肠系膜上静脉。游离腹腔干，结扎脾动脉，胃左动脉，保留肝外胆管5mm处，插入支撑管入胆道并结扎固定。一并结扎幽门静脉和胃十二指肠动脉。游离并结扎左、右肾上腺静脉，用10-0丝线结扎右肾静脉，在左肾静脉水平切断下腔静脉；
(9)逆时针分离肝脏周围组织，紧贴肝脏结扎左膈下静脉，紧贴膈肌切断肝静脉，移出供肝，置入0-40C的乳酸林格氏液；在后台上，在门静脉和下腔静脉分别套上袖套管，如半肝(50％)移植物，结扎并剪除肝左叶，尾状叶，中叶的左半部分。如70％移植物，结扎并剪除肝左叶。
表1.研究分组，处理及结果。环孢素：CSA；促粒细胞集落刺激因子：GSF
受体手术
(1)选取在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下，饲养的体重为200～350g的SPF级大鼠(BN，Lewis)，手术前禁食12小时，但不禁水；
(2)选取体重相差不大于30g大鼠作受体，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部剔毛，消毒；
(3)将大鼠仰卧位固定于手术台，持续吸入异氟醚维持麻醉，中间纵向切口打开大鼠腹腔，牵拉剑突暴露肝脏；左右肋弓用回形针自制拉钩牵拉；
(4)自肝胃韧带逆时针分离切断肝周组织，近膈肌结扎左膈下静脉，结扎左右肾上腺静脉，骨骼化下腔静脉至右肾静脉水平，结扎肝固有动脉，在胆总管近端切断，用蚊式钳钳夹膈肌环，血管夹分别阻断门静脉，下腔静脉，近肝切断肝上下腔静脉，肝下下腔静脉，门静脉，移出受体原肝；停止吸入异氟醚；
(5)原位放置供肝，一点法，自左向右用8-0血管线缝和肝上下腔静脉后壁，前壁，移出蚊式钳，换用哈巴狗血管夹阻断肝上下腔静脉。袖套管法连接门静脉后，移去门静脉血管夹，肝上下腔静脉蚊式钳恢复门静脉血流。袖套管法连接下腔静脉，恢复血流，经阴茎背静脉注射10ml生理盐水，帮助恢复血循环。在门静脉右侧，血管夹阻断肝总动脉，结扎胃十二指肠动脉，在肝总动脉用剪刀剪出斜口，将供肝动脉`血管支撑管插入肝总动脉，结扎固定后开放，恢复肝动脉血流，同法，连接胆道；
(6)用4-0线连续缝合正中切口后，涂上利多卡因胶浆减轻疼痛，间断缝合皮肤层。
(7)手术后，麻醉清醒预以红外线灯非直接照射大鼠保暖12小时，在室温22±2℃、湿度50±10％的情况下继续饲养，观察大鼠的生存情况；
(8)术后实验组皮下注射粒细胞集落刺激因子100u/kg，一天一次，共5次；皮下注射头孢唑肟钠100mg/kg，一天一次，共3次；环孢素4mg/kg，一天一次，共9次。对照组皮下注射头孢唑肟钠100mg/kg，一天一次，共3次；环孢素4mg/kg，一天一次，共9次(表1)。
(9)每天观察大鼠活动、饮水、尿量、尿色、伤口等。
实施例二
1、实验材料：肝移植术后的移植大鼠、异氟醚，手术器械一套等；
2、制备方法：
(1)：选取在室温25±2℃、湿度50±10％的情况下饲养的移植大鼠；
(2)：对受体鼠称重，分为全肝对照组(6只)、半肝对照组(6只)、实验组(16只)，对大鼠进行异氟醚吸入麻醉并腹部消毒；
(3)：在大鼠正中切口打开大鼠腹腔，将肠管向左外牵拉，暴露腹主动脉，插入采血针入主动脉并连接至含EDTA抗凝剂的试管中，上下倒立几次，防止血液凝固；
(4)：将离心机转速调至2000，离心10分钟；
(5)：将血清转至冻存管，标记标本。
(6)经肠系膜静脉用生理盐水灌注肝脏后，游离肝周组织，获取肝脏标本，浸泡在4％中性多聚甲醛液体中。
(7)在全自动生化仪上设置好相应参数。血浆上样。全自动生化仪自动测定并输出结果。
实施例三
(1)固定组织切割
将组织从固定液中取出，在通风橱内用手术刀进行切割，组织厚度3mm左右。将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内；
(2)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 20min-二甲苯II 20min-无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-75％酒精5min，自来水洗；
(3)、苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；
(4)伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min；
(5)脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-无水乙醇III5min-二甲I 5min-二甲苯II 5min透明，中性树胶封片；
(6)显微镜镜检，图像采集分析。
三、结果判读：
细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。
图4A，B.全肝移植物(对照组)。肝组织内可见多数门管区内均可见少数淋巴细胞浸润以及个别门管区内轻微的小叶间胆管炎，同时可见肝小叶的部分肝窦内淋巴细胞淤积浸润，提示非常轻微的、或疑为急性排斥反应；与此同时可见部分门管区内少许假胆管增生表现，提示肝组织非常的缺血损伤因素所致门管区内极少许假胆管增生表现。总体来看其急性排斥反应程度也很轻微，如果按照人体移植肝急性排斥反应计分RAI(排斥反应活性指数Rejection activity index＝2)即疑为急性排斥反应或不确定性急性排斥反应。
图4C，D.半肝移植物(对照组)。可见肝组织门管区内有较多淋巴细胞浸润，并可见纤维组织和假胆管轻度增生部分增生纤维组织向临近门管区及肝组织内延伸致局部肝组织结构轻微紊乱，但未见进一步的假小叶形成。
图4E，F.耐受组(实验组)。肝小叶结构规则，门管区内未见明显淋巴细胞浸润，小叶间胆管结构存在且良好，肝细胞未见任何水肿、坏死和淤胆表现。
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