阅读说明：本技术 一种脉冲电场强化超声辅助提取红曲色素工艺方法 (A kind of impulse electric field reinforcing ultrasound assisted extraction monascorubin process ) 是由 何毅 刘志伟 李明 杨宁 何丽丽 于 2019-09-06 设计创作，主要内容包括：本文发明采用脉冲电场强化超声辅助法对液态发酵的红曲霉菌体中的红曲色素进行提取,并提供一种有效提取红曲霉色素提供最佳工艺条件,其中乙醇与菌丝体的料液比为3：1(g/L),脉冲电场的电场强度为500 V/cm,脉冲温度为60℃下脉冲3次处理,然后在超声功率为390 W,超声温度为60℃,超声时间为30 min的条件下处理,测得红曲色素的黄色素色价为439.8 U/g,橙色素色价为229.3 U/g,红色素色价为350.4 U/g,总色价为519.5 U/g。与传统的乙醇溶液浸提法相比,脉冲强化超声辅助提取红曲色素的效果提高了85.2%。(Invention herein is strengthened ultrasonic wave added method using impulse electric field and is extracted to the monascorubin in the monascus thallus of liquid state fermentation, and provide a kind of effectively extraction Monascouruarin offer optimum process condition, wherein ethyl alcohol and mycelial solid-liquid ratio are 3:1(g/L), the electric field strength of impulse electric field is 500 V/cm, pulse temperature is pulse 3 times processing at 60 DEG C, it then is 390 W in ultrasonic power, ultrasonic temperature is 60 DEG C, ultrasonic time is handled under conditions of being 30 min, the uranidin color value for measuring monascorubin is 439.8 U/g, citraurin color value is 229.3 U/g, haematochrome color value is 350.4 U/g, total color value is 519.5 U/g.Compared with traditional ethanol solution extraction, the effect that ultrasound assisted extraction monascorubin is strengthened in pulse improves 85.2%.)

一种脉冲电场强化超声辅助提取红曲色素工艺方法

技术领域

本发明涉及一种色素提取方法，具体涉及一种脉冲电场强化超声辅助提取红曲色素工艺方法。

背景技术

红曲霉菌是一种丝状真菌，菌丝有横隔且多核，菌体分支很多，在它的生长过程中，颜色会从无色变成***。

几千年之前我国的人民就开始使用红曲霉菌来生产红曲了。红曲霉色素既可以当食物也可以当药物，红曲霉色素可以替代一些传统的食品添加剂，类似于亚硝酸盐或者胭脂红之类。很久之前，酱油还没有被研究出来的时候，红曲则被古人用来制作红烧肉之类的颜色为红色的食品。红曲霉色素是一种通过微生物发酵生产的天然色素，与工业化学合成色素相比，它不受严格的安全性限制，具有广泛的适用^]。

红曲霉菌能给人类提供很大的食用或者药用价值。到今天为止科学家们已经发现了约二百种的红曲菌株，其中有四分之一的菌株可以用来进行发酵。因为红曲霉菌产生的色素是纯天然、并且可以食用的，人们潜意识的认为它比化学染色剂更安全，所以更多的人会选择这样一种天然色素用于食品加工之中。由于红曲霉菌的经济价值在不断地增大，如何能够最大限度的开发与利用它也成了国内外许多研究学者的科研项目。

红曲色素作为一种天然的色素染料是红曲霉菌经过一段时间的发酵后得到的，它是红色调和黄色调的混合色素，营养价值和生物活性都很高，并且是天然可食用色素，科学家们逐渐研究到红曲色素可以在肉制品中代替硝酸盐类。红曲色素属于聚酮类化合物，据了解，人类了解并分析出结构的红曲色素组分大约有九十种，红曲色素主要成分为红曲红色素、红曲橙色素、红曲黄色素等。红曲色素符合国际食品色素法中安全、营养、多功能的发展方向，并且有广泛的应用范围以及长远的发展前景。

目前对红曲色素的提取主要是采用溶剂浸提法，该方法存在时间长、溶剂需求量大、提取率很低等缺点，并且产品为红曲混合色素。溶剂浸提法大多数是研究如何提高色素总体提取率及色价，如果采用的溶剂浸提条件不同，红曲色素中不同组分的提取效果也会不同，结果导致提取的红曲色素组分有很大差异。因此，为了达到红曲色素产品的质量标准，分离和开发不同成分和色调的红曲色素，进一步研究和探索新的提取红曲色素的方法是很有必要的。

发明内容

发明目的：本文发明采用脉冲电场强化超声辅助法对液态发酵的红曲霉菌体中的红曲色素进行提取，并研究了脉冲电场强化超声辅助提取红曲霉菌体中的红曲色素的影响因素和提取工艺参数，为有效提取红曲霉色素提供最佳工艺条件。本发明主要一种脉冲电场强化超声辅助提取红曲色素工艺方法，主要采用脉冲电场强化超声辅助法对液态发酵的红曲霉菌体中的红曲色素进行提取。其中乙醇与菌丝体的料液比为1-5：1-5（g/L），脉冲电场的电场强度为300-700 V/cm，脉冲温度为40-80 ℃下脉冲1-5次处理，然后在超声功率为250-500 W，超声温度为40-80 ℃，超声时间为20-40 min的条件下处理。优选地，乙醇与菌丝体的料液比为3：1（g/L），脉冲电场的电场强度为500 V/cm，脉冲温度为60 ℃下脉冲3次处理，然后在超声功率为390 W，超声温度为60 ℃，超声时间为30 min的条件下处理。本发明有益效果：在乙醇与菌丝体的料液比为3：1（g/L），脉冲电场的电场强度为500 V/cm，脉冲温度为60 ℃下脉冲3次处理，然后在超声功率为390 W，超声温度为60 ℃，超声时间为30min的条件下处理，测得红曲色素的黄色素色价为439.8 U/g，橙色素色价为229.3 U/g，红色素色价为350.4 U/g，总色价为519.5 U/g。与传统的乙醇溶液浸提法相比，脉冲强化超声辅助提取红曲色素的效果提高了85.2%。

说明书附图

图1 料液比对红曲色素提取效果的影响。图2 脉冲前处理温度对红曲色素提取效果的影响。图3 脉冲次数对红曲色素提取效果的影响。

图4 电场强度对红曲色素提取效果的影响。 图5 超声波功率对红曲色素提取效果的影响。 图6 超声时间对红曲色素提取效果的影响。 图7 超声波温度对红曲色素提取效果的影响。

具体实施方式

选择在大米中分离出来的红色红曲霉菌。

所用试剂

表1 所用试剂一览表

试剂	纯度级别	生产单位
			无水葡萄糖	分析纯AR	国药集团化学试剂有限公司
牛肉浸膏	生化试剂BR	国药集团化学试剂有限公司
			胰蛋白胨大豆肉汤	分析纯AR	英国OXOID公司
酵母膏	生化试剂BR	北京奥博星生物技术有限责任公司
			硝酸钠	分析纯AR	国药集团化学试剂有限公司
硫酸镁	分析纯AR	国药集团化学试剂有限公司
			琼脂Agar	分析纯AR	德国BIOFROXX公司
无水乙醇	分析纯AR	国药集团化学试剂有限公司

所用仪器见表2 表2 所用仪器一览表

实验仪器名称	生产单位
		高温蒸汽灭菌锅 GI36DWS	ZEALWAY INSTRUMENT INC.
电子分析天平 AL204	梅特勒托多仪器有限公司
		离心机 S718R	德国OHAUS公司
无菌操作台 DL-CJ-1NDII	北京东联哈尔仪器制造有限公司
		恒温培养摇床 HZ300L	武汉瑞华仪器设备有限责任公司
霉菌培养箱 MJP400	武汉瑞华仪器设备有限责任公司
		扫描型紫外分光光度计 Evolution 220	美国热电公司
超声波提取器 JY92-ⅡN	宁波新芝生物科技股份有限公司
		高压脉冲电场发生仪 THU-PEF4	武汉新天普实验室设备有限公司
生物显微镜 CX40	宁波舜宇仪器有限公司
		恒温水浴锅 HH-2	国华电器有限公司
实验室pH计 ST2100	德国OHAUS公司
		电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9243BS-Ⅲ	上海新苗医疗器械制造有限公司

培养基的配制

葡萄糖固体培养基的制备见表3

表3葡萄糖固体培养基

组分	质量	组分	质量
				葡萄糖	40.0 g	酵母膏	5.0g（夏天3.0g）
牛肉浸膏	3.0 g	硫酸镁	1.0 g
				蛋白胨	8.0 g	硝酸钠	2.0 g
琼脂	20.0 g	蒸馏水	1000 mL

将上述试剂加入到1000 mL的烧杯中，加热溶化并搅拌均匀。在培养基未冷却时使用量筒量取200 mL的固体培养基转移到带蓝色盖子的玻璃瓶中。将玻璃瓶的盖子拧松后放入高温蒸汽灭菌锅，灭菌锅设置温度为121 ℃，设定时间为20 min。灭菌完后取出，将玻璃瓶的蓝盖拧紧，冷却后贮存备用。

葡萄糖液体培养基的制备见表4

表4葡萄糖液体培养基

组分	质量	组分	质量
				葡萄糖	40.0 g	酵母膏	5.0g（夏天3.0g）
牛肉浸膏	3.0 g	硫酸镁	1.0 g
				蛋白胨	8.0 g	硝酸钠	2.0 g

将上述试剂加入到1000 mL的烧杯中，加入1000 mL的蒸馏水，在马弗炉上加热使试剂全部溶解并使用玻璃棒不断搅拌，在培养基未冷却时使用量筒量取200 ml的葡萄糖液体培养基转移到250 mL的锥形瓶中，使用橡胶塞将瓶口塞紧并用牛皮纸包好瓶口。将所有装有液体培养基的锥形瓶放入高温蒸汽灭菌锅，灭菌锅设置温度为121 ℃，设定时间为20 min。灭菌完后取出锥形瓶，冷却至40 ℃后即可使用。

斜面培养基的制备：将上述已经灭菌的葡萄糖固体培养基在微波炉中加热5-6min，目的是使已经冷却成固体的培养基融化成液态。无菌操作台提前30 min打开紫外杀菌灯，从微波炉中取出培养基放入无菌操作台里，等待培养基的温度下降至40 ℃-50 ℃时，在无菌操作台里完成试管斜面培养基的制作。在将手伸进无菌操作台之前需要将放入无菌操作台中的东西以及双手喷上酒精，点燃酒精灯，将已灭菌的空试管取出，将橡胶塞及试管口放在酒精灯的火焰上灼烧5秒，然后向试管中倒入约5 cm的葡萄糖固体培养基，继续将橡胶塞及试管口放在酒精灯的火焰上灼烧5秒后塞紧试管。将试管放在无菌操作台中平放的一根玻璃棒上，微微使试管倾斜一定角度靠在玻璃棒上，等试管里的培养基冷却成固态时试管斜面培养基的制作就完成了。操作以上步骤是需要在酒精灯火焰周围进行的，原因是酒精灯火焰周围的温度较高，可以认为是一个无菌的环境，能够保证制作的固态培养基不会被污染。冷却的试管斜面培养基用牛皮纸包好，放置在4 ℃的冰箱里。实验完成后需要整理无菌操作台，将实验室打扫干净。

红曲菌的接种培养：红曲菌的接种培养是需要在无菌操作台中进行操作，无菌操作台需要提前30 min打开紫外灯进行灭菌。将无菌操作台里的接种针在酒精灯火焰上灼烧1 min，目的是杀死接种针上的细菌，防止红曲菌被污染。此外接种针的棒杆也需要在火焰上灼烧2-3次，等接种针的针头烧到颜色发红即可使用。首先取一根带有培养基的试管斜面以及一根已经培养了14天左右的红曲菌试管斜面，将其试管口和橡皮塞都放在酒精灯火焰上灼烧几秒钟，然后将接种针伸入有红曲菌的试管壁上，等待接种针的温度下降，目的是避免接种针的温度过高使红曲菌失去活性。使用接种针从试管斜面上划出一块有红曲菌的葡萄糖固体培养基，然后转移到有新的葡萄糖固体培养基的试管斜面上。长有红曲菌的那面与斜面培养基相接触，使用接种针将红曲小块从试管斜面下端刮涂至上端，再推到试管底端，操作来回2-3次后取出小块的红曲培养基。将试管口和橡皮塞在火焰上灼烧几秒后塞上橡胶塞。每接完一根试管都要重新灼烧接种针以及接种针的棒杆，试管的橡胶塞灼烧完后倒立放置在酒精灯旁边。接种红曲的工作需要3-4天进行一次，每次接种15-20支已灭菌的葡萄糖固体培养基试管斜面。接种完的红曲菌斜面试管需要放到28 ℃的恒温培养箱里进行培养。

红曲菌孢子的收集：在恒温培养箱中拿出18-20支已培养至少两个星期的红曲试管斜面，确定每支试管的红曲霉菌长势良好。无菌操作台需要提前30 min打开紫外灯进行灭菌，在无菌操作台中，使用1 mL的枪头向红曲试管斜面加入8 mL无菌水，将无菌操作台里的接种棒在酒精灯火焰上来回灼烧1 min，目的是杀死接种棒上的细菌，防止红曲菌被污染。此外接种棒杆也需要在火焰上灼烧2-3次即可使用。将灼烧后的接种棒伸入试管中，在试管壁上等待接种棒的温度下降，目的是避免接种棒的温度过高使红曲菌失去活性。随后微微用劲在有红曲菌的斜面上来回刮蹭，目的是将红曲菌丝的孢子尽可能多的脱离培养基悬浮在无菌水里。将试管微微放平，使用1 mL的枪头吸取试管口的孢子液，注射到已经在高温蒸汽灭菌锅中灭完菌的带有无菌擦镜纸的漏斗进行过滤操作，漏斗下面接上装有大约10粒玻璃珠的锥形瓶中。过滤完后将锥形瓶和塞子在火焰上灼烧几秒，将塞子塞紧锥形瓶并用牛皮纸包好。锥形瓶放在恒温培养摇床中，温度为28 ℃，摇床转速为180 r/min，振荡时间为20 min。摇床的目的是将红曲孢子的闭囊壳打开，从而获得更多的孢子。等待摇床时间完后，取出锥形瓶，将孢子悬液分装到2 mL的离心管中放入8000 r/min的小型离心机中离心15 min。离心完后将离心管中的上清液倒掉，用枪头吸出离心管中剩余的孢子液，收集到一个离心管中，此即浓缩孢子液。

从离心管中取出大约100 μL的浓缩孢子液，将其稀释适当的倍数后使用血球板计数，根据公式计算孢子数，确定注射到液体培养基中的孢子液体积。

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此方法具有直接和快速的优点。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）置于血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。实验室的的血球计数板是25×16型，血球计数板的计数室是5×5的格子。用无菌水将血球计数板洗净并用擦镜纸擦干，随后盖一张20 mm×20 mm的盖玻片，选择合适的移液枪吸取20 μL左右的稀释孢子液缓慢打入盖玻片下，盖玻片里不能有气泡否则影响观察。计数时一共要记80个小格子。相同浓度的孢子液需要计数3次，计算该浓度下孢子数的平均值，按以下公式计算每1 mL浓缩孢子液中所含的红曲孢子个数。

其中 c：每毫升的孢子数

n：80小格内孢子的个数

f：稀释倍数

根据计算使得每个锥形瓶内的孢子液接种量相同且应为个/ml，由于孢子会在浓缩孢子液中缓慢沉下去，所以每次用枪头吸取孢子液时都要适当摇晃锥形瓶，尽可能使每个葡萄糖液体培养基中孢子浓度相同。将已经接种完的锥形瓶用牛皮纸包好，放入28 ℃的恒温摇床中，摇床的转速为160 r/ min，培养10-14天。

发酵液的收集：待发酵结束，将锥形瓶从恒温培养摇床里取出，锥形瓶中的菌丝体放到带有滤纸的漏斗中过滤，用装有蒸馏水的洗瓶冲洗2-3次，轻轻用手挤压菌丝体的水分。将菌丝体放在玻璃皿中，置于70 ℃电热恒温鼓风干燥箱中，烘干水分的时间至少不低于48 h。取出玻璃皿，使用研钵研碎，然后通过100目筛，即得到干红曲菌丝体粉末，收集到离心管中备用。

红曲色素产量测定：胞内色素(菌丝体中色素)测定方法：取0.3000 g红曲菌丝体粉末加入10 mL 70% 乙醇，60 ℃下水浴1 h，过滤后取滤液，用70%乙醇稀释适当的倍数后，用紫外-可见分光光度计从300 nm到600 nm扫描其吸光值，同时用70%乙醇作为阴性对照。用390 nm、470 nm和520 nm下测得的吸光值除以被测样品的浓度来分别计算红曲菌株产胞内黄色素、橙色素和红色素的产量，单位是U/g。

试验一：脉冲电场因素条件对红曲色素提取效果的影响

料液比对红曲色素提取效果的影响：分别以 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1（g/L）的料液比溶于五份100 mL，70%乙醇，60 ℃下水浴1 h，在脉冲电场的电场强度为500 V/cm，流速为1.5mL/s，脉冲3次的条件下对样品进行处理。处理完的样品装入10 mL的离心管中放入离心机中离心。离心机的转速设定为5 000 r/min，离心时间为20 min。取离心完的上清液用70%的乙醇稀释适当的倍数后，用扫描型紫外分光光度计从300 nm到600 nm扫描其吸光值，同时用70%乙醇作为阴性对照。用390nm、470 nm和520 nm下测得的吸光值除以被测样品的浓度来分别计算红曲菌株产胞内黄色素、橙色素和红色素的产量，单位是U/g 。

前处理温度对红曲色素提取效果的影响：准确称取五份0.3000 g干燥菌体粉溶于100 mL，70%乙醇溶液，分别在温度为30、40、50、60、70 ℃下水浴1 h，在脉冲电场的电场强度为500 V/cm，流速为1.5 mL/s，脉冲3次的条件下对样品进行处理。处理完的样品使用2.2.3.1的方法进行后处理。用390 nm、470 nm和520 nm下测得的吸光值除以被测样品的浓度来分别计算红曲菌株产胞内黄色素、橙色素和红色素的产量，单位是U/g。

脉冲次数对红曲色素提取效果的影响：准确称取五份0.3000 g干燥菌体粉溶于100 mL，70%乙醇溶液，温度为60 ℃下水浴1 h，在脉冲电场的电场强度为500 V/cm，流速为1.5 mL/s的条件下对样品分别脉冲1次、2次、3次、4次、5次处理。处理完的样品使用2.2.3.1的方法进行后处理。用390 nm、470 nm和520 nm下测得的吸光值除以被测样品的浓度来分别计算红曲菌株产胞内黄色素、橙色素和红色素的产量，单位是U/g。

电场强度对红曲色素提取效果的影响：准确称取五份0.3000 g干燥菌体粉溶于100 mL，70%乙醇溶液，温度为60 ℃下水浴1 h，分别以脉冲电场的电场强度为200、300、400、500、600 V/cm，流速为1.5 mL/s，脉冲3次的条件下对样品进行处理。处理完的样品使用2.2.3.1的方法进行后处理。用390 nm、470 nm和520 nm下测得的吸光值除以被测样品的浓度来分别计算红曲菌株产胞内黄色素、橙色素和红色素的产量，单位是U/g。

脉冲电场强化超声辅助对红曲色素提取效果的影响：准确称取五份0.3000 g 干燥菌体粉溶于100 mL，70%乙醇溶液，温度为60 ℃下水浴1 h，在脉冲电场的电场强度为500V/cm，流速为1.5 mL/s的条件下对样品分脉冲3次处理。

超声波功率对红曲色素提取效果的影响：将经过脉冲电场处理后的样品分别在超声波功率为130、195、260、325、390 W、温度60 ℃下浸提30 min。处理完的样品装入10 mL的离心管中放入离心机中离心。离心机的转速设定为5 000 r/min，离心时间为20 min。取离心完的上清液用70%的乙醇稀释适当的倍数后，用扫描型紫外分光光度计从300 nm到600nm扫描其吸光值，同时用70%乙醇作为阴性对照。用390 nm、470 nm和520 nm下测得的吸光值除以被测样品的浓度来分别计算红曲菌株产胞内黄色素、橙色素和红色素的产量，单位是U/g。

超声时间对红曲色素提取效果的影响：将经过脉冲电场处理后的样品在超声波功率为390 W，温度60 ℃下分别以10、20、30、40、50、60、70 min 的超声波时间处理。处理完的样品使用2.2.4.1的方法进行后处理。用390 nm、470 nm和520 nm下测得的吸光值除以被测样品的浓度来分别计算红曲菌株产胞内黄色素、橙色素和红色素的产量，单位是U/g。

超声波温度对红曲色素提取效果的影响：将经过脉冲电场处理后的样品分别以温度为30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃，70 ℃的超声温度，超声波功率为390 W下浸提 30 min。处理完的样品使用2.2.4.1的方法进行后处理。用390 nm、470 nm和520 nm下测得的吸光值除以被测样品的浓度来分别计算红曲菌株产胞内黄色素、橙色素和红色素的产量，单位是U/g。实验二：脉冲电场提取红曲色素的单因素试验

液料比的确定：由图1可知，从料液比为5:1开始，由于乙醇溶液使用量较少，乙醇与红曲菌丝体不能充分混匀导致红曲色素提取效率低，随着乙醇用量的增加，提取液中红曲色素的总色价逐渐增加，当料液比达到3:1时，红曲色素中红曲红，红曲橙，红曲黄三种组分的色价值均达到最高值，总色价也达到最大值。乙醇用量进一步增大时，红曲色素的色价反而有所降低，这可能是由于在使用脉冲电场的过程中，乙醇用量过多而且红曲菌体并不溶于乙醇溶液，所以乙醇先被吸入到脉冲电场处理器中，沉淀下来的菌体与乙醇没有混合均匀，所以红曲色素的提取效率反而会降低。

脉冲前处理温度的确定：由图2可知，脉冲前处理温度从30 ℃上升到60 ℃，提取液中红曲色素的色价呈现上升趋势，当温度到达60 ℃时红曲色素中红曲红，红曲橙，红曲黄三种组分的色价值均达到最高值，总色价也达到最大值。脉冲电场会产生热效应，而产热会使处理溶液的温度会升高，由于红曲色素是会在高温下微微分解，所以为了提高红曲色素的产量选择脉冲电场处理温度为60 ℃。

脉冲次数的确定：由图3可知，样品在脉冲电场下处理1-5次，由于刚开始脉冲次数低，红曲菌体的细胞并没有全部破裂，红曲色素没有完全流出，但随脉冲次数增大红曲色素的色价随之升高，当脉冲次数达到3次后，红曲色素中红曲红，红曲橙，红曲黄三种组分的色价值均达到最高值，总色价也达到最大值，超过3次后红曲色素的色价有下降的趋势，样品在处理完后温度有明显升高，可能会有部分色素被分解，从而导致色价的下降。因此脉冲次数应选择3次。电场强度的确定：由图4可知，在电场强度为200-600 V/cm的条件下，由于刚开始电场强度低，红曲菌体的细胞并没有全部破裂，红曲色素没有完全流出，随着电场强度的升高，红曲色素的色价也逐渐升高。当电场强度为500 V/cm时，红曲菌体的细胞膜、细胞壁已经被不可逆击穿，渗出的物质含量达到恒定，所以电场强度再增加时，红曲色素的色价几乎不变。因此电场强度选定500 V/cm较为适宜。

试验三：脉冲电场强化超声辅助提取红曲色素的单因素试验

超声波功率的确定：由图5可知，由于仪器的最大功率只能使用到仪器满额功率的60%，当超声波功率由130 W-390 W逐渐加大，红曲色素的色价也随之增加。当超声功率为390 W时，红曲色素中红曲红，红曲橙，红曲黄三种组分的色价值均达到最高值，总色价也达到最大值。因此确定超声功率390 W较为适宜。

超声波作用时间的确定：由图6可知，实验选择超声时间为10 min-30 min。当超声时间为30 min时，红曲色素中红曲红，红曲橙，红曲黄三种组分的色价值均达到最高值，总色价也达到最大值。但是当超声时间继续延长时，红曲色素色价却有所下降，这可能是由于超声时间过长产生了热效应导致溶液的温度升高，由于红曲色素是会在高温下微微分解的，这会导致红曲色素的色价下降。由以上分析可知超声处理时间为30 min最合适。

超声波温度的确定：由图7可知，当超声温度在40-60 ℃时，随着超声温度升高，红曲色素的色价随之上升，当超声处理温度达到60 ℃时，红曲色素中红曲红，红曲橙，红曲黄三种组分的色价值均达到最高值，总色价也达到最大值。但是超声温度超过60 ℃时，红曲色素的色价却降低，这是由于超声波的热效应导致溶液的温度升高，红曲色素长时间在高温下不稳定容易分解，因此超声处理温度以60 ℃为宜。

最佳条件的验证试验：经过单因素试验最终确定了各个单因素的最优条件。在此条件下进行验证试验，结果显示：采用红曲色素提取最佳条件时，即在脉冲电场的电场强度为500 V/cm，脉冲次数为3次，脉冲前处理温度为60 ℃，料液比为3:1（g/L）的条件下处理，然后在超声功率为390 W，超声温度为60 ℃，超声处理时间为30 min的条件下处理，测得红曲色素的黄色素色价为239.8 U/g，橙色素色价为129.3 U/g，红色素色价为150.4 U/g，总色价为519.5 U/g。将样品加入同最优条件相同体积的乙醇溶液，60 ℃水浴1 h，取上清液进行色价的测量。乙醇溶液浸提法测得红曲色素的黄色素色价为439.8 U/g，橙色素色价为229.3 U/g，红色素色价为350.4 U/g，总色价为519.5 U/g。与传统的乙醇溶液浸提法相比，脉冲强化超声辅助提取红曲色素的效果提高了85.2%。以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。