一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球及其应用
阅读说明：本技术 一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球及其应用 (A kind of PEG/MoS2Quantum dot composite fluorescent nanosphere and its application ) 是由 董建 刘莉 董立峰 于 2019-07-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种PEG/MoS_2量子点(MoS_2-PEG)复合荧光纳米微球,其制备方法以及应用。所述纳米微球包括PEG基质以及嵌入PEG基质的MoS_2量子点。制备方法包括MoS_2量子点的制备和纳米微球MoS_2-PEG的制备。应用为以MoS_2-PEG为载体负载抗肿瘤药物。本发明提供的纳米微球利用肿瘤组织的EPR效应将药物被动地富集到肿瘤组织,提高疗效同时降低全身毒性；制备方法过程简单,条件温和,制备周期短,合成过程无有害物质产生。借助MoS_2-PEG纳米微球和抗肿瘤药物自身荧光实现同步示踪功能；该载药系统体外药物释放具有明显pH响应性,载药量大,在抗肿瘤药物传输领域可广泛应用。(The invention discloses a kind of PEG/MoS 2 Quantum dot (MoS 2 - PEG) composite fluorescence nanosphere, preparation method and application.The nanosphere includes PEG group matter and the MoS for being embedded in PEG group matter 2 Quantum dot.Preparation method includes MoS 2 The preparation of quantum dot and nanosphere MoS 2 The preparation of-PEG.Using for MoS 2 - PEG is carrier loaded anti-tumor drug.Drug is passively enriched to tumor tissues using the EPR effect of tumor tissues by nanosphere provided by the invention, and improve curative effect reduces general toxicity simultaneously；Preparation method process is simple, mild condition, short preparation period, and synthesis process unharmful substance generates.By MoS 2 - PEG nanosphere tracking function synchronous with the realization of anti-tumor drug autofluorescence；The drug-loading system vitro drug release has obvious pH responsiveness, and drugloading rate is big, can be widely applied in anti-tumor drug transmission field.)
技术领域
本发明属于纳米生物医药领域，涉及一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球及其应用。
背景技术
癌症是严重威胁人类生命和健康的恶性肿瘤。2018年全球新增1810万例癌症病例，死亡人数达960万，癌症已经成为全球性的公共健康问题。而作为人口大国的中国，其癌症死亡数量更居于世界首位。据《2018年中国癌症报告》显示，我国平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。如何治愈癌症是现代医学面临的巨大挑战。目前临床上肿瘤的治疗依然以手术、放疗和化疗三种方法为主，其中化疗是最为常用的手段。但是，传统的化疗存在副作用严重、药物依赖和多药耐药(MDR)等问题，导致其治疗效果并不理想。
近几十年来，随着纳米技术的发展，多种纳米材料如碳纳米管，氧化石墨烯和富勒烯等已经发展为药物载体用于抗肿瘤药物的输送。这些纳米载体可提高药物的水溶性和生物利用度，并利用肿瘤组织的高通透性和滞留效应(EPR效应)将药物被动地富集到肿瘤组织，进而提高疗效同时降低全身毒性。纳米药物载体还可通过主动运输的方式将药物输送到肿瘤细胞，从而阻断多耐药性肿瘤细胞的外排途径，从而有效地克服肿瘤的多耐药性。另外，设计组装具有刺激响应性的纳米载体有望在时间、空间以及剂量上控制药物的释放，更便于实现精准治疗。pH是目前癌症治疗及药物控释中最常用的内源性刺激。与正常组织和血液(pH 7.4)相比，无氧糖降解导致的酸性微环境(pH 6.0-7.0)是实体瘤等多种肿瘤的一个显著特征。在癌细胞内的内涵体和溶酶体等酸性细胞器中pH值会进一步降低(pH 3.0-5.5)，这对肿瘤内药物控释也具有重要意义。但迄今为止，与药物输送和刺激响应性治疗相关的智能荧光成像研究鲜有报道。大多数纳米药物载体自身不具有示踪功能，只有借助与荧光标记物或造影剂的复合才能实现其在细胞中的定位。因此，亟待开发一种集荧光成像、抗肿瘤药物输送以及pH响应性药物释放功能为一体的纳米药物载体。二硫化钼量子点具有荧光强、稳定性好、水溶性好、无毒等优点，在生物医学领域具有广泛的应用前景。目前，MoS2量子点的研究主要集中在生物成像，而其在癌症治疗方面的应用仍处于早期发展阶段，尚未见MoS2量子点应用于荧光成像、抗肿瘤药物输送以及pH响应性药物释放功能为一体的纳米药物载体的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球及应用，以PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球为载体输送抗肿瘤药物，借助其自身的荧光，实现同步示踪功能，并可实现肿瘤细胞内的pH响应性药物释放。本发明提供如下技术：
本发明的目的之一在于提供一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球；
本发明的目的之二在于提供一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球的制备方法；
本发明的目的之三在于提供一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球的应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下所述：
本发明的第一个方面，提供一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球，所述纳米微球包括PEG基质以及嵌入PEG基质的多个MoS2量子点。
优选的，所述PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球的平均粒径为123.5nm。
优选的，所述PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球的粒径范围为65-185nm。
本发明的第二个方面，提供一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球的制备方法，所述制备方法包括：
步骤一、MoS2量子点的制备：将Na2MoO4·2H2O溶解于一定体积的水中，浓度为0.04mol/L，超声处理5min后，用0.1M HCl将溶液调节至pH＝6.5，然后向溶液中加入谷胱甘肽(GSH)和二倍于原体积的水，谷胱甘肽的摩尔量为Na2MoO4·2H2O摩尔量的4倍，超声处理10min并通入氩气，最后将混合物转移到特氟隆衬里的不锈钢高压釜中并在200℃下反应24h。自然冷却至室温，9000rpm的速度离心5min收集上清液，用截留分子量为500～1000的透析袋在纯水中透析12～48h，每2～4h换一次透析液。将透析后的溶液冷冻干燥3～4天后得到MoS2量子点；
步骤二、MoS2-PEG纳米微球的制备：
S1、将MoS2量子点分散于PBS缓冲液中，加入偶联剂，超声处理，室温下搅拌，得到悬浮液；
S2、将S1得到的悬浮液进行第一次透析；
S3、向透析后的溶液中加入聚乙二醇，搅拌，得到悬浮液；
S4、将S3得到的悬浮液进行第二次透析，而后冷冻干燥，得到MoS2-PEG纳米微球。
其中，所述PBS缓冲液作为MoS2量子点的溶剂，起到分散的效果，所述溶剂可以用醇类如甲醇、乙醇代替。
优选的，所述步骤二S1中MoS2量子点在PBS缓冲液中的分散体系浓度为1～6mg/mL；
优选的，所述步骤二S1中偶联剂为戊二醛，优选浓度为2.5％，其与PEG的摩尔比为(1～1.5)：1。
优选的，所述步骤二S1中超声处理5～30min，室温下搅拌6～24h。
优选的，所述步骤二S2中第一次透析采用截留分子量为500～1000的透析袋在纯水中进行透析12～48h，每2～4h换一次透析液以除去游离戊二醛。
优选的，所述步骤二S3中采用双氨基封端的聚乙二醇，平均分子量范围为800～2500，以聚乙二醇的PBS溶液的形式加入，聚乙二醇浓度为1～6mg/mL；
优选的，所述步骤二S3中所得混合液中MoS2量子点与PEG的质量比为(0.5～4):1，搅拌8～24h。
优选的，所述步骤二S4中采用截留分子量为1000～3500的透析袋在纯水中进行第二次透析12～48h，每2～4h换一次透析液以除去游离的PEG；将透析后的溶液冷冻干燥3～4天后得到MoS2-PEG纳米微球。
MoS2-PEG纳米微球的形成机理分析：MoS2量子点在制备的过程中表面经GSH钝化，因此其表面富含氨基。以戊二醛为偶联剂，其两端的醛基分别与PEG的端氨基和MoS2量子点表面的氨基作用形成席夫碱，以共价键的方式实现PEG在MoS2量子点表面的链接。另外，在反应的过程中不可避免地发生两个MoS2量子点间以PEG为“桥”，借助PEG两端氨基分别与两个MoS2量子点上的氨基共价作用而形成一定程度上的交联，从而最终得到一种MoS2量子点在PEG中镶嵌的特殊结构。
利用透射电子显微镜(TEM)对MoS2-PEG的微观形貌以及晶格进行表征，MoS2-PEG的平均粒径为123.5nm，由多个MoS2量子点嵌入PEG基质构成；通常，大小为几个纳米的纳米粒子很容易从肾脏中排出，而尺寸为几百纳米的粒子容易被肝脏和脾脏截留。相关研究表明，提高EPR效应的最佳尺寸在100-200纳米范围内。从粒径的角度来看，制备的MoS2-PEG纳米微球用作药物输送的载体可提高EPR效应，将药物富集到肿瘤组织，进而提高疗效同时降低全身毒性。
MoS2-PEG的紫外及荧光光谱显示MoS2-PEG在pH＝4-12范围内具有稳定的荧光性质。MoS2-PEG在较宽的pH范围内具有良好的荧光稳定性，这对后续的细胞成像至关重要。
生理环境下的稳定性研究中，将MoS2量子点或MoS2-PEG分别分散于水、PBS以及细胞培养基中，观察其静置不同时间后的稳定性。结果表明MoS2-PEG在生理环境下的稳定性明显优于MoS2量子点。
细胞毒性试验表明MoS2-PEG的细胞毒性较MoS2量子点明显降低，当MoS2-PEG的浓度低于0.2mg/mL时无明显毒性，当其浓度高达1.5mg/mL时，细胞存活率仍高达82％，可保证荧光成像及载药的安全性。
本发明提供的第三方面，提供一种PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球的应用，具体为以MoS2-PEG为载体，负载抗肿瘤药物。
所述抗肿瘤药物包括但不限于阿霉素，以MoS2-PEG为载体负载阿霉素(DOX)，形成载药系统(MoS2-PEG-DOX)，其中DOX的负载量可达71.6％。
制备过程为：取DOX溶于PBS溶液(pH值为7.4或9.0)中配成1mg/mL的浓度，然后加入MoS2-PEG溶液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌24h；将MoS2-PEG-DOX溶液置于截留分子量为Mw＝3500的透析袋中，在PBS溶液中透析48h，每4h更换一次PBS溶液，冷冻干燥得MoS2-PEG-DOX固体。
MoS2-PEG-DOX的体外药物释放具有明显的pH响应性，即酸性条件下(pH＝5.0和6.0，模拟癌细胞的微环境)的DOX释放率和释放速率明显高于pH＝7.4(模拟正常细胞的微环境)时的释放率。可见，MoS2-PEG有望成为一种新型的pH响应性的药物载体。
基于MoS2-PEG纳米微球和DOX自身固有的荧光，可在输送药物的同时，实现同步示踪功能，即检测药物DOX的释放以及定位载体MoS2-PEG。
本发明的有益效果在于：
(1)提供了一种新型结构的PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球，平均粒径为123.5nm。相关研究表明，提高高通透性和滞留效应(EPR效应)的最佳尺寸在100-200纳米范围内。从粒径的角度来看，制备的MoS2-PEG更适合用作药物输送的载体，利用肿瘤组织的EPR效应将药物被动地富集到肿瘤组织，进而提高疗效同时降低全身毒性。
(2)本发明提供的制备方法工艺过程简单，条件温和，制备周期短，合成过程无有害物质产生。
(3)纳米微球MoS2-PEG在较宽的pH范围内具有良好的荧光稳定性，在生理环境下的稳定性明显优于MoS2量子点，细胞毒性低，可保证荧光成像及载药的安全性。
(4)本发明提供的以MoS2-PEG为载体，负载抗肿瘤药物的载药系统，借助MoS2-PEG纳米微球和抗肿瘤药物自身的荧光，实现同步示踪功能；且该载药系统体外药物释放具有明显的pH响应性，载药量大，在抗肿瘤药物的传输领域可广泛应用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明提供的纳米微球MoS2-PEG的结构示意图；
图2为本发明提供的纳米微球MoS2-PEG的微观形貌及粒径分布图；
图3为MoS2量子点、PEG和MoS2-PEG的XRD图；
图4为MoS2量子点、PEG和MoS2-PEG的FT-IR图；
图5为MoS2量子点和MoS2-PEG的XPS能谱图；
图6为MoS2-PEG的紫外及荧光光谱；
图7为MoS2-PEG在不同pH下的荧光强度曲线图；
图8为MoS2量子点和MoS2-PEG分别在水溶液、PBS溶液以及细胞培养液中的稳定性示意图；
图9为MoS2-PEG与MoS2量子点的细胞毒性比较图；
图10为MoS2-PEG纳米微球载药示意图；
图11为MoS2-PEG纳米微球与DOX间的氢键作用；
图12为MoS2-PEG-DOX在不同pH下的体外释放行为示意图；
图13为用MoS2-PEG-DOX孵育U251细胞2h、8h和16h的激光共聚焦照片。
其中，图2中(a)为纳米微球MoS2-PEG的TEM照片；(b)为纳米微球MoS2-PEG的粒径分布图；(c)为单个MoS2-PEG的TEM照片；(d)为纳米微球MoS2-PEG内部结构HRTEM照片；
图5中(a)为MoS2量子点的Mo 3d能谱图；(b)为MoS2量子点的S 2p能谱图；(c)为MoS2-PEG的Mo 3d能谱图；(d)为MoS2-PEG的S 2p能谱图；
图13中(a)为MoS2-PEG由405nm激光激发，在450±50nm范围内收集信号；(b)为DOX由488nm激光激发，在595±50nm范围内收集信号；(c)为MoS2-PEG和DOX的融合图像。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
实施例1，PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球(MoS2-PEG)的制备
步骤一、MoS2量子点的制备：将0.121g的Na2MoO4·2H2O溶解在12.5mL的水中，超声处理5min后，用0.1M HCl将溶液调节至pH＝6.5，然后向溶液中加入0.615g谷胱甘肽(GSH)和25mL水，超声处理10min并通入氩气，最后将混合物转移到50mL特氟隆衬里的不锈钢高压釜中并在200℃下反应24h。自然冷却至室温，9000rpm的速度离心5min收集上清液，用截留分子量为500～1000的透析袋在纯水中透析12～48h，每2～4h换一次透析液。将透析后的溶液冷冻干燥3～4天后得到MoS2量子点。
步骤二、MoS2-PEG的制备：将20mg的MoS2量子点分散于5ml体积的PBS(0.1M，pH＝7.4)中，MoS2量子点浓度为4mg/mL，加入6ml浓度为2.5％的戊二醛，然后超声处理15min，室温下搅拌12h。将得到的悬浮液用截留分子量为800的透析袋在纯水中透析20h，每3h换一次透析液以除去游离戊二醛。向透析后的溶液中加入双氨基封端的聚乙二醇(PEG，平均分子量1500)的PBS(0.1M，pH＝7.4)溶液(浓度为4mg/mL)，所得混合液中MoS2量子点与PEG的质量比为2:1，搅拌12h。将得到的悬浮液用截留分子量为2000的透析袋在纯水中透析20h，每3h换一次透析液以除去游离的PEG，将透析后的溶液冷冻干燥4天后得到纳米微球MoS2-PEG，产率约41％，粒径范围为65-185nm，其中粒径为100nm以上的占80％。
MoS2-PEG纳米微球的形成机理分析：MoS2量子点在制备的过程中表面经GSH钝化，因此其表面富含氨基。以戊二醛为偶联剂，其两端的醛基分别与PEG的端氨基和MoS2量子点表面的氨基作用形成席夫碱，以共价键的方式实现PEG在MoS2量子点表面的链接。另外，在反应的过程中不可避免地发生两个MoS2量子点间以PEG为“桥”，借助PEG两端氨基分别与两个MoS2量子点上的氨基共价作用而形成一定程度上的交联，从而最终得到一种MoS2量子点在PEG中镶嵌的特殊结构。
实施例2，PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球(MoS2-PEG)的制备
步骤一、MoS2量子点的制备过程与实施例1相同。
步骤二、S1、将5mg的MoS2量子点分散于5ml体积的PBS缓冲液(0.1M，pH＝7.4)中，其浓度为1mg/mL，加入2ml浓度为2.5％的戊二醛，然后超声处理5min，室温下搅拌6h；
S2、将得到的悬浮液用截留分子量为1000的透析袋在纯水中进行第一次透析12h，每4h换一次透析液以除去游离戊二醛；
S3、向透析后的溶液中加入双氨基封端的聚乙二醇(PEG，平均分子量800)的PBS(0.1M，pH＝7.4)溶液(浓度为1mg/mL)，所得混合液中MoS2量子点与PEG的质量比为0.5:1，搅拌8h；
S4、将得到的悬浮液用截留分子量为1000的透析袋在纯水中进行第二次透析12h，每4h换一次透析液以除去游离的PEG，将透析后的溶液冷冻干燥3天后得到纳米微球MoS2-PEG，产率约30％，粒径范围为65-155nm，其中粒径为100nm以上的占65％。
实施例3，PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球(MoS2-PEG)的制备
步骤一、MoS2量子点的制备过程与实施例1相同。
步骤二、S1、将30mg的MoS2量子点分散于5ml体积的PBS缓冲液(0.1M，pH＝7.4)中，其浓度为6mg/mL，加入10ml浓度为2.5％的戊二醛，然后超声处理30min，室温下搅拌24h；
S2、将得到的悬浮液用截留分子量为500的透析袋在纯水中进行第一次透析48h，每2h换一次透析液以除去游离戊二醛；
S3、向透析后的溶液中加入双氨基封端的聚乙二醇(PEG，平均分子量2500)的PBS(0.1M，pH＝7.4)溶液(浓度为6mg/mL)，所得混合液中MoS2量子点与PEG的质量比为4:1，搅拌24h；
S4、将得到的悬浮液用截留分子量为3500的透析袋在纯水中进行第二次透析48h，每2h换一次透析液以除去游离的PEG，将透析后的溶液冷冻干燥4天后得到纳米微球MoS2-PEG，产率约36％，粒径范围为65-170nm，其中粒径为100nm以上的占76％。。
实施例4，MoS2-PEG的结构与性质，对实施例3制得的纳米微球MoS2-PEG结构和性质进行研究。
(1)MoS2-PEG的微观形貌：采用Tecnai G2F20型透射电子显微镜(TEM)对MoS2-PEG的微观形貌以及晶格进行表征。测试方法为：少量样品溶于水中并超声30min，吸取少量超声后的溶液滴于金属铜网上，干燥后观察。
MoS2-PEG的平均粒径为123.5nm，由多个MoS2量子点嵌入PEG基质构成，其结构、微观形貌及粒径分布如图1和图2所示。通常，大小为几个纳米的纳米粒子很容易从肾脏中排出，而尺寸为几百纳米的粒子容易被肝脏和脾脏截留。相关研究表明，提高EPR效应的最佳尺寸在100-200纳米范围内。从粒径的角度来看，制备的MoS2-PEG用作药物输送的载体可提高EPR效应，将药物富集到肿瘤组织，进而提高疗效同时降低全身毒性。
(2)MoS2-PEG的结构
采用TD-3500型X射线衍射(XRD)测定MoS2-PEG的晶体结构。图3为PEG，MoS2量子点和MoS2-PEG的XRD衍射花样。由于MoS2量子点非常小且很薄，彼此之间几乎没有层-层相互作用，因此，MoS2QDs基本上没有衍射峰。但MoS2-PEG的XRD图谱分别在2θ为19.0和23.3处出现两个衍射峰，且与PEG的衍射峰相对应。这一结果表明：PEG已成功修饰于MoS2量子点表面。
(3)MoS2-PEG的组成分析
采用Avatar 370型傅里叶红外光谱仪(FT-IR)和ESCALAB 250XI型X射线光电子能谱仪(XPS)分析MoS2量子点和MoS2-PEG的化学组成。FT-IR测试条件：采用KBr压片制样，扫描范围：400-4000cm-1。XPS测试条件：选择单色Al-Kα(hv＝1486.6eV)为射线源，功率150W，500μm束斑。
图4为MoS2量子点、PEG和MoS2-PEG的FT-IR光谱。在MoS2-PEG的FT-IR光谱中出现了明显的C＝N(1635cm-1)伸缩振动峰，证明了MoS2QDs与PEG间席夫碱结构的形成。另外MoS2-PEG中N-H(3431cm-1)和C-H(2887cm-1)伸缩振动峰的出现也表明PEG已成功接枝到了MoS2QDs上。
图5为MoS2量子点和MoS2-PEG的XPS能谱图。图5a和b为MoS2量子点的Mo3d和S2p能谱图。在图5a中，在228.2，231.4，230.0和233.2eV处出现的四个XPS峰分别对应Mo4+3d5/2，Mo4+3d3/2，Mo5+3d5/2和Mo5+3d3/2轨道，而结合能较低的225.9eV处的XPS峰对应S2-2s轨道。S2p的XPS能谱如图5b所示，161.4和163.5eV处的两个峰对应于S2-2p3/2和S2-2p1/2轨道，而167.6eV和168.6eV处的峰归因于S2O3 2-基团。由以上XPS分析结果可确定我们成功制备了MoS2量子点，但其在水热过程中因局部高温而发生了轻微的氧化。图5c和d为MoS2-PEG的Mo3d和S2p能谱图，其分峰情况与MoS2量子点的相似。但MoS2-PEG的各XPS峰的结合能均较MoS2量子点中相应的XPS峰有所降低，这可归因于PEG接枝于MoS2量子点表面所引起的化学环境的改变。
(4)MoS2-PEG的光学性质
紫外可见(UV-Vis)光谱表征：采用U-3900型紫外分光光度计对MoS2-PEG水溶液的紫外吸收性能进行测试，扫描波长范围200-800nm，扫描速度1200nm/min，狭缝宽度5nm。
荧光(PL)光谱表征：采用F-4600型荧光分光光度计对MoS2-PEG水溶液进行荧光性质测试，激发狭缝5nm，发射狭缝10nm，扫描范围280-400nm，扫描速度1200nm/min。
量子产率测定：量子产率以硫酸奎宁在0.1M H2SO4(Q＝0.54，320nm)为参照进行测定。由下列公式进行计算。其中Q：量子产率，I：荧光发射峰积分面积，n：折射率，A：吸光度，下标R指已知量子产率的参考样品。
图6为MoS2-PEG的紫外及荧光光谱。MoS2-PEG在268nm和315nm处均出现明显的吸收，分别对应蓝移的Z，C和D激子峰和PEG的特征吸收峰。当激发波长从280nm到400nm变化时，PL峰表现出明显的激发波长依赖性，其最佳激发波长为320nm，最大发射峰位于413nm。MoS2-PEG在320nm激发下的量子产率为3.5％。图7为MoS2-PEG在不同pH下的荧光强度。MoS2-PEG在pH＝4-12范围内具有稳定的荧光性质。MoS2-PEG在较宽的pH范围内具有良好的荧光稳定性，这对后续的细胞成像至关重要。
(5)MoS2-PEG在生理环境下的稳定性及细胞毒性测定
生理环境下的稳定性研究：将MoS2量子点或MoS2-PEG分别分散于水、PBS以及细胞培养基中，观察其静置不同时间后的稳定性。
细胞毒性测试：通过3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法研究MoS2量子点以及MoS2-DOX对脑胶质瘤U251细胞的毒性。主要的实验步骤如下：将复苏且完成2次传代后的细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养，当细胞长满培养瓶底部80％以上时，将1mL胰蛋白酶加入培养瓶对细胞进行消化并置于显微镜上观察，当细胞边缘清晰可见或细胞之间间隙变大时倒掉胰蛋白酶，加入3mL培养液(45％RPMI、10％新生牛血清以及1％青链霉素混合液)反复吹打，加培养液调细胞悬液的浓度为6×104个/ml。将调整好浓度的细胞悬浮液加入96孔板，每孔100μL，边缘孔用100μL的PBS填充，将96孔板置于培养箱中继续培养24h后加入20μL不同浓度梯度的MoS2QDs和MoS2-PEG溶液。将加入MoS2QDs和MoS2-DOX溶液的细胞继续培养24h后加入MTT(5mg/mL，PBS为溶剂)20μL，孵育4h后弃培养液终止培养，加入二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10min。根据酶标仪(Infinite M200，德国Tecon公司)检测的各孔的吸光度值(A)计算细胞存活率。
细胞存活率＝(A-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100％
其中A:吸光度值，blank：空白，control：对照组
由图8可见，MoS2量子点的水溶性较好，但其PBS溶液和细胞培养基溶液放置24h后，就出现了明显的沉淀。而MoS2-PEG的水溶液、PBS溶液和细胞培养基溶液在放置48h后仍未出现明显沉淀，这表明MoS2-PEG在生理环境下的稳定性明显优于MoS2量子点。
由图9可知，MoS2-PEG的细胞毒性较MoS2量子点明显降低，当MoS2-PEG的浓度低于0.2mg/mL时无明显毒性，当其浓度高达1.5mg/mL时，细胞存活率仍高达82％，可保证荧光成像及载药的安全性。
实施例5，MoS2-PEG纳米微球的应用
(1)以MoS2-PEG为载体，利用氢键和疏水相互作用负载抗肿瘤药物阿霉素(DOX)，形成载药系统(MoS2-PEG-DOX)，制备过程为：取5mg的DOX溶于5mL PBS溶液(pH值为7.4或9.0)中配成1mg/mL的浓度，然后加入5mL的MoS2-PEG溶液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌24h。将MoS2-PEG-DOX溶液置于截留分子量为Mw＝3500的透析袋中，在PBS溶液中透析48h，每4h更换一次PBS溶液，冷冻干燥得MoS2-PEG-DOX固体。
其中DOX的负载量可达71.6％。
PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球负载阿霉素的机理在于利用氢键和疏水相互作用与阿霉素结合，PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球载药示意图如图10所示。由PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球的红外光谱可见，其表面富含氨基。DOX的结构含有氨基和羟基等官能团。二者之间可以借助这些官能团发生氢键作用，如PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球上的氨基分别与DOX上的氨基和羟基形成氢键作用，PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球与DOX间的氢键作用如图11所示。除此之外，二者之间还可借助疏水作用结合。因此，氢键和疏水作用是PEG/MoS2量子点复合荧光纳米微球负载DOX的主要作用力。
MoS2-PEG-DOX的体外药物释放具有明显的pH响应性，即酸性条件下(pH＝5.0和6.0，模拟癌细胞的微环境)的DOX释放率和释放速率明显高于pH＝7.4(模拟正常细胞的微环境)时的释放率(图12)。因此，MoS2-PEG有望成为一种新型的pH响应性的药物载体。pH响应性药物释放的原因在于：一是在酸性条件下，DOX上氨基发生质子化，使DOX的亲水性和溶解度增加；二是在较低pH下，DOX和MoS2-PEG上的氨基的质子化作用增强，H+的存在削弱了MoS2-PEG和DOX之间的氢键作用。由于大多数癌细胞内的酸碱值(4.0-6.0)普遍低于正常细胞，所以pH值是一种很好的内部刺激，它不仅可以增强载药系统的癌细胞靶向传递和控制释放，而且可以提高化疗药物的敏感性和生物利用度，解决癌细胞的多耐药性问题。
(2)基于MoS2-PEG纳米微球和DOX自身固有的荧光，可在输送药物的同时，实现同步示踪功能，即检测药物DOX的释放以及定位载体MoS2-PEG(图13)。
实验方法：收集处于生长对数期的脑胶质瘤U251细胞，将细胞悬液接种至培养皿中，加入培养液培养24h。24h后加入MoS2-PEG-DOX溶液(浓度5.0μg/mL)培养，分别于2h、8h、16h终止培养，PBS冲洗3次。激光共聚焦显微镜下观察MoS2-PEG-DOX进入细胞情况。观察MoS2-PEG用λ＝405nm激发，收集波长450±50nm；DOX用λ＝488nm激发，收集波长595±50nm。
实验结果如图13所示。用MoS2-PEG-DOX孵育2h后，U251细胞内可检测到DOX(红色)和MoS2-PEG(蓝色)的弱荧光，表明MoS2-PEG-DOX刚刚被内吞到细胞中，大部分DOX未被释放。由于DOX和MoS2-PEG之间强的氢键和疏水相互作用，二者在形成MoS2-PEG-DOX后均发生了显著的荧光猝灭。而它们在细胞内的荧光恢复表明部分DOX从MoS2-PEG载体上释放了下来。随着孵育时间的延长，细胞内DOX和MoS2-PEG的荧光明显增强，说明DOX的释放量越来越多。当培养时间为8h时，DOX和MoS2-PEG在细胞内均产生更明显的荧光，表明U251细胞内酸性条件触发药物成功释放。此时，DOX的红色荧光出现在细胞核和细胞质中。当孵育时间为16h时，MoS2-PEG的荧光仍只出现在细胞质中，而DOX荧光聚集于细胞核中。上述现象表明，DOX从MoS2-PEG载体上的释放是连续，且释放的DOX最终进入细胞核，在那里与拓扑异构酶II相互作用，导致DNA***和细胞毒性，从而达到治疗效果。
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