一种细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物、制法及应用
阅读说明：本技术 一种细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物、制法及应用 (Cell membrane coated functionalized black phosphorus nano-composite, preparation method and application ) 是由 乔海石 杨立新 叶优清 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物、制法及应用；所述功能化黑磷纳米复合物为包被的细胞膜和通过表面氧化的黑磷并结合功能性分子组成,黑磷表面初步氧化后形成的氧化产物PxOy有利于功能性分子的键连与负载,并结合光热作用促进药物分子的释放以及生物级联反应,达到肿瘤及术后协同治疗的目的；同时结合细胞膜的包被提供器官及肿瘤的靶向能力,提高纳米复合物在血液循环中的稳定性,增加该复合物在靶组织中的浸润并发挥出更优异的治疗效果；该方法所制得纳米复合物稳定性好,易于大量制备,在制备肿瘤靶向药物及术后协同治疗中体现出优异的治疗效果。(The invention discloses a cell membrane coated functionalized black phosphorus nano-composite, a preparation method and application thereof; the functionalized black phosphorus nano-composite consists of a coated cell membrane and black phosphorus oxidized on the surface and combined with functional molecules, an oxidation product PxOy formed after the surface of the black phosphorus is primarily oxidized is beneficial to the bonding and loading of the functional molecules, and the photothermal effect is combined to promote the release of drug molecules and biological cascade reaction, so that the purpose of tumor and postoperative cooperative treatment is achieved; meanwhile, the coating of the cell membrane is combined to provide the targeting capability of organs and tumors, the stability of the nano compound in blood circulation is improved, the infiltration of the compound in target tissues is increased, and a more excellent treatment effect is exerted; the nano-composite prepared by the method has good stability, is easy to prepare in large scale, and shows excellent treatment effect in preparation of tumor-targeted drugs and postoperative cooperative treatment.)
技术领域
本发明涉及一种黑磷纳米复合物，尤其涉及一种细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物，还包括所述复合物的制法及应用。
背景技术
肿瘤是目前最致命和最常见的疾病之一，传统的肿瘤治疗方法主要包括手术切除、放疗、化疗等。然而，单一的肿瘤治疗策略难以有效地清除肿瘤细胞，而且化疗药物由于缺乏选择性易引起毒副作用、肿瘤高度异质性易导致多药耐药等问题，使得患者尽管经历了积极的手术治疗、放化疗却仍面临术后转移和复发的风险。鉴于传统的治疗方法难以达到彻底根除肿瘤的目的，因此寻找一种多模式多功能的肿瘤协同治疗方法是目前抗肿瘤研究亟待解决的问题。
黑磷因其良好的生物相容性，优异的光热转换性能和转换效率，使其在肿瘤治疗领域备受关注，而光热疗法(PTT)已被证明可以有效激活肿瘤免疫微环境。因此，利用黑磷的光热性能以及氧化后赋予其的功能性药物分子的键连和负载能力等优势实现多种治疗方式的组合，联合细胞膜的肿瘤和术后靶向性从而达到肿瘤的协同治疗及抑制术后复发。
发明内容
发明目的：本发明针对现有技术中现有单一治疗及简单的联合治疗的缺点，实现多种治疗方式的协同效应，提供一种细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物，还提供了上述功能化黑磷复合物的制法及应用。
技术方案：本发明的所述的一种细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物，所述纳米复合物包括细胞膜、黑磷和功能性分子，该纳米复合物呈核壳结构，壳层为细胞膜，核层为结合功能性分子的黑磷。
优选的，所述细胞膜为巨噬细胞膜、中性粒细胞膜、表面功能化的巨噬细胞膜或表面功能化的中性粒细胞膜。
优选的，所述功能性分子包括氨基酸类含羧基小分子、含羧基linker、功能性蛋白如葡萄糖氧化酶(GOx)，过氧化物歧化酶。
优选的，所述氨基酸类含羧基小分子为精氨酸、脯氨酸或甘氨酸；所述含羧基linker为甘油酸、苯硼酸或顺乌头酸酐；所述蛋白为葡萄糖氧化酶(GOx)或过氧化氢酶。
本发明所述的细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物的制法，包括以下步骤：
(1)黑磷-精氨酸复合物(BPA)的制备：取4-二甲氨基吡啶(DMAP)、黑磷(BP)、L-精氨酸，在有机溶剂和水的混合液中反应，去除未反应的L-精氨酸，分离，得BPA；
(2)黑磷-精氨酸-葡萄糖氧化酶(BPAG)的制备：取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、葡萄糖氧化酶(GOx)在水中反应；加入步骤(1)制得的BPA，经过反应，分离得到BPAG；
(3)细胞膜的制备：去培养的细胞，经PBS洗涤，胰酶消化后，取消化后的细胞，再经500g 4min离心后用PBS洗涤，加入细胞用裂解缓冲液，匀浆离心，取上清液，离心，取沉淀，冷冻干燥沉淀得纯化的细胞膜；
(4)细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物([email protected])的制备：首先将适量BPAG溶解于PBS中，再取一定量细胞膜溶解于乙醇和PBS的混合液中，两者经混合水浴超声后，再取适量PBS，利用纳米沉淀法组装得到所述细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物。
优选的，步骤(1)中，所述4-二甲氨基吡啶(DMAP)、黑磷(BP)、L-精氨酸的摩尔比为1：1：5～10；所述有机溶剂为N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)。
优选的，步骤(2)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、葡萄糖氧化酶(GOx)的摩尔比为2：1：4～8。
优选的，步骤(4)中，所述细胞膜和BPAG的摩尔比为10～20：1。
本发明还公开了细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物的应用，所述功能化黑磷纳米复合物可应用于制备肿瘤靶向药物及术后协同治疗的药物。
发明原理：本发明通过温和的化学反应，一方面，黑磷(BP)表面初步氧化后形成的氧化产物PxOy赋予其功能化修饰特性，有利于功能性分子的键连与负载，BP本身的光热作用促进GOx催化葡萄糖生成过氧化氢，过氧化氢进一步在升温的作用下促进精氨酸释放NO并由此引发一系列生物级联反应。该修饰方法保护的黑磷的光热作用，实现了肿瘤及术后协同治疗的目的。另一方面，细胞膜及功能化修饰后的细胞膜的包被使得功能化的黑磷纳米复合物不仅具备器官及肿瘤的靶向能力，提高了纳米复合物在血液循环中的稳定性，增加了在靶组织中的浸润，也赋予了该复合物在细胞膜表面进一步修饰其他功能性分子的能力。综上所述，该方法所制得纳米复合物稳定性好，易于大量制备，在原位荷瘤小鼠体内显示出优异的治疗效果，进而为肿瘤及术后的治疗提供一种新的途径和策略。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)本发明的细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物，复合物本身具有光热效果好，稳定性突出，生物级联释放的优点：
(2)本发明的细胞膜包被的功能化黑磷纳米复合物的制法具有反应条件温和，产率高，抑郁大量制备的优点。
(3)在制备肿瘤靶向药物及术后协同治疗的药物方面，本发明的功能化黑磷纳米复合物，具有靶向性能好，治疗效果显著的优点，由动物实验结果可知细胞膜的包被以及生物级联反应效果的发挥使得[email protected]组的肿瘤抑制效果显著高于其他组，从术后模型结果可以得知，[email protected]组可以显著抑制肿瘤的复发。
附图说明
图1为黑磷的TEM图谱和粒径图谱；
图2为BPA的TEM图谱和粒径图谱；
图3为BPAG的TEM图谱和粒径图谱；
图4为[email protected]的TEM图谱和粒径图谱；
图5为BP、BPA、BPAG、[email protected]的电位图谱；
图6为BPAG在相同照射时间下H202释放图谱；
图7为BPAG在不同照射时间下的H202释放图谱；
图8为脑胶质瘤荷瘤小鼠治疗效果图；
图9为动物治疗后各组肿瘤荧光大小数据图。
图10为脑胶质瘤荷瘤小鼠术后治疗效果图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
(1)BPA的合成：将10mg黑磷分散在2mL DMF中，加入100mg L-精氨酸和10mg DMAP。混合物在30℃条件下，磁力搅拌反应8h。反应完成后将反应液透析用6h，以去除未反应的精氨酸。透析完成后，17000×g离心4min，并用去离子水清洗三遍，最终产物于4℃条件下保存。
(2)BPAG的合成：将1mg GOx溶于5mL去离子水中，缓慢滴加25mg EDC和50mg NHS，室温下搅拌反应1h后，再向混合物中加入10mg BPA。反应液在30℃油浴中反应就，然后进行透析，除去未反应的GOx。透析完成后，17000×g离心4min，并用去离子水清洗三遍，最终产物于4℃条件下保存。
(3)[email protected]的合成：将1mg细胞膜通过涡流重新溶解在1ml PBS中。用水浴超声将1mg BPAG分散至1mL PBS中。在超声条件下将细胞膜溶液缓慢滴入100μL BPAG溶液中,超声5min，得[email protected]。
实施例2
(1)BPA的合成：将105mg黑磷分散在2mL DMF中，加入100mg L-精氨酸和15mgDMAP。混合物在30℃条件下，磁力搅拌反应8h。反应完成后将反应液透析用6h，以去除未反应的精氨酸。透析完成后，17000×g离心4min，并用去离子水清洗三遍，最终产物于4℃条件下保存。
(2)BPAG的合成：将1.5mg GOx溶于5mL去离子水中，缓慢滴加38mg EDC和75mgNHS，室温下搅拌反应1h后，再向混合物中加入15mg BPA。反应液在30℃油浴中反应就，然后进行透析，除去未反应的GOx。透析完成后，17000×g离心4min，并用去离子水清洗三遍，最终产物于4℃条件下保存。
(3)[email protected]的合成：将2mg细胞膜通过涡流重新溶解在1ml PBS中。用水浴超声将1mg BPAG分散至1mL PBS中。在超声条件下将细胞膜溶液缓慢滴入100μL BPAG溶液中,超声5min，得[email protected]。
实施例3
[email protected]的表征和合成
(1)BPA的合成：将20mg黑磷分散在2mLDMF中，加入100mgL-精氨酸和20mgDMAP。混合物在30℃条件下，磁力搅拌反应8h。反应完成后将反应液透析用6h，以去除未反应的精氨酸。透析完成后，17000×g离心4min，并用去离子水清洗三遍，最终产物于4℃条件下保存。
(2)BPAG的合成：将2mgGOx溶于5mL去离子水中，缓慢滴加50mgEDC和100mgNHS，室温下搅拌反应1h后，再向混合物中加入10mgBPA。反应液在30℃油浴中反应就，然后进行透析，除去未反应的GOx。透析完成后，17000×g离心4min，并用去离子水清洗三遍，最终产物于4℃条件下保存。
(3)[email protected]的合成：将2mg细胞膜通过涡流重新溶解在1ml PBS中。用水浴超声将1mgBPAG分散至1mLPBS中。在超声条件下将细胞膜溶液缓慢滴入100μL BPAG溶液中,超声5min，得[email protected]。
粒径图谱及电位的测定：各取适量黑磷，BPA，BPAG，[email protected]，分别测定其在PB7.4中的水动力直径。由附图1-4结果可知，BP的粒径在77nm左右，BPA的粒径在118nm左右，BPAG的粒径在119nm左右，[email protected]的粒径在134nm左右。由附图5可知BP的电位在-20mv左右，BPA的电位在10mv左右，BPAG的电位在-1.5mv左右，[email protected]的电位在-9.8mv左右。
H2O2产生的测定
将各实施例中制得的[email protected]溶解于葡萄糖溶液中，用近红外光(波长为808nm)照射，促进GOx氧化葡萄糖，并释放H2O2。
H2O2产生的测定：取一定量的BPAG，在含有1mg/mL葡萄糖的PBS溶液中测定近红外光照射下的H2O2产生量。该实验分为两组，一组为在1mg/mL葡萄糖的PBS溶液中，浓度为1mg/mL的BPAG溶液分别照射0，1，3，5，7，10min，另一组为在1mg/mL葡萄糖的PBS溶液中，浓度为1mg/mL的BPAG溶液分别照射10min。由附图6-7可知，近红外光照射1min时就能明显促进H2O2的产生，H2O2的产生能引起更好的肿瘤杀伤效果。
实施例4
纳米反应器联合治疗脑胶质瘤评价
采用GL261-Luc荷瘤小鼠评价脑胶质瘤的体内抗肿瘤效果。原位胶质瘤建立后，将小鼠按照上述实施例随机分为5组以验证各组对于肿瘤的治疗效果，分别为PBS、[email protected](4mgkg-1，按BP计算)、[email protected]+NIR、[email protected](6mg kg-1，按BP计算)、[email protected]+NIR。每组荷瘤小鼠尾静脉注射100μL。注射8小时后，近红外激光(0.8W/cm2)照射肿瘤20分钟。在注射d-荧光素钾盐后，每3天使用IVIS设备对荷瘤小鼠的生物发光强度进行成像，以确定肿瘤生长情况。由附图8可知，PBS，[email protected]和[email protected]+NIR不能抑制肿瘤的生长。而[email protected]和[email protected]+NIR组的结果表明，[email protected]和[email protected]+NIR组都能实现对肿瘤的抑制。通过对各组的ROI值结果进行进一步的比较可以表明，由附图9的结果可以看出，各组肿瘤的生长趋势与附图8的结果吻合。
实施例5
纳米反应器联合治疗术后脑胶质瘤评价
采用GL261-Luc荷瘤小鼠评价术后脑胶质瘤模型的体内抗肿瘤效果。原位胶质瘤建立后，待肿瘤生长5天后，将小鼠按照上述实施例随机分为3组以验证各组对于肿瘤的治疗效果，分别为PBS、BPAG(6mg kg-1，按BP计算)、[email protected]。分完组后将各组老鼠脑胶质瘤清理干净，待第二天后给每组小鼠尾静脉注射100μL。注射8小时后，近红外激光(0.8W/cm2)照射肿瘤20分钟。在注射d-荧光素钾盐后，每3天使用IVIS设备对荷瘤小鼠的生物发光强度进行成像，以确定肿瘤生长情况。由附图10可知，PBS和BPAG组在进行完术后手术后依然有肿瘤的复发，[email protected]组都能实现对肿瘤术后复发的抑制。
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