具体实施方式

本发明选择性的抑制肠道内次级胆汁酸的量，而不影响初级胆汁酸，也不影响95％的胆汁酸的肝肠循环。事实上，此前大量的研究和临床用药证明，直接去干扰所有胆汁酸的肝肠循环既会造成比较严重的副作用，比如肝脏损害，严重便秘，影响脂溶性维生素及其他营养成分的吸收，出血倾向，胆结石等，并且疗效也欠佳。而本发明恰恰解决了这些问题。

肠道细菌的7α-脱羟反应是胆汁酸转化成初级胆汁酸的最后一步，通常肠道内的专属厌氧菌和革兰氏阴性菌表达具有7α-脱羟功能的酶。在其他科学研究表明，某些疾病如糖尿病，脂肪性肝炎，肠道息肉等患者肠道内的表达7α-脱羟反应的革兰氏阴性菌显著升高。肠道细菌的 7α-脱羟反应种类较多，因此，开发一个能够广谱抑制这些7α-脱羟反应的分子尤为关键。申请人的研究表明，肠道细菌的7α-脱羟反应有一个共性是都对环境pH敏感，最适的酶活性pH 为7左右，pH降低到6酶活性只有50％，降低到5以下，酶的活性不到25％。

我们筛选了大量能够用于降低肠道pH的分子，比较理想的是一些酸性较强的可食用药用的有机酸，短链脂肪酸，或酸性氨基酸。但是这些分子口服后很快会在上消化道分解和吸收，几乎不能到达结肠。

我们把抑制7α-脱羟反应的分子包裹于包衣中且在结肠定位释放系统，这样口服后可以保护里面的药物分子不被降解或吸收，一直到达结肠才开始释放出来。

目前现有技术中，已经有很多种制剂方法可以将物质递送至结肠进行释放。口服结肠定位释放制剂，该类释放制剂口服后，在胃内和空肠保持完整，进入回肠末端后，能按设计要求释放物质，达到速释和缓释的目的。例如，可采用包肠溶衣的释放制剂。亦即，可根据要求，选用适宜pH范围溶解的聚合物。也可以采用定时释放制剂，通过改变释放制剂时滞的长短控制药物释放的时间和位置。也可以利用结肠菌群独特的酶如结肠β-葡萄苷酶降解包衣，激活里面药物的释放，许多高分子材料在结肠被这些酶所降解，而这些高分子材料作为药物载体在胃、小肠由于相应酶的缺乏不能被降解，这就保证药物在胃和小肠不释放。如果胶、瓜耳胶、偶氮类聚合物和α，β，γ-环糊精均可成为结肠给药体系的载体材料。

口服回肠末端定位释放制剂的实例包括但不限于在综述文章或专利中披露的方法，例如 Colon Targeted Drug Delivery Systems:A Review on Primary and NovelApproaches Oman Medical Journal 2010,Volume 25,Issue 2；Colon-Targeted OralDrug Delivery Systems:Design Trends and Approaches，AAPS PharmSciTech,Vol.16,No.4,August 2015；以及 CN201680001612.X；US9993435B2；US 5525634,US5866619,US9993435中记载的技术方案。此类剂型可使用不同比例的羟丙甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球体或其组合来提供所需的释放特性，以提供一种或多种活性成分的在结肠释放。

优选地，我们采用结肠独特的酶系激活系统(或结合pH值敏感型的包衣)将抑制7α- 脱羟反应的分子递送到结肠。所述的结肠独特的酶系激活层，其主要包含果胶等多糖类物质，并包覆于活性成分(制7α-脱羟反应的分子)外面；而pH敏感层，采用现有的包含任何在pH达到或超过7条件下可溶解的高分子材料组合物，并包覆于所述结肠独特的酶系激活层外面。

本发明另外一个重要的设计是把活性成分装载在缓释载体里，其外面再加上结肠定位层。这样的缓释载体可以避免活性成分爆发式释放，使得化合物在结肠道内缓慢均匀的释放数个小时，从而持久的降低结肠道内的pH。

缓释技术是现有技术，目前常用的缓释载体有树脂、活性炭、乙基纤维素、二氧化硅等，这样的缓释载体可以使得化合物在结肠道内缓慢均匀的释放达6个小时，从而持久的降低结肠肠道内的pH，持久抑制7α-脱羟反应的活性，降低次级胆汁酸的浓度。

通过摄取这样的制剂治疗的状况包括但不限于，非酒精性脂肪性肝病、糖尿病、结直肠癌、结直肠息肉、溃疡性结直肠炎、克罗恩病、代谢综合征。

本发明的药物组合物的治疗有效量将依赖许多因素。例如，受试者的人种/物种、年龄和体重、需要治疗的确切状况及其严重程度、制剂的性质。治疗有效量最终应当由医生进行判断。无论如何，用于治疗患有非酒精性脂肪性肝病、糖尿病、结直肠癌、结直肠息肉、溃疡性结直肠炎等疾病以及相关状况的患者的药物有效量通常应当是0.1至5000mg/kg接受者(哺乳动物)的体重/天。更通常，有效量应当是1至200mg/kg体重/天。因此，对于50kg体重的成年哺乳动物，每天的实际量通常是从50mg至10g。该数量可能以每天单剂量给予或以每天若干(如2、3、4、5或更多)分剂量给予，使得总日剂量是相同的。

在治疗疾病过程中，本发明的制剂可以和一种或多种其他药物活性剂联合。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1 pH对肠道细菌7α-脱羟反应的活性的影响

柔嫩梭菌(Clostridium leptum)体外厌氧培养(80％氮气-10％二氧化碳-10％氢气)研究其7α-脱羟反应在不同的pH环境把胆酸转换成为次级胆汁酸脱氧胆酸的活性。柔嫩梭菌悬浮液+2uM胆酸+50mM磷酸二氢钾缓冲液，加入一定量的枸橼酸或谷氨酸调节pH至6或5。 37摄氏度60分钟。反应结束时向试管内加入1.0ml 0.5N盐酸终止酶的反应。

7α-脱羟反应的活性如图1所示，证实肠道细菌的7α-脱羟反应最适的酶活性pH为6.5-7， pH降低到6酶活性只有50％，降低到5以下，酶的活性不到20％。

实施例2 谷氨酸-717树脂的缓释制剂

本实施例中选用谷氨酸作为抑制肠道细菌7α-脱羟反应的活性分子和阴离子交换树脂717 强碱性阴离子交换树脂(Amberlite 717，简称717树脂)作为缓释载体。

i.717树脂的预处理

苯乙烯-二乙烯基苯组成的717树脂共聚物被用来封装谷氨酸。它具有季铵阳离子基团和活性氯离子。通过取代与季铵基团相连的氯离子，药物离子可以负载在树脂中。具体来说，将一定量的717树脂浸入50℃的去离子水中洗涤，以除去水溶性杂质，然后在搅拌下将其转移到95％乙醇中，以除去有机杂质。用去离子水洗涤直至没有残留的乙醇存在后，在50℃的真空下干燥。将预干燥的717树脂在恒定搅拌下浸入0.1mol/l盐酸溶液中24h，然后用去离子水洗涤至中性并干燥，得到阴离子(Cl^-)交换树脂。

ii.准备谷氨酸-717树脂的缓释制剂

离子交换树脂主要通过离子交换反应来封装药物。在本实施例中，我们采用谷氨酸。将纯化的谷氨酸(0.50g)在40℃的磁力搅拌下溶解于去离子水50mL，将1g树脂加入，继续搅拌12h。将上清液倒出，用水洗涤数次，自然晾干，得到负载谷氨酸的树脂。

将一定量的负载谷氨酸的树脂转移至小烧杯中，加入50ml溶液(甲酸：水75：25，v/v)，在每个预定时间内部从TBSS水溶液中收集样品，并通过高效液相色谱(HPLC)测定并计算谷氨酸的负载量。树脂谷氨酸的载药量(Q)根据以下公式计算：

Qt＝V/WR.(C0-Ct)

其中Qt是在时间t树脂的载药量。C₀是初始药物浓度，C_t是时间t的药物浓度。V是药液的体积，W_R是树脂的质量。

实施例3 制备结肠定位释放的缓释谷氨酸制剂

结肠独特的酶系激活层，其主要包含果胶等多糖类物质，并包覆于活性成分外面；而pH 敏感层，采用现有中包含任何在pH达到或超过7条件下可溶解的高分子材料组合物，并包覆于结肠独特的酶系激活层外面。活性成分是抑制7α-脱羟反应的分子。

20％尤特奇S100，15％柠檬酸三乙酯以及5％的滑石粉，三组份加入到乙醇中搅拌混匀。采用包衣机温度控制在45℃左右均匀喷涂在明胶胶囊壳上，即形成pH敏感层膜，其只在pH7 时溶解。

取2gβ-环糊精聚合物或果胶钙、羟丙甲基纤维素溶解在10毫升二甲基亚砜DMSO中。吸取10ul该溶液添加到上述胶囊内，在55℃的干燥10h。在冷却到室温后，即得到对结肠菌群酶系激活层。

将实施案例2中的谷氨酸-717树脂装入上述制备好的胶囊，即制备成了结肠定位释放的缓释谷氨酸制剂。

将上述谷氨酸制剂置于小鼠胃液、小肠液和结肠液中，如图2所示，表明这样的胶囊可以耐受胃及小肠中上端的酸性环境，并且只能被结肠部位特有的菌群的酶触发而溶解，可效增强对结肠部位的选择性。

实施例4 制备结肠定位释放的缓释枸橼酸制剂

本实施例中选用717强碱性阴离子交换树脂作为缓释载体。

i.717树脂的预处理

苯乙烯-二乙烯基苯组成的717树脂共聚物被用来封装谷氨酸。它具有季铵阳离子基团和活性氯离子。通过取代与季铵基团相连的氯离子，药物离子可以负载在树脂中。具体来说，将一定量的717树脂浸入50℃的去离子水中洗涤，以除去水溶性杂质，然后在搅拌下将其转移到95％乙醇中，以除去有机杂质。用去离子水洗涤直至没有残留的乙醇存在后，在50℃的真空下干燥。将预干燥的717树脂在恒定搅拌下浸入0.1mol/l盐酸溶液中24h，然后用去离子水洗涤至中性并干燥，得到阴离子(Cl-)交换树脂。

ii.准备枸橼酸-717树脂的缓释制剂

将纯化的枸橼酸(2.0g)在室温下溶解于去离子水50mL中，加入3g阴离子交换树脂，室温下搅拌12h。将上清液倒出，用水洗涤数次，自然晾干，得到负载枸橼酸的树脂。测得1.0g 树脂负载1.2g至1.5g枸橼酸。

把枸橼酸-树脂加入按照实施例3方法制备的或其他可商业购买的结肠定位释放胶囊，则获得结肠定位释放的缓释枸橼酸制剂。

如图3所示，为将枸橼酸-树脂加入按照实施例3方法制备的结肠定位释放胶囊释放结果图，表明这样的胶囊可以耐受胃及小肠中上端的酸性环境，并且只能被结肠部位特有的菌群的酶触发而溶解，可有效增强对结肠部位的选择性。

以下实验中记载采用本实施例制备的缓释枸橼酸制剂均指为将枸橼酸-树脂加入按照实施例3方法制备的结肠定位释放胶囊获得制剂。

实施例5 结肠定位释放7α-脱羟反应抑制剂的动物实验

8只大鼠(SPF级，体重220g-260g)，室温25摄氏度，自由进食和饮水。在摄取药物前一天取粪便样本。结肠定位释放的缓释枸橼酸制剂(实施例4制备)(采用小动物专用尺寸明胶胶囊制备)1g/Kg体重口服灌胃，连续4周，取粪便样本，检测其治疗前后初胆汁酸和次级胆汁酸含量，结果如表1：

表1

可见，经治疗后粪便内的次级胆汁酸绝对量和比值均显著下降，总胆汁酸也显著下降。

上述实验组大鼠完成实验后，取5只空白对照组大鼠(SPF级，体重220g-260g，室温25 摄氏度，自由进食和饮水)麻醉后取相应消化道组织立刻检测pH，结果如表2：

表2

可见，治疗后结肠pH显著下降(P<0.01)。

实施例6 结肠定位释放的缓释7α-脱羟反应抑制剂

分别测试了结肠定位释放的缓释天冬氨酸(Asp)、苹果酸、乙酸、丁酸等物质对结肠pH 影响及检测其治疗前后粪便样本初胆汁酸和次级胆汁酸含量，制备方法同实施例4，试验方法如实施例5，结果如下：

天冬氨酸(Asp)：

表3

苹果酸：

表4

乙酸：

表5

丁酸：

表6

可见，采用上述酸类，可以达到类似的实验结果。

实施例7 结肠定位释放的缓释谷氨酸制剂治疗非酒精脂肪性肝炎和肝癌

SPF级C57BL/6J小鼠，出生一个月后开始喂养高脂饲料(D12492,含60kcal％脂肪)12周，饮食和饮水不受限。在小鼠出生第2天腹腔注射200ugSTZ一次(STZ配制于pH4.5的0.1M柠檬酸盐酸缓冲溶液)。第12周取4只小鼠麻醉后取肝脏组织病理检测，试验完成后小鼠颈椎脱臼处死。造模成功的非酒精脂肪性肝病和肝癌小鼠继续分成两组试验，一组恢复正常饲料，一组正常饲料外灌喂3％结肠定位释放的缓释谷氨酸制剂(实施例3制备)，饮食和饮水均不受限。继续12周治疗时间。治疗第6，12周分别取6只小鼠麻醉后取肝脏组织病理检测，试验完成后小鼠颈椎脱臼处死。在整个实验过程中，小鼠尾尖血，体重等指标每周采集一次。

结果，结肠定位释放的缓释谷氨酸制剂治疗组小鼠非酒精脂肪性肝炎得和肝癌得到完全缓解。如图4所示：A B为12周建立的非酒精脂肪性肝炎-肝纤维化-肝癌模型肝组织病理切片 C为继续12周的对照组；D、E为继续12周结肠定位释放的缓释谷氨酸制剂治疗组。ALT指标也恢复的正常范围，如图5所示。

实施例8 糖尿病模型小鼠的研究

上述实施例6建立的小鼠模型同样适用于糖尿病模型的研究。SPF级C57BL/6J小鼠，出生一个月后开始喂养高脂饲料(D12492,含60kcal％脂肪)12周，饮食和饮水不受限。在小鼠出生第2天腹腔注射200ug STZ一次(STZ配制于pH4.5的0.1M柠檬酸盐酸缓冲溶液)，小鼠出现二型糖尿病。一组6只恢复正常饲料，一组6只正常饲料外灌喂3％结肠定位释放的缓释谷氨酸制剂(实施例3制备)，饮食和饮水均不受限。继续12周治疗时间。在整个实验过程中，小鼠尾尖血，体重等指标每周采集一次。

结果如图6，显示结肠定位释放的缓释谷氨酸制剂可以显著改善血糖代谢，空腹血糖和胰岛素抵抗指数治疗后恢复到正常水平，与对照组相比有显著差异。

实施例9 结肠定位释放的缓释枸橼酸制剂对结直肠腺瘤及结直肠癌的防治作用

6周龄SPF级C57BL/6J小鼠室温约25摄氏度，自由进食和饮水。腹腔注射氧化偶氮甲烷 (AOM，10mg/kg),每周两次，连续6周。分成两组，在腹腔注射AOM开始时，同时启动药物干预。空白对照组；治疗组灌喂结肠定位释放的缓释枸橼酸制剂(实施例4制备) 500mg/Kg/day。试验第15周，第30周分别取小鼠麻醉颈椎脱臼处死，取结肠组织分析。腺瘤数量如表7：

表7

可见，与对照组相比结肠定位释放的缓释枸橼酸制剂治疗组显著减少了腺瘤的形成， P<0.001。

图7示为空白对照组的小鼠，30％出现了高级别上皮内瘤变(high gradeintraepithelial neoplasia,HGIN)甚至原位癌，而治疗组腺瘤数量很少，没有出现高级别上皮内瘤变或原位癌。

本领域技术人员能够确认和知晓的是：上述实例仅仅是目前已知的一个较优方案，并不限于实施例中所列举的具体制剂形式，只要是能够将抑制肠道菌群7α-脱羟反应和次级胆汁酸形成的分子通过结肠定位释放系统均可。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。