阅读说明：本技术 一种密蒙花醇提取物的应用 (Application of alcohol extract of buddleja officinalis ) 是由 姚期凤 姜丹 吴越 王越 蒋耀权 章漳 于 2018-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种密蒙花醇提取物的应用,具体为在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。密蒙花醇提取物可以促进胞外基质合成和稳定基底膜结构完整,稳固皮肤结构的作用,诱导细胞修复相关的及抗衰老相关的基因表达,提高皮肤的结构的稳定和延缓衰老的功效；在特定的浓度范围下,可使皮肤抗衰老相关基因的表达量上调至1.36倍以上,最高可达2.13倍。该发现对于日后研发抗衰老相关的护肤品或者化妆品有重要意义。(the invention discloses application of a buddleja officinalis alcohol extract, in particular to application of the buddleja officinalis alcohol extract in preparation of an expression up-regulating agent of a skin aging resistant gene. The alcohol extract of flos Buddlejae can promote synthesis of extracellular matrix, stabilize basement membrane structure, stabilize skin structure, induce cell repair-related and anti-aging-related gene expression, and improve skin structure stability and antiaging effect; under a specific concentration range, the expression level of the skin anti-aging related gene can be up-regulated to more than 1.36 times, and can reach 2.13 times at most. The discovery is of great significance for developing skin care products or cosmetics related to anti-aging in the future.)

一种密蒙花醇提取物的应用

技术领域

本发明涉及植物提取物领域及日化领域，具体涉及一种密蒙花醇提取物的应用。

背景技术

皮肤覆盖于人体表面，与外界环境直接接触，除了能够保护机体免受外界各种因素的伤害，同时作为一面镜子反应机体的健康状态。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、***及肌肉。真皮和表皮的连接的细胞外基质区域又称为基底膜(Basement membrane，BM)，不仅可以支撑表皮，而且具有多方面的功能，比如，真表皮连接处作为细胞的选择性通过屏障，通常可以阻止***细胞与基底膜的表皮细胞接触，但允许淋巴细胞、巨噬细胞和神经元突触穿越通过；此外，细胞的形态、细胞的极性、细胞代谢、质膜上蛋白质的分布、细胞存活、细胞的增殖分化、细胞迁移等许多生命现象，均与基底膜有着非常密切的关系。巢蛋白是基底膜的重要组成部分，对维持基底膜的结构和功能必不可少，而基底膜的完整和健康对维持皮肤正常更新是非常必要的。而真皮由细胞和细胞外基质共同构成，成纤维细胞是真皮的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤真皮结构、组成正常的结构和生理功能；细胞外基质是由细胞合成并分泌，围绕细胞相互作用的一类大分子物质，细胞的增殖分化、细胞迁移等许多生命现象，均与细胞外基质有着非常密切的关系。细胞外基质主要由四大类分子组成：胶原、弹性蛋白、糖蛋白及蛋白多糖。细胞外基质通过其分子间不同的精细巧妙缠结交织，构成各种各样的精美三维立体结构，赋予肌肤弹性、抗张强度，使肌肤看起来饱满、充满活力。

SIRT1(sirtuin 1)：著名的长寿基因之一，SIRT1是一类高度保守的蛋白去乙酰化酶，参与调节由能量限制引发的长寿作用，被称为“长寿基因”；SIRT1生理作用复杂，参与调节糖脂代谢、炎症、氧化应激、细胞衰老与凋亡等，与皮肤衰老密切相关。

FGF7(Fibroblast growth factor 7)基因编码的成纤维细胞生长因子7促有丝***和细胞存活活性，并参与多种生物过程，包括胚胎发育，细胞生长，形态发生，组织修复，肿瘤生长和侵袭。这种蛋白质是一种有效的上皮细胞特异性生长因子，其促有丝***活性主要表现在角质形成细胞中，提高皮肤的增殖速率，从而提高皮肤的更新能力，具有抗衰老的功效。

肝素结合表皮生长因子HBEGF(heparin binding EGF like growth factor)是结合并激活EGF受体生长因子的EGF家族的成员。HBEGF在病理生理过程中起关键作用，包括癌症。在人体皮肤的部分厚度损伤后，会产生表皮生长因子，促进细胞增殖，对皮肤伤口愈合有益，同时EGF是表皮生长因子，促进表皮细胞的增殖，维持皮肤年轻态。

NID1(Nidogen)基因编码的蛋白质为巢蛋白1，巢蛋白1是基底膜的重要蛋白，起着连接Ⅳ型胶原和层粘连蛋白5的作用，对基底膜的结构和功能是必不可少的。而基底膜结构和功能的正常与否，决定着皮肤能否正常更新和分化，巢蛋白表达降低，基底膜结构遭到破坏，影响表皮细胞的增殖分化，导致皮肤老化。

FBN1(Fibrillin 1)基因编码的原纤蛋白1是由真皮的成纤维细胞分泌到细胞外基质中的，可作为钙结合微原纤维的结构成分，为整个身体的弹性和非弹性***提供受力结构，同时介导一系列的细胞和基质的相互作用。是***中弹性纤维的重要成分，在弹性组织形成的过程中，原纤蛋白1为存放弹性蛋白原提供骨架，生长成熟弹性纤维的***，皮肤弹性的下降是皮肤衰老的重要特征，原纤蛋白1的表达量与皮肤弹性息息相关，原纤蛋白1表达量的下降也是造成皮肤老化的关键因素。

FN1(Fibronectin 1)基因编码的纤连蛋白，也称纤维连接蛋白，主要介导细胞粘着。纯化的纤连蛋白可增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展，促进细胞的生长，细胞生长与皮肤状态密不可分，纤连蛋白的高表达可以促进细胞生长，使皮肤可以持续更新，抵抗衰老。

因此，研究如何提高皮肤关键部位及功能相关的基因的表达，对于提高皮肤真表皮结构的稳定性，延缓皮肤衰老具有重要意义。

密蒙花(Buddleja officinalis Maxim.)，中药名。又名：染饭花、九里香、小锦花、蒙花、黄饭花、疙瘩皮树花、鸡骨头花，为马钱科、醉鱼草属灌木，落叶灌木，高1～3米。小枝灰褐色，略呈四棱形，密被灰白色绒毛。叶对生，狭椭圆形至线状披针形，长5～15厘米，宽约3厘米，先端渐尖，基部楔形，全缘或有小锯齿，表面被细星状毛，叶脉凹陷，下面密被灰白色至黄色星状茸毛，叶脉***；叶柄长6～10毫米，被灰白色茸毛；托叶在两叶柄基部萎缩成一横线.圆锥花序顶生，长5～12厘米，密被灰白色柔毛，苞片披针形，被绒毛；花萼钟形，先端4裂；花冠筒状，长约1.5厘米，先端4裂，筒部紫堇色，口部橘黄色，内外均被柔毛；雄蕊4，着生于花冠管中部；子房上位，2室，先端被茸毛，花柱短，柱头不裂。蒴果长2～6毫米，2瓣裂，基部具宿存的花萼和花瓣。种子多数，细小，多扁平。花期2～3月。果期7～8月，为马钱科植物密蒙花的干燥花或花蕾，有祛风、凉血、润肝、明目的作用，可治目赤肿痛，多泪羞明，青盲翳障，风弦烂眼。生海拔200-2800米向阳山坡、河边、村旁的灌木丛中或林缘，分布于中国、不丹、缅甸、越南，主产于湖北、四川、陕西、河南。此外，云南、广西、湖南等地亦产。。

密蒙花在宋朝的《开宝本草》首次被记载，在明朝的《本草经疏》中提到：“密蒙花，观《本经》所主，无非肝虚有热所致，盖肝开窍于目，目得血而能视，肝血虚，则为青盲肤翳，肝热甚，则为赤肿，眵泪赤脉，及小儿豆疮余毒，疳气攻眼。此药甘以补血，寒以除热，肝血足而诸证无不愈矣。”清朝的《本草求真》中提到：“密蒙花，甘而微寒……入肝经，除热养营。盖肝开窍於目，目得血而能视，虚则青盲肤翳，热则赤肿眵泪。目中赤脉及小儿痘疮余毒，疳气攻眼，得此甘能补益，寒能除热，肝血足而诸症无不愈矣。然味薄於气，佐以养血之药，更有力焉。”密蒙花水提物及其黄酮类单体成分体外对金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌等具有抑制作用，密蒙花中的毛蕊花苷体外也具有抗真菌活性。密蒙花中分离出的木犀草素、毛蕊花苷、仙人球苷及金石蚕苷体外具有抗氧化活性。密蒙花的主要有效成分和药理研究进展都显示了其在皮肤外用领域，包括提升皮肤活力、抗辐射损伤等方面具有一定的研究价值和应用潜能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏用于提高皮肤抗衰老能力的物质的问题，提供一种密蒙花醇提取物的应用。本发明的密蒙花醇提取物可以提高皮肤抗衰老相关基因的表达，进而起到延缓人皮肤衰老的作用。

本发明首次提出密蒙花醇提取物具有提高细胞外基质基因，基底膜相关基因和抗衰老相关基因表达的能力，稳固皮肤结构，调控真皮中弹性纤维合成，适用于制备具有延缓衰老功效的皮肤外用剂。

本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题：

本发明提供一种密蒙花醇提取物在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。

其中，所述的抗皮肤衰老基因不仅仅局限于与皮肤衰老直接相关的基因，例如参与皮肤组织损伤修复和纤维化过程的基因，还涉及与皮肤衰老间接相关的基因，例如提高其表达可以促进基底膜结构的稳固性并强化真表皮的紧密连接进而抵抗皮肤衰老的基底膜相关基因。所述的抗皮肤衰老基因优选SIRT1基因、FGF7基因、HBEGF基因、NID1基因、FBN1基因和FN1基因中的一种或多种。

所述的密蒙花醇提取物可为本领域常规的密蒙花醇提取物，优选密蒙花C₁～C₅醇提取物；更优选密蒙花乙醇提取物，所述的乙醇优选70～95％乙醇；

所述的密蒙花醇提取物较佳地通过下述方法制得，所述的方法包括：

(1)粉碎密蒙花得粉末；所述的密蒙花较佳地为密蒙花全草；

(2)加入乙醇进行提取，过滤，得滤液；所述的提取的温度较佳地为室温，所述的室温为20-30℃；

(3)蒸发滤液，即得；所述蒸发的程度为蒸发至干。

为了能够更加有效地提取密蒙花中的有效成分：步骤(1)中所述粉末的目数为20～60目；步骤(2)中所述的乙醇优选70％乙醇，所述乙醇添加量较佳地为所述粉碎后的密蒙花的体积的8-12倍，更佳地为10倍；步骤(2)中所述的提取的次数优选1次以上，更优选2次；其中所述的提取较佳地为超声提取，所述超声的频率较佳地为400-550W，更佳地为500W；所述超声的时间为25-40min，较佳地为30min。

步骤(2)中所述的过滤的方法为离心，所述离心的速度较佳地为6000-10000rpm，更佳地为8000rpm，所述离心的时间较佳地为8-12分钟，更佳地为10分钟。

在本发明一较佳实施例当中，所述的密蒙花醇提取物通过下述方法制得，所述的方法包括：

(1)将干燥的密蒙花全草粉碎，得粉末，所述粉末的目数为20目；

(2)加入10倍于所述粉末的体积的70％乙醇于室温下进行500W超声提取2次，每次30min，离心过滤后将滤液合并；所述离心的速度为8000rpm，所述离心的时间为10分钟；

(3)滤液旋转蒸发至干，即得。

利用上述方法制备得到的密蒙花醇提取物在所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的浓度较佳地为0.8～12μg/ml；更佳地为1～10μg/ml；其中，在针对HBEGF基因的表达上调剂中的浓度较佳地为0.8～1.2μg/ml，更佳地为1μg/ml；在针对FGF7和/或FN1基因的表达上调剂中的浓度较佳地为8～12μg/ml，更佳地为10μg/ml。

所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂适用于化妆品或者护肤品中。

若无特殊说明，本发明中提及的“密蒙花提取物”均指的是“密蒙花醇提取物”。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

密蒙花醇提取物可以促进胞外基质合成和稳定基底膜结构完整，稳固皮肤结构的作用，诱导细胞修复相关的及抗衰老相关的基因表达，提高皮肤的结构的稳定和延缓衰老的功效；在特定的浓度范围下，可使皮肤抗衰老相关基因的表达量上调至1.36倍以上，最高可达2.13倍。该发现对于日后研发抗衰老相关的护肤品或者化妆品有重要意义。

附图说明

图1为1μg/mL密蒙花提取物促进FBN1基因表达结果示意图。

图2为10μg/mL密蒙花提取物促进FBN1基因表达结果示意图。

图3为10μg/mL密蒙花提取物促进FN1基因表达结果示意图。

图4为1μg/mL密蒙花提取物促进SIRT1基因表达结果示意图。

图5为1μg/mL密蒙花提取物促进HBEGF基因表达结果示意图。

图6为10μg/mL密蒙花提取物促进SIRT1基因表达结果示意图。

图7为10μg/mL密蒙花提取物促进FGF7基因表达结果示意图。

图8为1μg/mL密蒙花提取物促进NID1基因表达结果示意图。

图9为10μg/mL密蒙花提取物促进NID1基因表达结果示意图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1密蒙花醇提取物的生产

取干燥的密蒙花10g，使用小型药材粉碎机(屹立4两中药粉碎机)粉碎至20目左右，于室温下以10倍体积的70％乙醇500W超声提取2次，每次30min，离心(8000rpm，10min)滤液合并，滤液旋转蒸发至干，得到密蒙花醇提取物约2.7g。

实施例2皮肤模型的制备

从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(NHDF)及人原代角质细胞(NHEK)(提取方法参考文献：伍津津，朱堂友.皮肤组织工程[M].北京：人民军医出版社，2009：72－103)。将人原代成纤维细胞复苏，复苏过程为：将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，离心机1000rpm/min离心10min。将复苏所得细胞使用DMEM培养基在37℃的二氧化碳培养箱中培养一周后，进行消化(将细胞从培养箱中取出，吸弃原培养基，加PBS15mL润洗细胞一次，加8mL 0.05％胰蛋白酶后，于37℃的二氧化碳培养箱中孵育8min，取出，超净台中加10mL含FBS的DMEM培养基，移液枪取出细胞于50mL离心管中，离心机中1000rpm，离心10min后弃上清，细胞待用)后与胶原混合进行真皮阶段培养，于37℃的二氧化碳培养箱中培养3～4天，然后将使用饲养层培养的人原代角质细胞，消化接种(5×10⁴个细胞)到真皮阶段的皮肤模型表面，依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，培养至18天得到可用于检测的3D皮肤模型(制备皮肤模型的具体步骤详见ANNIE F.BLACK,Ph.D.CHARBEL BOUEZ,al.Optimization and Characterization of an Engineered Human SkinEquivalent.TISSUE ENGINEERING Volume 11,Number 5/6,2005.Mary Ann Liebert,Inc.)。

在人原代角质细胞接种到真皮阶段的皮肤模型表面培养至形成3D皮肤模型的第3天至第18天的过程中，根据所使用培养基的不同进行分组，形成空白对照(NT)组、加入密蒙花醇提取物(10μg/mL)的阳性对照组和加入1μg/mL密蒙花醇提取物(1μg/mL)的阳性对照组。

其中，密蒙花醇提取物10μg/mL指所得密蒙花醇提取物在单位体积(mL)培养基中的量为10μg，约0.001wt％。

密蒙花醇提取物1μg/mL指所得密蒙花醇提取物在单位体积(mL)培养基中的量为1μg，约0.0001wt％。

实施例3RNA的提取

剪取3D皮肤模型组织约2*3mm，放入2mL EP管中；加入1mL Trizol，加入2颗钢珠，用组织破碎仪匀浆，50Hz超声5min后；9000rpm、4℃条件下离心1min，将上清液转移到新的1.5mL EP管中；加入200μL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5min；9000rpm、4℃条件下离心15min；移转上层水相(约400μL)于新1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；9000rpm、4℃条件下离心10min；弃上清液后，沉淀用预冷的70％无水乙醇洗1次，8000rpm、4℃条件下离心5min；弃上清液后，沉淀空气干燥5～10分钟后，溶于30μL DEPC(焦碳酸二乙酯)水中；分光光度计测定RNA浓度。

实施例4基因表达分析及结果判定

根据QuantiGene R 2.0Plex Assay试剂盒进行RNA的纯化和基因定量分析，使用luminex平台对基因表达进行分析，结果见图1至图8。

结果判定：

在测定基因表达的试验中，如果相对于未添加提取物的实验组，基因的表达量明显升高，可推断密蒙花可以促进胞外基质合成和稳定基底膜结构完整，稳固皮肤结构的作用，诱导细胞修复相关的及抗衰老相关的基因表达，提高皮肤的结构的稳定和延缓衰老的功效。结果详见图1～图9。

1、密蒙花醇提取物能够提高胞外基质相关基因的表达

根据图1和图2可知，添加密蒙花醇提取物的阳性组(1μg/mL和10μg/mL)，与胞外基质相关的FBN1基因表达分别上调1.52倍和1.83倍，分别较空白对照提高52％和83％，该基因编码合成的原纤蛋白1，是***中弹性纤维的重要成分，在弹性组织形成的过程中，原纤蛋白1为存放弹性蛋白原提供骨架，生长成熟弹性纤维的***，增强和支持皮肤组织结构的稳固性。

根据图3可知，添加密蒙花醇提取物的阳性组(10μg/mL)，与胞外基质相关的FN1基因表达上调1.46倍，较空白对照提高46％，该基因编码合成的纤连蛋白1，主要介导细胞粘着，通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展，促进细胞的生长。

2、密蒙花醇提取物能够提高抗衰老相关基因的表达

根据图4和图6可知，添加密蒙花醇提取物的阳性组(1μg/mL和10μg/mL)，在皮肤模型中与细胞抵御外界不良环境，提高修复力相关的SIRT1基因表达分别上调1.65倍和1.78倍，较空白对照提高65％和78％，该基因编码合成的沉默信息调节因子2的哺乳动物同源物参与调节糖脂代谢、炎症、氧化应激、细胞衰老与凋亡等，说明该提取物有提高细胞修复能力促进创伤修复的作用。

根据图5可知，添加密蒙花醇提取物的阳性组(1μg/mL)，在皮肤模型中与促进细胞增殖及皮肤伤口愈合的HBEGF基因表达上调1.39倍，较空白对照提高39％，说明该提取物有提高细胞修复能力促进创伤修复的作用。

根据图7可知，添加密蒙花醇提取物的阳性组(10μg/mL)，在皮肤模型中与抗衰来相关的FGF7基因表达上调1.36倍，较空白对照提高36％，该基因编码合成的成纤维细胞生长因子7促有丝***和细胞存活活性，其促有丝***活性主要表现在角质形成细胞中，具有抗衰老的功效。

3、密蒙花醇提取物能够提高基底膜相关基因表达

根据图8和图9可知，添加密蒙花醇提取物的阳性组(1μg/mL和10μg/mL)，基底膜基因NID1基因表达分别上调1.70倍和2.13倍，较空白对照提高70％和113％，该基因编码合成的巢蛋白1，起着连接Ⅳ型胶原和层粘连蛋白5的作用，起到稳固基底膜结构的作用，促进着皮肤结构的完整性和正常更新。