阅读说明：本技术 大吉岭红茶提取物的应用 (application of red tea extract of Jieming ) 是由 姚期凤 姜丹 吴越 王越 蒋耀权 章漳 于 2018-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种大吉岭红茶提取物的应用,具体为在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。所述的抗皮肤衰老基因可为ELN基因、FBN1基因、COL3A1基因、IGF1基因、CSF2基因、NID1基因和HSPG2基因中的一种或多种。所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂可以增强和支持皮肤组织结构的稳固性,延缓皮肤衰老,可用于化妆品或者护肤品中。(the invention discloses an application of a red tea extract of Guijiling mountains, in particular to an application in preparing an expression up-regulator of an anti-skin aging gene. The skin aging resistant gene can be one or more of ELN gene, FBN1 gene, COL3A1 gene, IGF1 gene, CSF2 gene, NID1 gene and HSPG2 gene. The expression up-regulator of the anti-skin aging gene can enhance and support the stability of the skin tissue structure and delay skin aging, and can be used in cosmetics or skin care products.)

大吉岭红茶提取物的应用

技术领域

本发明涉及植物提取物领域及日化领域，具体涉及一种大吉岭红茶提取物的应用。

背景技术

皮肤覆盖于人体表面，与外界环境直接接触，除了能够保护机体免受外界各种因素的伤害，同时作为一面镜子反应机体的健康状态。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、***及肌肉。真皮和表皮的连接的细胞外基质区域又称为基底膜(Basement membrane，BM)，不仅可以支撑表皮，而且具有多方面的功能，比如，真表皮连接处作为细胞的选择性通过屏障，通常可以阻止***细胞与基底膜的表皮细胞接触，但允许淋巴细胞、巨噬细胞和神经元突触穿越通过；此外，细胞的形态、细胞的极性、细胞代谢、质膜上蛋白质的分布、细胞存活、细胞的增殖分化、细胞迁移等许多生命现象，均与基底膜有着非常密切的关系。巢蛋白和基底膜聚糖是基底膜的重要组成部分，对维持基底膜的结构和功能必不可少，而基底膜的完整和健康对维持皮肤正常更新是非常必要的。而真皮由细胞和细胞外基质共同构成，成纤维细胞是真皮的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤真皮结构、组成正常的结构和生理功能；细胞外基质是由细胞合成并分泌，围绕细胞相互作用的一类大分子物质，细胞的增殖分化、细胞迁移等许多生命现象，均与细胞外基质有着非常密切的关系。细胞外基质主要由四大类分子组成：胶原、弹性蛋白、糖蛋白及蛋白多糖。细胞外基质通过其分子间不同的精细巧妙缠结交织，构成各种各样的精美三维立体结构，赋予肌肤弹性、抗张强度，使肌肤看起来饱满、充满活力。

COL3A1(collagen type Ⅲ alpha 1chain)基因编码Ⅲ型胶原蛋白，该基因编码III型胶原的前α1链，这是一种纤维状胶原蛋白，通常与I型胶原蛋白结合，可以在可延伸的***如皮肤，肺，子宫，肠和血管系统中发现，Ⅲ型胶原蛋白的生成有助于增强和支持皮肤组织结构的稳固性，延缓皮肤衰老。

弹性蛋白ELN基因编码弹性纤维的两种组分之一的弹性蛋白，是主要的细胞外基质的蛋白，在维持皮肤弹性和恢复力起到非常重要的作用，使皮肤柔韧有弹性。在弹性组织形成的过程中，弹性蛋白原相互交联凝聚形成弹性蛋白。弹力蛋白是肌肤组成的重要成分，弹力蛋白在肌肤中仅含5％，却是激发肌肤胶原蛋白和弹性纤维生成的关键，占肌肤70％的胶原蛋白决定肌肤的柔润饱满，弹性纤维决定肌肤的紧致弹力，而弹性纤维的90％是由弹力蛋白组成，因此弹力蛋白的数量决定了肌肤的弹性和是否出现皱纹，弹力蛋白减少，是肌肤衰老的重要原因。

FBN1(Fibrillin 1)基因编码的原纤蛋白1是由真皮的成纤维细胞分泌到细胞外基质中的，可作为钙结合微原纤维的结构成分，为整个身体的弹性和非弹性***提供受力结构，同时介导一系列的细胞和基质的相互作用。是***中弹性纤维的重要成分，在弹性组织形成的过程中，原纤蛋白1为存放弹性蛋白原提供骨架，生长成熟弹性纤维的***。皮肤弹性的下降是皮肤衰老的重要特征，原纤蛋白1的表达量与皮肤弹性息息相关，原纤蛋白1表达量的下降也是造成皮肤老化的关键因素。

CSF2(colony stimulating factor 2)基因编码的蛋白为集落刺激因子2，也称为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，是一种广谱的细胞因子，对早期的造血祖细胞具有促增殖的作用。主要作用于髓系祖细胞，通过与其高亲和力受体结合发挥生物学效应，使其迅速进入细胞周期向粒系和巨噬系分化，最后成为成熟细胞，并能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能。集落刺激因子2是一种重要的细胞长寿因子，与皮肤衰老密切相关。

IGF1(insulin like growth factor 1)基因编码的蛋白是基因编码的蛋白是***1，是一组具有促生长作用的多肽类物质，主要存在于血液循环中。IGF介导生长激素的刺激、调节组织生长和发育，对肌肉体积及力量、身体成分的维持及营养代谢的调节起着重要的作用。***1可以促进角质细胞迁移，促进创面再上皮化，从而延缓皮肤衰老。

NID1(Nidogen)基因编码的蛋白质为巢蛋白1，巢蛋白1是基底膜的重要蛋白，起着连接Ⅳ型胶原和层粘连蛋白5的作用，对基底膜的结构和功能是必不可少的。而基底膜结构和功能的正常与否，决定着皮肤能否正常更新和分化，巢蛋白表达降低，基底膜结构遭到破坏，影响表皮细胞的增殖分化，导致皮肤老化。

硫酸乙酰肝素糖蛋白hspg2(heparan sulfate proteoglycan)基因编码基底膜聚糖蛋白(perlecan)，其是基底膜的一个主要组分，由三个长链的糖胺聚糖连接的核心蛋白组成。Perlecan蛋白是一个多结构域的蛋白聚糖，其结合并交联许多细胞外基质组分和细胞表面分子。现有研究已经表明，该蛋白质与层粘连蛋白、脱脂蛋白、IV型胶原等相互作用，在多种生物活性中起重要作用。Perlecan还可以促进生长因子活性，从而刺激内皮生长和再生成。hspg2基因表达上调能够促进perlecan蛋白的表达，进而促进基底膜结构的稳固性，强化真表皮的紧密连接，延缓皮肤衰老。

因此，研究如何提高皮肤关键部位及功能相关的基因的表达，对于提高皮肤真表皮结构的稳定性，延缓皮肤衰老具有重要意义。

大吉岭红茶(Fopflowry orange pekoe)是小叶种茶树，生长在喜马拉雅山南端，印度西部地区大吉岭镇，与中国西藏开放口岸乃堆拉山口很近。大吉岭又被称为“金刚之洲”，是印度西孟加拉邦的一座小城，位于喜马拉雅山麓，平均海拔为2134米,这一地区是高原地带，地势坡陡，气候凉爽，环境无污染，独特的生态环境，使大吉岭茶具有清雅的麝香葡萄酒的风味和奇异的花果香。大吉岭红茶外形条索紧细，白毫显露，香高味浓，鲜爽。发酵程度达80％左右，初摘茶叶颜色显绿色，次摘茶叶显棕褐色。香气属高香类，被称为麝香葡萄香味茶，香气比较持久，滋味甘甜柔和。汤色清澈明亮，汤色橙黄红艳，令人赏心悦目，被世人誉为“茶中的香槟”。茶叶分四季采摘，3-4月为初摘茶，5-6月为次摘茶，7-8月是雨季茶，9-10月为秋季茶。初摘茶如同中国的明前茶，被视为珍品；次摘茶香气好滋味更显著，这两种茶都很受消费者青睐。

红茶可以帮助胃肠消化、促进食欲，可利尿、消除水肿，并强壮心脏功能。红茶中富含的黄酮类化合物能消除自由基，具有抗酸化作用，降低心肌梗塞的发病率。中医认为，茶也分寒热，红茶、普洱茶偏温，较适合冬天饮用。红茶中的多酚类化合物具有消炎的效果，经由实验发现，儿茶素类能与单细胞的细菌结合，使蛋白质凝固沉淀，藉此抑制和消灭病原菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大吉岭红茶提取物的应用，具体为在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂可以增强和支持皮肤组织结构的稳固性，延缓皮肤衰老，可用于化妆品或者护肤品中。

本发明提供一种大吉岭红茶提取物在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用。

所述的抗皮肤衰老基因可为ELN基因、FBN1基因、COL3A1基因、IGF1基因、CSF2基因、NID1基因和HSPG2基因中的一种或多种。

所述的大吉岭红茶提取物可为本领域常规的大吉岭红茶提取物，还可为大吉岭红茶的水提物。

所述的大吉岭红茶提取物可为大吉岭红茶茶叶的提取物。

所述的大吉岭红茶提取物的制备方法可为本领域的常规方法，还可包括下列步骤：

(1)在大吉岭红茶的粉末中加入水进行提取，过滤，得滤液；

(2)滤液干燥后即可。

步骤(1)中，所述的大吉岭红茶的粉末可为大吉岭红茶茶叶的粉末。

步骤(1)中，所述的大吉岭红茶的粉末的目数可为20～60目，还可为20目。

步骤(1)中，所述的水的加入量可为所述大吉岭红茶的粉末的体积的8-12倍，还可为10倍。

步骤(1)中，所述的提取的温度可为80-100℃，还可为90℃。

步骤(1)中，所述的提取的次数可为1次以上，还可为2次。

步骤(1)中，所述的提取的时间可为25-40min，还可为30min。

步骤(1)中，所述的过滤的方法可为离心。所述的离心的速度可为6000-10000rpm，还可为8000rpm。所述的离心的时间可为8-12分钟，还可为10分钟。

步骤(2)中，所述的干燥可为冷冻干燥。

所述的大吉岭红茶提取物的制备还可包括下列步骤：

(1)在大吉岭红茶茶叶的粉末中加入10倍于所述大吉岭红茶茶叶的粉末的体积的水，90℃水浴加热提取2次，每次30min，离心过滤后将滤液合并；所述的大吉岭红茶茶叶的粉末的目数为20目；所述的离心的速度为8000rpm，所述的离心的时间为10分钟；

(2)滤液冷冻干燥后即可。

所述的大吉岭红茶提取物在抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的浓度可为8-120μg/mL，还可为10-100μg/mL。

所述的大吉岭红茶提取物在针对ELN基因的表达上调剂中的浓度可为8-120μg/mL，还可为10-100μg/mL。

所述的大吉岭红茶提取物在针对FBN1基因、IGF1基因、CSF2基因、NID1基因和HSPG2基因中的一种或多种基因的表达上调剂中的浓度可为8-12μg/mL，还可为10μg/mL。

所述的大吉岭红茶提取物在针对COL3A1基因的表达上调剂中的浓度可为80-120μg/mL，还可为100μg/mL。

其中，所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂可用于化妆品或者护肤品中。

所述的大吉岭红茶提取物可用于化妆品或者护肤品中。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：提供一种大吉岭红茶提取物的应用，具体为在制备抗皮肤衰老基因的表达上调剂中的应用，所述的抗皮肤衰老基因的表达上调剂可以增强和支持皮肤组织结构的稳固性，延缓皮肤衰老，可用于化妆品或者护肤品中。

附图说明

图1是10μg/mL大吉岭红茶提取物促进ELN基因表达结果示意图。

图2是10μg/mL大吉岭红茶提取物促进FBN1基因表达结果示意图。

图3是100μg/mL大吉岭红茶提取物促进ELN基因表达结果示意图。

图4是100μg/mL大吉岭红茶提取物促进COL3A1基因表达结果示意图。

图5是10μg/mL大吉岭红茶提取物促进IGF1基因表达结果示意图。

图6是10μg/mL大吉岭红茶提取物促进CSF2基因表达结果示意图。

图7是10μg/mL大吉岭红茶提取物促进NID1基因表达结果示意图。

图8是10μg/mL大吉岭红茶提取物促进HSPG2基因表达结果示意图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1大吉岭红茶提取物的制备

取大吉岭红茶茶叶20g，粉碎至20目左右，加入10倍体积去离子水浸没后，用90℃水浴加热提取30min，离心(8000rpm，10min)过滤得滤液，重复上述提取步骤一次，合并滤液，滤液冷冻干燥，得到大吉岭红茶提取物约5.4g。

实施例2皮肤模型的制备

从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(NHDF)及人原代角质细胞(NHEK)(提取方法参考文献：伍津津，朱堂友.皮肤组织工程[M].北京：人民军医出版社，2009：72－103)。将人原代成纤维细胞复苏，复苏过程为：将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，离心机1000rpm/min离心10min。将复苏所得细胞使用DMEM培养基在37℃的二氧化碳培养箱中培养一周后，进行消化(将细胞从培养箱中取出，吸弃原培养基，加PBS15mL润洗细胞一次，加8mL 0.05％胰蛋白酶后，于37℃的二氧化碳培养箱中孵育8min，取出，超净台中加10mL含FBS的DMEM培养基，移液枪取出细胞于50mL离心管中，离心机中1000rpm，离心10min后弃上清，细胞待用)后与胶原混合进行真皮阶段培养，于37℃的二氧化碳培养箱中培养3～4天，然后将使用饲养层培养的人原代角质细胞，消化接种(5×10⁴个细胞)到真皮阶段的皮肤模型表面，依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，培养至18天得到可用于检测的3D皮肤模型(制备皮肤模型的具体步骤详见ANNIE F.BLACK,Ph.D.CHARBEL BOUEZ,al.Optimization and Characterization of an Engineered Human SkinEquivalent.TISSUE ENGINEERING Volume 11,Number 5/6,2005.Mary Ann Liebert,Inc.)。

实施例3大吉岭红茶提取物的效果测试

1.1皮肤模型的培养

在人原代角质细胞接种到真皮阶段的皮肤模型表面培养至形成3D皮肤模型的第3天至第18天的过程中，根据所使用培养基的不同进行分组，形成空白对照(NT)组、加入大吉岭红茶提取物(100μg/mL)的阳性组和加入10μg/mL大吉岭红茶提取物(10μg/mL)的阳性组。

其中，大吉岭红茶提取物(100μg/mL)，指所得大吉岭红茶提取物在单位体积(mL)培养基中的量为100μg，约0.01wt％。

大吉岭红茶提取物(10μg/mL)，指所得大吉岭红茶提取物在单位体积(mL)培养基中的量为10μg，约0.001wt％。

1.2RNA的提取

剪取3D皮肤模型组织约2*3mm，放入2mL EP管中；加入1mL Trizol，加入2颗钢珠，用组织破碎仪匀浆，50Hz超声5min后；9000rpm、4℃条件下离心1min，将上清液转移到新的1.5mL EP管中；加入200μL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5min；9000rpm、4℃条件下离心15min；移转上层水相(约400μL)于新1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；9000rpm、4℃条件下离心10min；弃上清液后，沉淀用预冷的70％无水乙醇洗1次，8000rpm、4℃条件下离心5min；弃上清液后，沉淀空气干燥5～10分钟后，溶于30μL DEPC(焦碳酸二乙酯)水中；分光光度计测定RNA浓度。

1.3基因表达分析

根据QuantiGene R 2.0Plex Assay试剂盒进行RNA的纯化和基因定量分析，使用luminex平台对基因表达进行分析。

1.4结果判定

在测定基因表达的试验中，如果添加了大吉岭红茶提取物的阳性组相对于空白对照组，基因的表达量明显升高，可推断大吉岭红茶具有促进胞外基质合成、稳定基底膜结构完整、稳固皮肤结构、诱导细胞修复相关的及抗衰老相关的基因表达、提高皮肤结构的稳定性和延缓衰老的功效。

大吉岭红茶提取物的效果总结如下所述。

1、大吉岭红茶提取物能够提高胞外基质相关基因的表达

由图1可知，添加大吉岭红茶提取物的阳性组(10μg/mL)，与胞外基质相关的ELN基因表达上调2.10倍，较空白对照组提高110％。ELN基因编码合成的弹性纤维的两种组分之一的弹性蛋白，是主要的细胞外基质的蛋白，在维持皮肤弹性和恢复力起到非常重要的作用，使皮肤柔韧有弹性。由上所述，本发明大吉岭红茶提取物可通过上调ELN基因的表达，达到促进胞外基质合成、稳固皮肤结构的作用，从而延缓皮肤衰老。

由图2可知，添加大吉岭红茶提取物的阳性组(10μg/mL)，与胞外基质相关的FBN1基因表达上调1.55倍，较空白对照组提高55％。FBN1基因编码合成的原纤蛋白1，是***中弹性纤维的重要成分，在弹性组织形成的过程中，原纤蛋白1为存放弹性蛋白原提供骨架，生长成熟弹性纤维的***，增强和支持皮肤组织结构的稳固性。由上所述，本发明大吉岭红茶提取物可通过上调FBN1基因的表达，达到增强和支持皮肤组织结构的稳固性的作用，延缓皮肤衰老。

由图3可知，添加大吉岭红茶提取物的阳性组(100μg/mL)，与胞外基质相关的ELN基因表达上调1.35倍，较空白对照组提高35％。ELN基因编码合成的弹性纤维的两种组分之一的弹性蛋白，是主要的细胞外基质的蛋白，在维持皮肤弹性和恢复力起到非常重要的作用，使皮肤柔韧有弹性。由上所述，本发明大吉岭红茶提取物可通过上调ELN基因的表达，达到维持皮肤弹性和恢复力的作用，延缓皮肤衰老。

由图4可知，添加大吉岭红茶提取物的阳性组(100μg/mL)，与胞外基质相关的III型胶原基因COL3A1基因表达上调1.37倍，较空白对照组提高37％。由上所述，大吉岭红茶提取物可以促进真皮中III型胶原蛋白的生成，从而合成和装配细胞外基质，增强和支持皮肤组织结构的稳固性，延缓皮肤衰老。

2、大吉岭红茶提取物能够提高抗衰老相关基因的表达

由图5可知，添加大吉岭红茶提取物的阳性组(10μg/mL)，抗衰老基因IGF1基因表达上调1.69倍，较空白对照组提高69％。IGF1基因编码合成的***1，是一组具有促生长作用的多肽类物质，促进细胞***增殖，延缓皮肤衰老。由上所述，本发明大吉岭红茶提取物可通过上调IGF1基因的表达，达到延缓皮肤衰老的作用。

由图6可知，添加大吉岭红茶提取物的阳性组(10μg/mL)，抗衰老基因CSF2基因表达上调2.21倍，较空白对照组提高121％。CSF2基因编码合成的集落刺激因子2，作用于髓系祖细胞，使其迅速进入细胞周期向粒系和巨噬系分化，最后成为成熟细胞，并能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能，可以延缓皮肤衰老。由上所述，本发明大吉岭红茶提取物可通过上调CSF2基因的表达，达到延缓皮肤衰老的作用。

3、大吉岭红茶提取物能够提高基底膜相关基因表达

由图7可知，添加大吉岭红茶提取物的阳性组(10μg/mL)，基底膜基因NID1基因表达上调1.46倍，较空白对照组提高46％。NID1基因编码合成的巢蛋白1，起着连接Ⅳ型胶原和层粘连蛋白5的作用，而基底膜结构和功能的正常与否，决定着皮肤能否正常更新和分化。由上所述，本发明大吉岭红茶提取物可通过上调NID1基因的表达，促进皮肤正常更新和分化，达到延缓皮肤衰老的作用。

由图8可知，添加大吉岭红茶提取物的阳性组(10μg/mL)，基底膜基因HSPG2基因表达上调1.43倍，较空白对照组提高43％。HSPG2基因编码合成的基底膜聚糖，是基底膜的重要组成成分，对基底膜的结构完成非常重要。由上所述，本发明大吉岭红茶提取物可通过上调HSPG2基因的表达，促进基底膜结构的稳定，达到延缓皮肤衰老的作用。