槐花散提取物及其制备和应用
阅读说明：本技术 槐花散提取物及其制备和应用 (Sophora japonica powder extract and preparation and application thereof ) 是由 禹志领 符秀琼 李俊葵 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种槐花散提取物及其制备和应用。该制备方法包括如下步骤：(1)秤取槐花散,粉碎后用乙醇水溶液提取,过滤,得醇提液；所述槐花散包含有槐花和栀子；(2)除去所述醇提液中的乙醇并将所得产物通过大孔树脂,再用乙醇水溶液洗脱大孔树脂,收集洗脱液；(3)除去所述洗脱液中的乙醇,浓缩,干燥。本发明制备得到槐花散提取物,该槐花散提取物具有抗肿瘤的作用,能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖、明显抑制肿瘤生长。同时,本发明的槐花散提取物还对正常细胞毒性低,在一种机体肿瘤生长的同时不影响机体的生长。(The invention provides a sophora japonica powder extract and preparation and application thereof. The preparation method comprises the following steps: (1) weighing flos Sophorae Immaturus powder, pulverizing, extracting with ethanol water solution, and filtering to obtain ethanol extractive solution; the flos Sophorae Immaturus powder contains flos Sophorae Immaturus and fructus Gardeniae; (2) removing ethanol in the ethanol extract, passing the obtained product through macroporous resin, eluting the macroporous resin with ethanol water solution, and collecting the eluate; (3) removing ethanol from the eluate, concentrating, and drying. The sophora japonica powder extract prepared by the invention has an anti-tumor effect, can effectively inhibit the proliferation of tumor cells and obviously inhibit the growth of tumors. Meanwhile, the sophora japonica powder extract has low toxicity to normal cells, and does not influence the growth of an organism while the growth of an organism tumor.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种槐花散提取物及其制备和应用。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。2019年1月，国家癌症中心发布的最新一期全国癌症统计数据指出，近十几年来恶性肿瘤的发病率与死亡率均呈持续上升态势，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2,200亿。目前用于肿瘤治疗的药物价格昂贵，并有较大的毒副作用。因此，迫切需要寻找新型有效、安全、成本较低的抗肿瘤药物。
中医药在预防和***中具有很重要的意义，且大部分中药的价格较低。中药不仅可直接治疗或者预防肿瘤，还可以配合放疗和化疗等，起到增效的作用。此外，中药治疗还可以减轻放疗和化疗的毒副作用，提高患者生存质量，对于晚期肿瘤患者，可服用具有抗癌作用的中药以延长生存期。
槐花散是由槐花和栀子组成，最早记载于《经验良方》，根据记载《普济方》引《经验良方》：“槐花散治臓毒，酒病，便血。槐花(半两生，半两炒)，山栀子一两(去皮，炒)，右为末，每服二钱新汲水调下食前服。”具有清肠止血功效，主治臓毒、酒病，便血。在古代文献中，有不同药物组成的复方也记载为槐花散。
槐花，始载于《日华子本草》，为豆科植物槐(Sophora japonica L.)的干燥花蕾及花。别名：白槐、槐花米、槐籽(中医将槐的花与蕾做相同使用)。功能主治：凉血止血，清肝泻火。用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕。现代药理研究表明槐花具有以下药理作用：(1)抗炎作用；(2)抗病毒、抗真菌作用；(3)抗肿瘤作用：研究发现槐花中所含槲皮素具有抗肿瘤作用；(4)对心血管的作用：槐花具有降压、扩冠等作用；(5)降血脂作用：槐花的主要成分芦丁对脂肪浸润的肝脏有祛脂作用等。
栀子(学名：Gardenia jasminoides Ellis)，又名：黄栀子、山栀、白蟾，是茜草科植物栀子的果实。最早记载于《神农本草经》，《伤寒论》、《闽东本草》、《普济方》、《圣济总录》等均有收载。栀子性味苦寒，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效，主治热病心烦、湿热黄疸、淋证涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡和外伤扭挫伤痛。我国栀子主产于浙江平阳、温岭，湖南湘潭、浏阳，江西永丰、萍乡等地，山东、河南、江苏和安徽等地也有生产。栀子的果实是传统中药，属***颁布的第一批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用。清热，泻火，凉血。治热病虚烦不眠，黄疸，淋病，消渴，目赤，咽痛，吐血，衄血，血痢，尿血，热毒疮疡，扭伤肿痛。现代药理研究表明，栀子在保肝利胆、降血糖、促进胰腺分泌、胃功能保护、降压、调脂、神经保护、抗炎、抗氧化、抗疲劳、抗血栓等方面具有一定的活性。
现代临床研究表明，含有槐花散的复方对消化道出血、肠炎、过敏性紫癜、银屑病等有较好的疗效。至今尚未见槐花散抗肿瘤的研究报道。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一种槐花散提取物的制备方法，所得槐花散提取物具有抗肿瘤的作用，能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖、明显抑制肿瘤生长。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的主要目的是提供一种槐花散提取物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)秤取槐花散，粉碎后用乙醇水溶液提取，过滤，得醇提液；所述槐花散包含有槐花和栀子；
(2)除去所述醇提液中的乙醇并将所得产物通过大孔树脂，再用乙醇水溶液洗脱大孔树脂，收集洗脱液。
在其中一个实施例中，所述槐花散中槐花和栀子的重量比1：(0.1-10)。
在其中一个实施例中，所述槐花散由槐花和栀子组成。
在其中一个实施例中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量不高于95％；或/和，所述乙醇水溶液的重量是所述槐花散重量的5-15倍；或/和，所述提取的方法采用超声提取；或/和，所述提取的次数至少为2次，每次1-4h；或/和，所述大孔树脂为D101大孔树脂。
在其中一个实施例中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为30-95％。
在其中一个实施例中，所述制备方法还去除步骤(2)所得洗脱液中的乙醇并对所得产物进行浓缩、干燥。
本发明的还一目的是提供上述的制备方法获得的槐花散提取物。
本发明的还一目的是提供上述的槐花散提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述肿瘤为黑色素瘤、大肠癌、乳腺癌、白血病、***癌、鼻咽癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、肾癌、淋巴癌、口腔癌、卵巢癌、子***、膀胱癌或甲状腺癌。
在其中一个实施例中，所述肿瘤为黑色素瘤或大肠癌。
本发明的还一目的是提供一种抗肿瘤药物，包含有上述的槐花散提取物及药学上可以接受的辅料。
在其中一个实施例中，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或膏剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明制备得到槐花散提取物，该槐花散提取物具有抗肿瘤的作用，能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖、明显抑制肿瘤生长。同时，本发明的槐花散提取物还对正常细胞毒性低，在一种机体肿瘤生长的同时不影响机体的生长。
附图说明
图1槐花散提取物对小鼠黑色素瘤细胞增殖的影响；
图2槐花散提取物对人黑色素瘤细胞增殖的影响；
图3槐花散提取物对人大肠癌细胞增殖的影响；
图4槐花散提取物对人正常结肠上皮细胞增殖的影响；
图5槐花散提取物对人黑色素瘤细胞凋亡的影响；
图6槐花散提取物对人大肠癌细胞凋亡的影响；
图7槐花散提取物对黑色素瘤荷瘤小鼠肿瘤生长的影响；
图8槐花散提取物对人大肠癌荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本实施例提供一种槐花散提取物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)秤取槐花散，粉碎后用乙醇水溶液提取，过滤，得醇提液；所述槐花散包含有槐花和栀子；
(2)除去所述醇提液中的乙醇并将所得产物通过大孔树脂，再用乙醇水溶液洗脱大孔树脂，收集洗脱液。
在一个实施例中，步骤(1)、步骤(2)中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量不高于95％。为了更好提取槐花散中的抗癌成分，进一步优选乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为30-95％，例如在一个优选例中，乙醇的体积百分含量为70％。
在一个实施例中，步骤(1)中，所述乙醇水溶液的重量是所述槐花散重量的5-15倍。优选地为10倍。
在一个实施例中，步骤(1)中，所述提取的方法采用超声提取。
在一个实施例中，步骤(1)中，所述提取的次数至少为2次，每次1-4h。每次提取时，乙醇水溶液的重量都为槐花散重量的5-15倍。优选地，为10倍。
在一个实施例中，所述槐花散由槐花和栀子组成。
在一个实施例中，所述槐花和栀子的重量比1：(0.1-10)。优选地，为1:0.8-1.2。更优选地为1:1。
在一个实施例中，所述制备方法还去除步骤(2)所得洗脱液中的乙醇并对所得产物进行浓缩、干燥。在一个实施例中，所述浓缩是将除去乙醇的洗脱液浓缩成浸膏，所述干燥具体是将该浸膏干燥至无溶剂残留。
本实施例提供一种上述制备方法获得的槐花散提取物。
本实施例提供一种上述槐花散提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
在一个实施例中，所述肿瘤包括黑色素瘤、大肠癌、乳腺癌、白血病、***癌、鼻咽癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、肾癌、淋巴癌、口腔癌、卵巢癌、子***、膀胱癌、甲状腺癌等多种肿瘤，以及治疗对放疗、化疗药物耐受的肿瘤。肿瘤的种类不受上述例子所限制。
在一个实施例中，所述肿瘤包括黑色素瘤、大肠癌。
一种抗肿瘤药物，包含有所述槐花散提取物及药学上可以接受的辅料。
本实施例所述的辅料例如药用载体、助剂等等。
在一个实施例中，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、膏剂等任何一种剂型。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。本发明不受上述所列剂型所限制。
本实施例所述的抗肿瘤药物包括预防肿瘤药物和***药物，也可以为抗肿瘤药物的辅助药物。抗肿瘤辅助药物，可用于辅助放疗或其他抗肿瘤化疗药物、靶向制剂、免疫疗法、生物疗法等治疗癌症。
实施例1、槐花散提取物的制备
精密称取干燥的槐花和栀子各100g，混合粉碎成粗颗粒(粒径200目)，用体积百分浓度为70％的乙醇水溶液超声提取3次，每次乙醇水溶液的用量为槐花散重量的10倍量，每次提取2小时，过滤，合并滤液，醇提液回收乙醇后过D101大孔树脂，用乙醇水溶液洗脱，回收乙醇浓缩至浸膏，干燥至无溶剂残留，得槐花散提取物。
实施例2、结晶紫染色法观察槐花散提取物对B16F10细胞活性的影响
1、实验材料
(1)DMEM培养基粉末，美国gibco公司生产。
(2)0.5％(品质百分比)胰蛋白酶-EDTA(10X)(Trypsin):含0.5％(质量百分比)(EDTA)，100mL/瓶，美国gibco公司生产。
(3)胎牛血清：500mL/瓶，美国gibco公司生产。
(4)96孔平底培养板：韩国SPL公司生产。
(5)B16F10细胞株(小鼠肿瘤细胞)：购于美国ATCC细胞库，液氮保存。
(6)结晶紫粉末：美国sigma公司生产。
2、实验仪器
(1)二氧化碳培养箱：nu-4750e型，Nuaire公司生产。
(2)离心机：centrifuge 5702型，Eppendorf公司生产。
(3)生物安全柜：nu-425-400e型，Nuaire公司生产。
(4)电子天平：Mettler Toledo公司生产。
(5)倒置显微镜：Leica公司生产。
(6)水浴器：WNB 14，Memmert GmbH+Co公司生产。
(7)微孔板阅读仪：BIO-RAD公司生产。
3、实验方法及结果
取对数生长期小鼠黑色素瘤细胞B16F10，按肿瘤药敏实验方法制成10×104个细胞/ml浓度单细胞悬液(贴壁细胞株用质量百分比0.1％的胰蛋白酶消化后配置)；分别取2ml单细胞悬液加至6孔平底培养板中，37℃、5％(体积分数)CO2培养箱培养24h；用溶剂(溶剂为10％FBS的DMEM培养液)溶解实施例1制备的槐花散提取物，制备成不同浓度(0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml)的槐花散提取物溶解物，吸取该溶解物加入到6孔平底培养板中，每孔2ml；24小时后，弃去DMEM培养液，加入4％***固定液15分钟，弃去***固定液，加入结晶紫染色15分钟，回收结晶紫，洗净，扫描拍照。
结果如图1所示，槐花散提取物显著抑制B16F10小鼠黑色素瘤细胞的增殖。
实施例3、MTT法观察槐花散提取物对A375和A2058细胞活性的影响
1、实验材料
(1)DMEM培养基粉末，美国gibco公司生产。
(2)0.5％(品质百分比)胰蛋白酶-EDTA(10X)(Trypsin):含0.5％(质量百分比)(EDTA)，100mL/瓶，美国gibco公司生产。
(3)胎牛血清：500mL/瓶，美国gibco公司生产。
(4)96孔平底培养板：韩国SPL公司生产。
(5)A375细胞株和A2058细胞株(人肿瘤细胞)：购于美国ATCC细胞库，液氮保存。
(6)MTT试剂粉末：Affymetrix公司生产。
2、实验仪器
(1)二氧化碳培养箱：nu-4750e型，Nuaire公司生产。
(2)离心机：centrifuge 5702型，Eppendorf公司生产。
(3)生物安全柜：nu-425-400e型，Nuaire公司生产。
(4)电子天平：Mettler Toledo公司生产。
(5)倒置显微镜：Leica公司生产。
(6)水浴器：WNB 14，Memmert GmbH+Co公司生产。
(7)微孔板阅读仪：BIO-RAD公司生产。
3、实验方法及结果
取对数生长期人黑色素瘤细胞A375和A2058，按肿瘤药敏实验方法制成5×104个细胞/ml浓度单细胞悬液(贴壁细胞株用质量百分比0.1％的胰蛋白酶消化后配置)；分别取100μl单细胞悬液加至96孔平底培养板中，37℃、5％(体积分数)CO2培养箱培养24h；用溶剂(溶剂为10％FBS的DMEM培养液)溶解实施例1制备的槐花散提取物，制备成不同浓度(0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml)的槐花散提取物溶解物，吸取溶解物，加入96孔平底培养板中；24小时和48小时后分别加入10μl 5mg/ml的MTT，放入二氧化碳培养箱中孵育2小时后，吸走培养液；然后加100μl的DMSO，用酶标仪测吸光度，计算细胞存活率。用以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝((加药组OD平均值-调零孔OD平均值)/(空白对照组OD平均值-调零孔OD平均值))×100％。其中，加药组OD平均值＝各加药组OD值总和/加药组组数；
调零孔OD平均值＝各调零孔OD值总和/调零孔数；
空白对照组OD平均值＝各空白对照组OD值/空白对照组组数；
所述OD值为被检测物吸收掉的光密度，为仪器上直接读取数据。
结果如图2所示，槐花散提取物明显降低A375和A2058人黑色素瘤细胞的活力。
实施例4、MTT法观察槐花散提取物对HCT116、SW620和SW480细胞活性的影响
1、实验材料
(1)DMEM培养基粉末，美国gibco公司生产。
(2)0.5％(品质百分比)胰蛋白酶-EDTA(10X)(Trypsin):含0.5％(质量百分比)(EDTA)，100mL/瓶，美国gibco公司生产。
(3)胎牛血清：500mL/瓶，美国gibco公司生产。
(4)96孔平底培养板：韩国SPL公司生产。
(5)HCT116细胞株、SW620细胞株和SW480细胞株(人肿瘤细胞)：购于美国ATCC细胞库，液氮保存。
(6)MTT试剂粉末：Affymetrix公司生产。
2、实验仪器
(1)二氧化碳培养箱：nu-4750e型，Nuaire公司生产。
(2)离心机：centrifuge 5702型，Eppendorf公司生产。
(3)生物安全柜：nu-425-400e型，Nuaire公司生产。
(4)电子天平：Mettler Toledo公司生产。
(5)倒置显微镜：Leica公司生产。
(6)水浴器：WNB 14，Memmert GmbH+Co公司生产。
(7)微孔板阅读仪：BIO-RAD公司生产。
3、实验方法及结果
取对数生长期人结肠癌细胞HCT116、SW620和SW480细胞，按肿瘤药敏实验方法制成5×104个细胞/ml浓度单细胞悬液(贴壁细胞株用质量百分比0.1％的胰蛋白酶消化后配置)；取100μl分别加至96孔平底培养板中，37℃、5％(体积分数)CO2培养箱培养24h；用溶剂(溶剂为10％FBS的DMEM培养液)溶解实施例1制备的槐花散提取物，制备成不同浓度(0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml)的槐花散提取物溶解物，吸取溶解物，加入96孔平底培养板中，每孔100μl；24小时和48小时后分别加入10μl5mg/ml的MTT，放入二氧化碳培养箱中孵育2小时后，吸走培养液；然后加100μl的DMSO，用酶标仪测吸光度，计算细胞存活率。用以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝((加药组OD平均值-调零孔OD平均值)/(空白对照组OD平均值-调零孔OD平均值))×100％。其中，加药组OD平均值＝各加药组OD值总和/加药组组数；
调零孔OD平均值＝各调零孔OD值总和/调零孔数；
空白对照组OD平均值＝各空白对照组OD值/空白对照组组数；
所述OD值为被检测物吸收掉的光密度，为仪器上直接读取数据。结果如图3所示，槐花散提取物显著降低人结肠癌细胞的活力。
实施例5、MTT法观察槐花散提取物对人正常细胞CCD841CoN细胞活性的影响
1、实验材料
(1)DMEM培养基粉末，美国gibco公司生产。
(2)0.5％(品质百分比)胰蛋白酶-EDTA(10X)(Trypsin)：含0.5％(质量百分比)(EDTA)，100mL/瓶，美国gibco公司生产。
(3)胎牛血清：500mL/瓶，美国gibco公司生产。
(4)96孔平底培养板：韩国SPL公司生产。
(5)CCD841CoN细胞株(人正常结肠上皮细胞)：购于美国ATCC细胞库，液氮保存。
(6)MTT试剂粉末：Affymetrix公司生产。
2、实验仪器
(1)二氧化碳培养箱：nu-4750e型，Nuaire公司生产。
(2)离心机：centrifuge 5702型，Eppendorf公司生产。
(3)生物安全柜：nu-425-400e型，Nuaire公司生产。
(4)电子天平：Mettler Toledo公司生产。
(5)倒置显微镜：Leica公司生产。
(6)水浴器：WNB 14，Memmert GmbH+Co公司生产。
(7)微孔板阅读仪：BIO-RAD公司生产。
3、实验方法及结果
取对数生长期人正常结肠上皮细胞CCD841CoN细胞，按肿瘤药敏实验方法制成10×104个细胞/ml浓度单细胞悬液(贴壁细胞株用质量百分比0.1％的胰蛋白酶消化后配置)；分别取100μl单细胞悬液加至96孔平底培养板中，37℃、5％(体积分数)CO2培养箱培养24h；用溶剂(溶剂为10％FBS的DMEM培养液)溶解实施例1制备的槐花散提取物，制备成不同浓度(0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml)的槐花散提取物溶解物，吸取溶解物，加入96孔平底培养板中，每孔100μl；24小时和48小时后分别加入10μl 5mg/ml的MTT，放入二氧化碳培养箱中孵育2小时后，吸走培养液，然后加100μl的DMSO，用酶标仪测吸光度，计算细胞存活率。用以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝((加药组OD平均值-调零孔OD平均值)/(空白对照组OD平均值-调零孔OD平均值))×100％。其中，加药组OD平均值＝各加药组OD值总和/加药组组数；
调零孔OD平均值＝各调零孔OD值总和/调零孔数；
空白对照组OD平均值＝各空白对照组OD值/空白对照组组数；
所述OD值为被检测物吸收掉的光密度，为仪器上直接读取数据。
结果如图4所示，槐花散提取物对人正常细胞无明显毒性。
实施例6、槐花散提取物对A375细胞凋亡的影响
1、实验材料
(1)DMEM培养基粉末，美国gibco公司生产。
(2)0.5％(品质百分比)胰蛋白酶-EDTA(10X)(Trypsin):含0.5％(质量百分比)(EDTA)，100mL/瓶，美国gibco公司生产。
(3)胎牛血清：500mL/瓶，美国gibco公司生产。
(4)96孔平底培养板：韩国SPL公司生产。
(5)6孔平底培养板：韩国SPL公司生产。
(6)A375细胞株(人肿瘤细胞)：购于美国ATCC细胞库，液氮保存。
(7)Annexin V/PI凋亡检测试剂盒：公司生产。
2、实验仪器
(1)二氧化碳培养箱：nu-4750e型，Nuaire公司生产。
(2)离心机：centrifuge 5702型，Eppendorf公司生产。
(3)生物安全柜：nu-425-400e型，，Nuaire公司生产。
(4)电子天平：Mettler Toledo公司生产。
(5)倒置显微镜：Leica公司生产。
(6)水浴器：WNB 14，Memmert GmbH+Co公司生产。
(7)XL-4型流式细胞仪：美国BD公司生产。
3、实验方法及结果
将A375细胞以1×105个/ml接种于6孔板中，每孔2ml，24小时后分别加入100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的实施例1中的槐花散提取物的溶解物2ml(溶剂为含10％FBS的DMEM培养液)，同时设10％FBS的DMEM培养液为对照，48h后用胰蛋白酶消化，1000rpm/min离心5min，PBS缓冲液洗2次，收集细胞1000rpm/min离心5min后弃去上清，加入100μl的1×binding buffer(结合缓冲液)，加入5μl annexin v-FITC(带用有绿色荧光的荧光探针FITC标记的磷脂结合蛋白)，再加入5μl PI(碘化丙啶)，混匀，室温下避光15min，再加入400μl 1×binding buffer(结合缓冲液)，1h内进行流式细胞仪检测。
结果如图5表所示，槐花散提取物诱导人黑色素瘤细胞凋亡。
实施例7、槐花散提取物对HCT116细胞凋亡的影响
1、实验材料
(1)DMEM培养基粉末，美国gibco公司生产。
(2)0.5％(品质百分比)胰蛋白酶-EDTA(10X)(Trypsin):含0.5％(质量百分比)(EDTA)，100mL/瓶，美国gibco公司生产。
(3)胎牛血清：500mL/瓶，美国gibco公司生产。
(4)96孔平底培养板：韩国SPL公司生产。
(5)6孔平底培养板：韩国SPL公司生产。
(6)A375细胞株(人肿瘤细胞)：购于美国ATCC细胞库，液氮保存。
(7)Annexin V/PI凋亡检测试剂盒：公司生产。
2、实验仪器
(1)二氧化碳培养箱：nu-4750e型，Nuaire公司生产。
(2)离心机：centrifuge 5702型，Eppendorf公司生产。
(3)生物安全柜：nu-425-400e型，，Nuaire公司生产。
(4)电子天平：Mettler Toledo公司生产。
(5)倒置显微镜：Leica公司生产。
(6)水浴器：WNB 14，Memmert GmbH+Co公司生产。
(7)XL-4型流式细胞仪：美国BD公司生产。
3、实验方法及结果
将HCT116细胞以1×105个/ml接种于6孔板中，每孔2ml，24小时后分别加入100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的实施例1中的槐花散提取物的溶解物2ml(溶剂为含10％FBS的DMEM培养液)，同时设10％FBS的DMEM培养液为对照，48h后用胰蛋白酶消化，1000rpm/min离心5min，PBS缓冲液洗2次，收集细胞1000rpm/min离心5min后弃去上清，加入100μl的1×binding buffer(结合缓冲液)，加入5μl annexin v-FITC(带用有绿色荧光的荧光探针FITC标记的磷脂结合蛋白)，再加入5μl PI(碘化丙啶)，混匀，室温下避光15min，再加入400μl 1×binding buffer(结合缓冲液)，1h内进行流式细胞仪检测。
结果如图6表所示，槐花散提取物诱导人结肠癌细胞凋亡。
实施例8、槐花散提取物对黑色素瘤荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
1、实验材料
实验动物：C57BL/6J种小鼠，6-8周龄，雄性，由香港科技大学提供。饲养于香港浸会大学中医药学院实验动物房内。
瘤株：B16F10小鼠肿瘤瘤株，购买于美国ATCC公司，液氮保存。
2、实验方法与结果
取C57BL/6J种雄性小鼠12只，背部皮下接种B16F10肿瘤细胞悬液(1×107个细胞/ml)0.1ml/只，随机将小鼠分为两组：槐花散提取物(HHS；0.1g/kg，临床等效剂量)，空白对照组，两组动物每日灌胃给药连续14天，每三天量一次肿瘤大小，同时记录小鼠体重，停药次日，称体重，量肿瘤大小，处死小鼠，剥离实体瘤、称瘤重、拍照。
结果如图7所示，槐花散提取物显著抑制小鼠体内黑色素瘤的生长。
实施例9、槐花散提取物对人大肠癌荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响
1、实验材料
实验动物：BALB/c-nu/nu种裸鼠，6-8周龄，雄性，由香港中文大学提供。饲养于香港浸会大学中医药学院实验动物房内。
瘤株：HCT116肿瘤瘤株，购买于美国ATCC公司，液氮保存。
2、实验方法与结果
取BALB/c-nu/nu种雄性裸鼠12只，背部皮下接种HCT116肿瘤细胞悬液(2.5×107个细胞/ml)0.1ml/只，随机将小鼠分为两组：槐花散提取物(HHS；0.1g/kg，临床等效剂量)，空白对照组，两组动物每日灌胃给药连续21天，每三天量一次肿瘤大小，同时记录小鼠体重，停药次日，称体重，量肿瘤大小，处死小鼠，剥离实体瘤、称瘤重、拍照。
结果如图8所示，槐花散提取物明显抑制小鼠体内结肠癌的生长。
本发明还通过实验证明，实施例1的槐花散提取物的制备方法在以下范围内均能制备出抗肿瘤效果很好的槐花散提取物：乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量不高于95％；或/和，所述乙醇水溶液的重量是所述槐花散重量的5-15倍；或/和，或/和，所述提取的次数至少为2次，每次1-4h。
综上所述，本发明制备得到槐花散提取物，该槐花散提取物具有抗肿瘤的作用，能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖、明显抑制肿瘤生长。同时，本发明的槐花散提取物还对正常细胞毒性低，在一种机体肿瘤生长的同时不影响机体的生长。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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