阅读说明：本技术 一种丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶及其制备方法和应用 (Composite hydrogel of silk fibroin and polyvinyl alcohol, and preparation method and application thereof ) 是由 汪宜宇 李祥 牛春青 王欣宇 戴余军 张俊华 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明一种丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶及其制备方法,可在短时间内形成水凝胶,而且可有效提高材料的亲水性和凝胶强度,并且在药物缓释应用领域,该水凝胶能够利用聚乙烯醇的分散助溶的作用,负载水凝胶难以负载的疏水性药物,扩展了其作为药物载体的应用范围。本发明还包括以丹皮酚作为疏水性药物模型,丝素蛋白与聚乙烯醇复合凝胶作为药物载体,使丹皮酚以一定的速率缓慢释放,有利于提高药物在治疗部位的滞留时间,使药物浓度在较长时间内保持有效治疗浓度范围,提高生物利用度,达到药物缓释的目的。(The silk fibroin and polyvinyl alcohol composite hydrogel and the preparation method thereof can form hydrogel in a short time, effectively improve the hydrophilicity and the gel strength of the material, and in the field of drug sustained release application, the hydrogel can utilize the dispersing and dissolving-assisting effect of the polyvinyl alcohol to load hydrophobic drugs which are difficult to load, thereby expanding the application range of the hydrogel as drug carriers. The invention also comprises the application of paeonol as a hydrophobic drug model, and silk fibroin and polyvinyl alcohol composite gel as a drug carrier, so that the paeonol is slowly released at a certain speed, the retention time of the drug at a treatment part is favorably prolonged, the drug concentration is kept in an effective treatment concentration range for a long time, the bioavailability is improved, and the purpose of drug sustained release is achieved.)

一种丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于水凝胶技术领域，具体涉及一种丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

蚕丝是人类最早利用的天然蛋白之一，作为一种性能优良的天然纤维，主要应用于纺织业。蚕丝由丝素蛋白与丝胶蛋白组成，且丝素蛋白占总重量约75％。丝素蛋白的氨基酸组成主要为甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，与人体的胶原蛋白氨基酸组成相似，具有良好的生物相容性，能制备成膜、凝胶、微胶囊等多种形态的材料，其中丝素蛋白水凝胶在药物载体、生物医用材料、组织工程领域有着广阔的应用前景。然而，单纯的丝素水凝胶由于其力学性能和溶胀性能较差，限制了其在生物医学领域的应用范围。

聚乙烯醇(PVA)是一种水溶性聚合物，由聚醋酸乙烯醇解而得。聚乙烯醇具有成膜性，抗拉伸性，柔韧性，粘附性，水溶性和吸水性等优良性能。以聚乙烯醇凝胶为载体的透皮给药系统，具有较高含水量，与皮肤表面有很好的耦合性，皮肤无不适感，并有缓释、增稠和稳定作用，在生物材料领域应用广泛。

丹皮酚(Paeonol),又名牡丹酚，主要是从毛茛科芍药属植物牡丹、芍药的根皮和萝摩科植物徐长卿的干燥根或全草中提取出的有效成分，水溶性较差，为疏水性药物。其在抗菌消炎、解热镇痛、抗肿瘤及抗过敏等方面有着良好的药理活性。

发明内容

本发明提供的聚乙烯醇与丝素蛋白复合形成的水凝胶可在短时间内形成，而且可有效提高材料的亲水性和凝胶强度，并且在药物缓释应用领域，该水凝胶能够利用聚乙烯醇的分散助溶的作用，负载水凝胶难以负载的疏水性药物，扩展了其作为药物载体的应用范围。本发明以丹皮酚作为疏水性药物模型，丝素蛋白与聚乙烯醇复合凝胶作为药物载体，使丹皮酚以一定的速率缓慢释放，有利于提高药物在治疗部位的滞留时间，使药物浓度在较长时间内保持有效治疗浓度范围，提高生物利用度，达到药物缓释的目的。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶的制备方法：

1)丝素蛋白的制备：取无水碳酸钠加入沸水中得到无水碳酸钠水溶液，将蚕丝放入所述无水碳酸钠水溶液中进行脱胶，分离所得固体干燥后，用三元溶液或者溴化锂水溶液溶解，将所得溶液装入透析袋中，再放入去离子水中透析48-96h，透析后得到丝素蛋白水溶液；

2)聚乙烯醇水溶液的制备：称取聚乙烯醇(分子量为31000)加入去离子水中，水浴中搅拌至完全溶解，得到聚乙烯醇溶液；

3)丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶的制备：取步骤1)中得到的丝素蛋白水溶液，与步骤2)中得到的聚乙烯醇溶液混合，混合均匀后，依次加入辣根过氧化物酶(HRP)和双氧水(H₂O₂)进行交联，最终得到丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下进一步的具体选择或优化选择。

具体的，步骤1)得到的无水碳酸钠水溶液的浓度为0.05-0.08wt％(优选0.08wt％)，透析期间每2h更换一次去离子水，最终制得的丝素蛋白水溶液浓度为8wt％；步骤1)所述三元溶液由CaCl₂、乙醇和水组成，其中CaCl₂、乙醇和水三者的物质的量之比为1:2:8；所述溴化锂盐溶液的浓度为9.3mol/L。该条件下，可从天然蚕丝中提纯得到高纯度的丝素蛋白水溶液。

具体的，步骤2)中聚乙烯醇水溶液的浓度为6-10wt％，水浴温度为90℃。

具体的，步骤3)所述丝素蛋白水溶液与所述聚乙烯醇溶液等体积混合，交联温度为反应温度为20-40℃，且最终体系中辣根过氧化物酶浓度为10U/ml，双氧水浓度为0.05-20mg/ml。

此外，本发明还提供了使用上述方法制备的一种丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶。常规的丝素蛋白水凝胶制备方法普遍存在凝胶时间较长的问题，其亲水性也有待改善，作为药物载体难以负载疏水性药物。因此本发明提供了一种丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶的制备方法，该方法凝胶时间短，其获得的复合水凝胶具有较好的吸水性，规整的孔结构，并对疏水性药物具有较好的缓释效果。

此外，本发明还提供了一种上述丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶的应用，包括以下步骤：

1)丝素蛋白的制备：取无水碳酸钠加入沸水溶液得到无水碳酸钠水溶液，将蚕丝放入所述无水碳酸钠水溶液中进行脱胶，分离所得固体干燥后，用三元溶液或者溴化锂溶液溶解，将所得溶液装入透析袋中，再放入去离子水中透析48-96h，透析后得到丝素蛋白水溶液；

2)聚乙烯醇水溶液的制备：称取聚乙烯醇(分子量为31000)加入去离子水中，水浴中搅拌至完全溶解，得到聚乙烯醇溶液；

3)丹皮酚聚乙烯醇溶液的配制：称取丹皮酚，水浴搅拌溶解至步骤2)得到的聚乙烯醇溶液中，制得丹皮酚聚乙烯醇溶液；

4)丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶的制备：取步骤1)中得到的丝素蛋白水溶液，与步骤3)中得到的丹皮酚聚乙烯醇溶液混合，混合均匀后，依次加入辣根过氧化物酶(HRP)和双氧水(H₂O₂)进行交联，最终得到负载丹皮酚的丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶。

具体的，步骤1)得到的中无水碳酸钠水溶液的浓度为0.05-0.08wt wt％，透析期间每2h更换一次去离子水，最终制得的丝素蛋白水溶液浓度为8wt％；步骤1)所述三元溶液由CaCl2、乙醇和水组成，其中CaCl2、乙醇和水三者的物质的量之比为1:2:8；所述溴化锂盐溶液的浓度为9.3mol/L。该条件下，可从天然蚕丝中提纯得到高纯度的丝素蛋白水溶液。

具体的，步骤2)中聚乙烯醇水溶液的浓度为6-10wt％，水浴温度为90℃，步骤3)水浴温度为40℃，丹皮酚聚乙烯醇溶液中丹皮酚的浓度为0-4mg/ml。

具体的，步骤4)所述丝素蛋白水溶液与所述聚乙烯醇溶液等体积混合，交联温度为反应温度为20-40℃，且最终体系中辣根过氧化物酶浓度为10U/ml，双氧水浓度为0.05-20mg/ml。

此外，本发明还提供了使用上述方法得到的含丹皮酚的丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中的复合丝素蛋白与聚乙烯醇水溶液能在酶促作用下快速形成凝胶，材料成型方法简单、快捷无毒副作用，制备出的水凝胶具有较好的亲水性，规整的多孔结构。同时，该水凝胶能装载疏水性药物丹皮酚，具有较好的药物缓释效果。解决了丹皮酚这类疏水性药物在水凝胶中难以溶解分散的问题。本发明提供的复合水凝胶有效的利用了二者的优点，改善了单一组分水凝胶的性能，可广泛用于药物载体等生物医用材料领域。

附图说明

图1为实施例2的凝胶实物图，其中A为浓度为8wt％聚乙烯醇水溶液，B为聚乙烯醇和丝素蛋白共混溶液，C为加入辣根过氧化物酶和双氧水后的聚乙烯醇和丝素蛋白共混溶液，D为丝素蛋白与聚乙烯醇复合水凝胶；

图2为实施例1至4与对比例的SEM图，其中A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为对比例；

图3为实施例4获得的含丹皮酚的丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶中丹皮酚的缓释曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图及具体实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

(1)丝素蛋白的制备：称取3g无水碳酸钠加入5L沸水溶液中，将蚕丝100～150g放入沸水溶液中进行脱胶并且于60℃干燥，干燥后将蚕丝用三元溶液溶解，将溶液装入透析袋中，再放入去离子水中透析96h，期间每2h换一次水，透析后得到丝素蛋白水溶液，最终制得浓度为8wt％的丝素蛋白水溶液。

(2)聚乙烯醇溶液的制备：称取聚乙烯醇(分子量为31000)6-10g，加入100ml去离子水，在90℃水浴中搅拌溶解，完全溶解后的到浓度为6-10wt％的聚乙烯醇溶液。

(3)丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶的制备：取(1)中所制备得到的8wt％丝素蛋白水溶液，与(2)中制备的6wt％聚乙烯醇溶液等体积混合。混合均匀后先后加入辣根过氧化物酶(HRP)和双氧水(H₂O₂)进行交联，使得最终体系浓度中HRP为10U/ml，H₂O₂为0.6mg/ml，最终得到丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶。

实施例2

其他步骤同实施例1，不同之处在于步骤(2)中制备得到聚乙烯醇浓度为8wt％。(3)中加入等体积的8wt％聚乙烯醇溶液。混合均匀后后先后加入辣根过氧化物酶(HRP)和双氧水(H₂O₂)进行交联，最终得到丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶。

实施例3

其他步骤同实施例1，不同之处在于步骤(2)中制备得到聚乙烯醇浓度为10wt％。(3)中加入等体积的10wt％聚乙烯醇溶液。混合均匀后后先后加入辣根过氧化物酶(HPR)和双氧水(H₂O₂)进行交联，最终得到丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶。

实施例4

其他步骤同实施例1，不同之处在于步骤(3)称取丹皮酚，利用8wt％聚乙烯醇溶液为溶剂，在40℃水浴加热搅拌溶解，制得浓度为3mg/ml丹皮酚聚乙烯醇溶液，然后向步骤(1)中的8wt％的丝素蛋白水溶液中加入等体积的3mg/ml丹皮酚聚乙烯醇溶液。混合均匀后先后加入辣根过氧化物酶(HRP)和双氧水(H₂O₂)进行交联，最终得到含有疏水性药物丹皮酚的丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶。

对比例

其他步骤与实施例2相同，不同之处在于步骤(3)中不加入辣根过氧化物酶(HRP)和双氧水(H₂O₂)进行交联。最终得到未交联的丝素蛋白与聚乙烯醇的复合水凝胶。

凝胶时间测定

在37℃水浴下，采用倒置法(通过倒置容器观察溶液流动状态计算凝胶时间)记录实施例1至3与对比例水凝胶的凝胶时间参见表1：

表1不同水凝胶的凝胶时间(37℃)

	实施例1	实施例2	实施例3	对比例
					凝胶时间(min)	5	5	6	63

由此可知，在37℃条件下，与对比例相比，本发明步骤的凝胶时间大大缩短，而且装载药物并没有影响凝胶形成时间。较短的凝胶时间有助于药物装载或者作为可注射生物材料原位修复损伤组织。

水凝胶的微观形态

不同水凝胶的SEM图像如图2所示。当PVA(聚乙烯醇)所占比例较小时，PVA/SF(丝素蛋白)水凝胶内部分布分布均匀和椭圆形的孔道结构(如图2A)。但是当PVA/SF为1/1时(如图2B)，水凝胶内部孔径迅速变小，开始出现一定程度的片层结构，当PVA含量继续增大时，片层结构开始变得十分明显(如图2C)。丹皮酚加入使水凝胶孔径变大(如图2D)。当PVA/SF为1/1，且不添加HRP和H₂O₂，使其自然凝胶。可以看到其内部分布有一定的片层结构，孔道结构松散，且孔明显大于酶交联的水凝胶(如图2E)。由此可知，水凝胶的孔结构可以通过聚乙烯醇和丝素蛋白的不同比例进行调节，装载疏水性药物可改变水凝胶的孔结构。一般来说，水凝胶的孔径越小，孔分布越紧密，有益于改善药物从水凝胶材料中释放产生的突释，有利于药物的缓慢释放。

热水溶失率及溶胀率测定

溶胀率测定：将实施例1至4与对比例的水凝胶进行冷冻干燥，干燥后测定干重的质量，再将实施例1至4与对比例制备的水凝胶分别放在去离子水中2h，测定其吸水后质量。

溶胀率＝(吸水后水凝胶质量-干重质量)/干重质量×100％

热水溶失率测定：将实施例1至4与对比例的水凝胶进行冷冻干燥，干燥后测定干重的质量，再将实施例1至4与对比例制备的水凝胶分别放在去离子水中于37℃，110r/min振荡24h，去离子水体积按照浴比1:100加入，24h后取出，于60℃烘至恒重，计算其热水溶失率。

热水溶失率＝(干重质量-烘干后质量)/干重质量×100％

实施例1至4与的热水溶失率及溶胀率参见表2

表2实施例的热水溶失率及溶胀率

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					热水溶失率(％)	22.41	37.56	42.79	50.23
溶胀率(％)	515.38	558.28	618.09	556.35

由此可知，实施例所制备的样品随着PVA成分的增加，其热水溶失率有所上升，溶胀率略有上涨。酶交联有效增强了水凝胶的在水溶液中的稳定性，然而只作用于丝素蛋白中，所以随着PVA含量的增加，水凝胶中交联的网络结构减少，降低了它在水中的稳定性。该水凝胶的溶胀率随着PVA的增加而略有增长，这是由于亲水性的PVA含量增加带来的效果。在水凝胶中添加丹皮酚对水凝胶的热水溶失率改变并不显著。总体来说，本专利中制备的水凝胶具有较好的稳定性和亲水性，有助于其在药物缓释和组织工程中的应用。

药物的缓释

将实施例4与实施例2制备的水凝胶，采用0.01mM的磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为缓释介质，置于摇床37℃，110r/min条件下进行缓释，以实施例2为空白对照，固定时间点取出并且加入等体积新鲜缓释介质，于紫外分光光度计测定其吸光度，参照丹皮酚标准曲线计算其累计释放率。具体数值参见图3，可以看出丹皮酚从水凝胶中释放行为呈现出先快后慢的趋势。在前12小时丹皮酚的释放速率较快，累积释放率达到了66.13％，在12小时至48小时时间段内丹皮酚的释放速度降低，48小时时丹皮酚的累积释放释放率为74.15％。该结果表明，本发明制备的水凝胶对丹皮酚这种疏水性药物有较好的缓释效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。