阅读说明：本技术 一种数字图像比色法检测食品中亚硝酸盐的方法 (method for detecting nitrite in food by digital image colorimetric method ) 是由 王晓闻 王慧慧 荆旭 武文英 贾丽艳 王腾飞 杨佳丽 于 2019-08-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种数字图像比色法检测食品中亚硝酸盐的方法。本发明利用NO<Sup>-</Sup>在酸性条件下具有氧化性,可以氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)生成黄色的TMB二亚胺,采用智能手机对实验结果进行拍照,然后用图像处理软件采用RGB模型对采集的图像进行处理,将可视化的颜色转化为可处理的数据,实现食品样品中亚硝酸盐的定量检测。本发明方法操作简单方便、使用仪器易得,实验结果准确可靠,所需成本较低,可以实现现场快速检测。(The invention relates to a method for detecting nitrite in food by a digital image colorimetric method. According to the method, NO-has oxidability under an acidic condition, and can oxidize 3,3',5,5' -Tetramethylbenzidine (TMB) to generate yellow TMB diimine, an intelligent mobile phone is used for photographing an experimental result, then an image processing software is used for processing an acquired image by using an RGB model, and visual colors are converted into processable data, so that the quantitative detection of nitrite in a food sample is realized. The method has the advantages of simple and convenient operation, easy acquisition of used instruments, accurate and reliable experimental results, lower required cost and capability of realizing on-site rapid detection.)

一种数字图像比色法检测食品中亚硝酸盐的方法

技术领域

本发明涉及一种数字图像比色法检测食品中亚硝酸盐的方法，属于食品检测技术领域。

背景技术

亚硝酸盐是最广泛的工业用盐之一，常用作食品添加剂和防腐剂，在肉类加工(如火腿和香肠)中常被用作防腐剂和发色剂，使肉制品拥有良好的色泽、适宜的风味和抗菌性。然而其潜在的毒性对人类健康构成了巨大的威胁，吸入少量亚硝酸盐可导致急性中毒，长期摄入可导致癌症。在胃酸的作用下，亚硝酸盐可以与仲胺、酰胺等反应生成N-亚硝胺类致癌物，容易损伤肾脏、脾脏、神经系统，引起多种癌症。此外，亚硝酸盐还会与人体血液中的血红蛋白发生不可逆反应产生高铁血红蛋白，这种化合物会降低血液的运氧能力，从而引起“高铁血红蛋白症”或“蓝婴综合症”，对孕妇和婴儿有极大的危害。人体中的亚硝酸盐主要是通过膳食摄入，因此监测食品中的亚硝酸盐含量具有重大意义。

目前世界上常见的亚硝酸盐的检测方法主要有荧光法、化学发光法、电化学法、荧光毛细管淬灭法、离子色谱法、分光光度法等。虽然这几种检测方法灵敏准确，但需要昂贵的仪器、专业的操作人员、耗时的程序、复杂的样品处理过程和大量的样品、以及合成的材料不稳定、成本高等缺点，极大地限制了其在现场食品检验中的应用，所以建立一种可以现场快速检测亚硝酸盐的方法具有较大的实际意义。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种亚硝酸盐的检测方法，具体是涉及食品产品中亚硝酸盐的现场快速准确便捷的数字图像比色检测方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种数字图像比色法检测食品中亚硝酸盐的方法，其包括如下步骤：

S1、样品处理：准确称取样品加水后进行匀浆，定容，沸水浴后冷却，过滤取上清液，加亚铁***溶液和乙酸锌溶液，摇匀离心去除脂肪，再次过滤，取滤液作为样品处理液待测；

S2、配置不同浓度的亚硝酸盐标准品，用于制备标准曲线的制作；

S3、将TMB显色剂与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与样品处理液混合反应后进行拍照获得样品照片；采用不同浓度的亚硝酸盐标准品与TMB显色剂与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液反应后进行拍照获得标准品照片；

S4、将上述获得标准品照片，用图像处理软件选取RGB模式对图像读取G和B通道的数据进行数据处理，绘制标准曲线；

将样品照片的RGB模式的数据代入标准曲线中即可获得样品中亚硝酸盐的浓度。

在一个优选的实施方案中，在步骤S1中，所述沸水浴的时间为10～20min；所述亚铁***溶液的浓度为0.25mol/L，所述乙酸锌溶液的浓度为1mol/L；所述离心为5000r/min，5min。

进一步，所述样品为5g，加水为30mL～50mL、70℃～80℃；定容为50mL～100mL，取上清液为9mL～15mL，所述亚铁***溶液和乙酸锌溶液分别为150μL～300μL。

在一个优选的实施方案中，在步骤S2中，所述亚硝酸盐标准品中NaNO₂标样的浓度线性范围为10μmol/L～440μmol/L。

进一步，所述NaNO₂标样的浓度分别为10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L。

在一个优选的实施方案中，在步骤S3中，所述TMB显色剂中乙醇的质量分数为25％～50％，TMB浓度为450μmol/L～700μmol/L，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH值为2.2～4。

进一步，所述TMB显色剂中乙醇的质量分数最优选为25％，TMB浓度最优选为500μmol/L，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH值最优选为2.2。

在一个优选的实施方案中，在步骤S3中，所述TMB显色剂与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与样品处理液或亚硝酸盐标准品的用量为等量，反应时间为20min或20min以上。

在一个优选的实施方案中，在步骤S4中，所述图像处理软件为Adobe Photoshop，所述数据处理为根据强度公式计算强度I＝1-B/R，以亚硝酸盐浓度为横坐标，强度ΔI＝I-I₀为纵坐标绘制标准曲线，I₀为NaNO₂浓度为0时的强度，待测样品的强度ΔI_样＝I_样-I₀。

在一个优选的实施方案中，所述拍照装置四周和顶部为反光板、底部为柔光板，光源采用发光二极管并安装在顶部；以保证每次拍照时光源强度一致。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

本发明提供的一种亚硝酸盐的检测方法，采用新研制的TMB显色剂，在酸性条件下遇到亚硝酸盐时产生黄色的TMB二亚胺，产生肉眼可见的颜色变化，最终生成的成分稳定；利用智能手机即可进行拍照，用于后续结果分析处理，检测成本低，且本发明的检测方法在实际样品检测中结果准确、误差小。

本发明的方法无需昂贵的精密仪器(如紫外分光光度计或荧光分析仪)，使用智能手机这一常见的电子设备，利用图像处理系统即可对实验结果进行准确分析；在本发明的检测方法中所使用的显色剂试剂安全无毒，实验过程中不需要合成任何物质，反应条件温和、操作简单快捷，实验结果准确可靠，可以实现远程、现场快速检测。

附图说明

图1为不同反应体系的图像及紫外-可见吸收光谱。

图2为手机拍照的结果。

图3有效区域的截取。

图4为不同TMB浓度对强度(I)的影响。

图5为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH值对强度(I)的影响。

图6为乙醇百分含量对强度(I)的影响。

图7为反应时间对对强度(I)的影响。

图8为亚硝酸钠的线性曲线。

具体实施方式

3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)是一种安全高效稳定的显色剂。当待测物氧化性较弱时，TMB失去1个电子，生成蓝绿色混合物，在625nm处出现特征吸收峰。而当待测物质的氧化性较强时，TMB失去2个电子产生黄色混合物，在450nm处出现特征吸收峰。本发明研究发现NaNO₂在酸性条件下具有强氧化性，无需催化剂即可使TMB发生氧化反应，通过采用数字图比色法实现亚硝酸盐的定量检测。数字图像比色法(DIC)包括两个过程：图像采集和颜色读出，该方法利用图像采集工具对样本图像进行采集，然后利用图像处理软件对采集的图像进行颜色分析。由于DIC数据由图像软件提供，减少了肉眼的影响，大大提高了检测结果的准确性，相机、扫描仪、电脑相机和智能手机都可以用来获取图像。智能手机已经成为了一种随处可见的电子设备，具有体积小、使用方便、摄像头分辨率高、获取图像原始数据快速便捷、带有数字平台、庞大的存储能力等优势，智能手机已经成为应用最广泛的图像采集工具。

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1拍照装置的构建

搭建一个相对密闭的空间，外界光线对实验结果不会造成影响的装置，四周和顶部由反光板组成，底部是由柔光板组成；白色为底色可以清晰地展现出反应产生的颜色，而反光板可以使整个灯箱内的光线分布更加均匀，使整个灯箱任何位点的光强度一致，减少物体的阴影；底部添加柔光板是为了避免拍照物体出现强光斑，对实验结果造成影响，灯源采用发光二级管(LED)，光源稳定且无频闪，避免了光源不稳对实验结果造成影响；并且装有可以调节光强度的开关，随时调控光强度的大小，使拍摄效果达到最佳；最佳拍照环境需光强度达到最大。

(1)试验方法：准备四个1.5mL的离心管，配置四种不同的反应体系a：亚硝酸钠+TMB；b：TMB+缓冲；c：亚硝酸钠+缓冲；d：亚硝酸钠+TMB+缓冲。其中，此实验过程中所用试剂分别为：亚硝酸钠(NaNO₂)是指浓度为100μmol/L的溶液；TMB是指TMB浓度为500μmol/L，且由质量分数为50％的乙醇作为TMB的溶剂；缓冲是指pH＝2.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。每种试剂的添加量为0.5mL，配置a、b、c、d四种不同的反应体系。反应20min后定量转移1mL至玻璃瓶进行拍照，并且用紫外分光光度计中检测450nm处的吸光度值。

(2)实验结果测得的吸光度值及拍照图片如图1所示。

(3)结果说明只有反应体系d中的三种反应物质同时存在于同一体系中才能产生肉眼可见的颜色变化，即只有在酸性条件下NO^-才能氧化TMB，使其失去电子化学性质发生改变，产生肉眼可见的黄色物质。在紫外吸收图中可以清晰地看到在450nm处出现了吸收峰，此吸收波长为黄色TMB二亚胺的特定吸收波长，验证了反应产物为TMB二亚胺。

实施例2图片处理及强度(I)公式的选取

(1)实验方法：配置一系列不同浓度的NaNO₂(50μmol/L～300μmol/L)，分别加入500μL浓度为500μmol/L的TMB显色剂，再加入pH＝2.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液500μL，反应20min后定量转移1mL至玻璃瓶进行拍照。将上述配制好不同NaNO₂浓度反应后的玻璃瓶放置于摄影棚的中心位置，光源调到最亮(应保证每次拍照的环境保持稳定，以减少外部环境对拍照结果的影响)，固定手机拍照位置，拍照后获得如图2所示照片，用图像处理软件截取图片的有效部分如3所示，用图像处理软件(Adobe Photoshop)选取RGB模式对图像进行数据处理(进入处理界面后，选取窗口，勾选直方图，选取不同的通道(R通道、G通道、B通道)查看数据。用Adobe Photoshop软件读取不同颜色通道的数值，以浓度为横坐标，以R、G、B、G/(R+G+B)、R/G、R+G-B、R/B、G/B、1-B/R、等RGB的组合公式为纵坐标作图，选取决定系数较大的强度公式。

(2)实验结果：经过多种公式的筛选，最终确定RGB的强度公式：I＝1-B/R。

实施例3反应条件的优化

A.TMB浓度

(1)实验方法配置10个不同浓度梯度的TMB溶液(25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L、600μmol/L、700μmol/L)，采用质量分数为50％的乙醇作为TMB的溶剂。添加500μL不同浓度的TMB至1.5mL的离心管中，然后加入500μL NaNO₂(300μmol/L)，最后加入500μL pH＝2.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液至离心管中。反应20min后定量转移1mL至玻璃瓶进行拍照(处理完后的所有样品统一拍一张在照片后进行处理)，用图像软件处理软件处理图片得到强度(I)。以TMB浓度为横坐标，强度(I)为纵坐标作图。

(2)实验结果如图4所示。

(3)结果分析：TMB浓度在25μmol/L～75μmol/L范围内强度(I)缓慢上升，75μmol/L～500μmol/L的范围内随着TMB浓度的增加，调整强度(I)显著增加，这是由于一定量的NO-可氧化的TMB的数量是一定的，当TMB数量较少时NO^-处于过量状态，可将反应体系中的TMB全部氧化。所以随着TMB的浓度增加，强度(I)呈增加趋势。在500μmol/L～700μmol/L的范围内，调整强度处于同一水平，无明显不变化。这是由于TMB处于过量状态，体系中的NO^-已经全部用于氧化TMB，所以体系的强度(I)基本保持不变。所以最优TMB浓度为500μmol/L。

B.缓冲液pH的影响

(1)反应条件：本实验配置了9个不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH＝2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)，添加500μL不同pH的缓冲液至1.5mL的离心管中，然后加入500μL NaNO₂(300μmol/L)，最后加入500μL TMB(500μmol/L，采用质量分数为50％的乙醇作为TMB的溶剂)。反应20min后定量转移1mL至玻璃瓶进行拍照，用图像软件处理软件处理图片得到强度(I)。以pH为横坐标，强度(I)为纵坐标作图。

(2)实验结果如图5所示；

(3)结果分析：当pH保持在强酸性环境下(2.2～3)，I值保持稳定，说明在强酸性环境下可以保证NO^-的氧化能力不受影响。pH在4～7时I显著下降。这是因为pH的改变会影响H⁺的浓度，在HNO₂分子中H⁺对中心成酸元素N的反极化作用很强，使得N-O键容易断裂，稳定性减弱，氧化性增强。所以在弱酸偏中性环境下H⁺的极化作用很弱，NO^-保持稳定，要想使其氧化性增强需在强酸性环境下。缓冲液的最优pH＝2.2。

C.乙醇的百分含量

(1)实验方法：实验中设置了乙醇含量为25％、50％、75％、100％四个梯度探究其对影响，添加500μL不同乙醇百分含量配置的TMB(500μmol/L)显色剂至1.5mL的离心管中，然后添加500μL NaNO₂(300μmol/L)，最后添加500μL pH＝2.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。反应20min后定量转移1mL至玻璃瓶进行拍照，用图像处理软件处理图片得到强度(I)。以乙醇百分含量为横坐标，强度(I)为纵坐标作图。

(2)结果如图6所示：

(3)结果分析：随着乙醇百分含量的增加，强度(I)呈下降趋势。因此选用25％的乙醇作为TMB的最佳溶剂。

D、反应时间

为了了解反应是否进行完全，研究了反应时间与强度(I)的关系。添加500μLNaNO₂(300μmol/L)至1.5mL的离心管中，然后加入pH＝2.2的磷酸氢二钠-柠檬缓冲液500μL，最后加入500μL的TMB(500μmol/L，采用质量分数为25％的乙醇作为TMB的溶剂)。每隔五分钟拍照一次，研究了30min内不同时间对强度(I)的影响。以时间为横坐标，强度(I)为纵坐标作图。

实验结果如图7所示，在5min～20min内随着时间的延长强度(I)呈递增趋势，20min～30min内强度(I)基本不变。因此本发明选择的反应时间为20min。

实施例5NaNO₂标准曲线的制作

(1)实验方法：配置了不同浓度的NaNO₂(0、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、420μmol/L、440μmol/L)添加500μL不同浓度的NaNO₂至1.5mL的离心管中，接着加入500μL pH＝2.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，最后加入500μL乙醇百分含量为25％配置的TMB(500μmol/L)。反应20min后定量转移1mL至玻璃瓶进行拍照，用图像软件处理软件Adobe Photoshop CC处理图片得到强度(I)。以NaNO₂浓度为横坐标，以ΔI＝I-I₀(I₀为NaNO₂浓度为0时的强度)为纵坐标绘制标准曲线。且空白样品做10个平行,拍照计算其标准偏差，根据定量限(LOQ)的计算公式：LOQ＝10σ/K检和出限(LOD)的计算公式：LOD＝3σ/K(σ为空白样的标准偏差；K工作曲线的斜率)计算出此优化条件下的检出限。

(2)实验结果如图8所示：NaNO₂浓度在10μmol/L～440μmol/L范围内呈现良好的线性：y＝0.0022x-0.0012，R²＝0.9942。定量限(LOQ)为2.227μmol/L，检出限(LOD)为0.668μmol/L。

实施例6干扰性检验

(1)实验方法：在最佳条件下(TMB浓度为500μmol/L、缓冲液pH＝2.2、乙醇质量分数为25％，反应时间为20min)进行了干扰性检验。测定了NO^-的常见干扰离子(Zn²⁺、Mg²⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、SO₄ ^2-、CO₃ ^2-、NO₃ ^-、Cl^-、OH^-、HCO₃ ^-)对实验结果的影响。NO^-浓度选用30μmol/L。干扰性离子(Zn²⁺、Mg²⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、SO₄ ^2-、CO₃ ^2-、NO₃ ^-、Cl^-、OH^-、HCO₃ ^-)的浓度配置分别为10倍NO^-浓度(300μmol/L)、100倍(3mmol/L)、1000倍(30mmol/L)。确定各离子的无干扰倍数。

(2)实验结果如表1所示。

表1.不同离子对待测物的干扰

(3)结果分析：本实验中检测干扰性离子对待测物质无显著影响，验证了本实验对亚硝酸盐检测具有专一性。

实施例7样品的检测

(1)样品的预处理：准确称取5.0g样品(火腿，白菜，腌菜)，加入30mL 70℃的蒸馏水在搅拌机内匀浆，匀浆后倒入50mL的容量瓶中，多次洗涤搅拌机，洗涤液倒入容量瓶中，最后定容到50mL(腌菜需添加0.1g活性炭用来脱色)，沸水浴15min后冷却至室温，过滤9mL上清液至10mL的离心管中。加入150μL亚铁***溶液(0.25mol/L)摇匀，之后加入150μL乙酸锌(1mol/L)摇匀离心5min(5000r/min)，去除上层脂肪，再次过滤，滤液即食品样品待测滤液保存在4℃下备用。

(2)反应条件：在最适的反应条件下(TMB浓度为500μmol/L、缓冲液pH＝2.2、乙醇质量分数为25％，反应时间为20min)，进行实际样品检测以及对其进行了加标回收实验(NaNO₂加标浓度分别为20mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)，具体操作为：准备一个1.5mL的离心管，加入500μL浓度为500μmol/L的TMB显色剂(用百分含量为25％的乙醇作为TMB溶剂)，再加入pH＝2.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液500μL，最后加入食品样品待测滤液500μL。反应20min后定量转移1mL至玻璃瓶进行拍照后，用图像处理软件处理图片得到强度I_样，计算待测样品的强度ΔI_样＝I_样-I₀。然后将ΔI_样代入实施例5制备的标准曲线得到样品中亚硝酸盐的含量。

(3)实验结果如表2所示。

表2.实际样品RGB法检测及回收率

结果分析：本发明采用的RGB模式下得出样本中的亚硝酸盐含量分别为(白菜：3.28mg/kg、腌菜：19.89mg/kg、火腿：4.85mg/kg)，回收率在98.00％～103.30％，相对标准偏差(RSD<5％)。

对比例

采用GB5009.33—2016中紫外分光光度法对实施例7中样品进行了检测和加标回收率的计算，结果如表3所示。

表3.实际样品外分光光度法检测及回收率

紫外分光光度计同时需要配套的比色杯才能进行检测结果，紫外分光光度计还需要稳定的环境。

本发明方法的检测结果与现有技术中紫外的检出结果(样品采用GB5009.33—2016进行检测)比较表明，本发明方法在实际样品的检测中结果较为准确，且方法操作简单，不需要紫外分光光度计即可进行。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。