阅读说明：本技术 一种光聚可颜色自反馈硬度分布的凝胶及制备方法、应用 (Photopolymerisable gel capable of realizing color self-feedback hardness distribution, preparation method and application ) 是由 顾忠泽 李森 杜鑫 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种光聚可颜色自反馈硬度分布的凝胶及其制备方法,所述凝胶用于细胞支架,凝胶的制备步骤如下：配制预聚液；将预聚液灌入两块平行放置的玻璃片中,用365 nm紫外光照射使之聚合；过程中可用254 nm和365 nm紫外光对凝胶的力学性质进行调控,获得力学性质区域化分布的细胞支架。改性后的细胞支架的硬度及其分布会以颜色的方式显现出来,通过拍摄照片原位地读取支架上的硬度分布。该方法应用于多种细胞培养系统,实时的控制微环境的性质,原位引导其上细胞的行为。不打开芯片且不外加检测设备的情况下,通过颜色分析直接获取调控后的细胞支架的力学参数,及细胞行为和支架性质间的关系,具有很大的应用潜力。(the invention discloses a light polymerization gel with color self-feedback hardness distribution and a preparation method thereof, wherein the gel is used for a cell scaffold, and the preparation steps of the gel are as follows: preparing a pre-polymerization solution; pouring the prepolymerization solution into two glass sheets which are arranged in parallel, and irradiating by using 365nm ultraviolet light to polymerize the solution; in the process, 254nm and 365nm ultraviolet light can be used for regulating and controlling the mechanical property of the gel to obtain the cell scaffold with regionalized distribution of the mechanical property. The hardness and distribution of the modified cell scaffold will be visualized in color, and the hardness distribution on the scaffold is read in situ by taking a photograph. The method is applied to various cell culture systems, controls the properties of the microenvironment in real time, and guides the behavior of cells on the microenvironment in situ. Under the conditions of not opening the chip and not adding detection equipment, the mechanical parameters of the regulated cell scaffold and the relation between the cell behavior and the scaffold property are directly obtained through color analysis, and the method has great application potential.)

一种光聚可颜色自反馈硬度分布的凝胶及制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种可用于器官芯片中微环境原位调控与传感的智能细胞支架及其制备方法，属于生物材料领域，具体涉及一种光聚可颜色自反馈硬度分布的凝胶及制备方法、应用。

背景技术

器官芯片，是一项通过细胞在体外芯片中进行三维培养，实现模拟人体器官功能的新兴技术。器官芯片在新药研发、疾病模型、个性化医疗和航天医学等领域具有广阔的应用前景。2016年，器官芯片被达沃斯世界经济论坛被列为“十大新兴技术”。药物研发最具挑战性的一个环节是如何测试药物的有效性和安全性。细胞和动物实验是目前药物研发和评估过程中广泛使用的两个实验平台，前者很难模拟人体微环境，后者则复杂、昂贵、耗时，并存在伦理上的争论。因此，经济、高效的动物或临床替代实验就显得十分必要。器官芯片就是近几年被提出的一种可用于药物评价的新的实验方法。

器官芯片是一个基于微流体芯片的三维细胞培养系统，主要由盖板、基板、流道和细胞培养区构成。细胞培养区由细胞，细胞微环境，检测系统及其他部分组成。其中微环境是其非常重要的组成部分，而微环境主要是由细胞支架材料和培养基组成。细胞支架可以模仿细胞外基质(ECM)，通过调节支架的功能可以控制细胞行为，在组织工程，再生医学，药物筛选和器官芯片等领域的应用成为关键要素。其中具有易于制造，高含水量和可变物理化学性质的优越特性的水凝胶被用来模仿ECM的性质引起了广泛关注。

目前器官芯片在调控和检测方面最主要的挑战在于，其组装完成后是一个封闭的体系，常规的检测手段无法透过封闭的盖板或者基板对芯片内部的微环境进行调控或检测。为了实现检测，需要在芯片上提前设计检测系统的接口，这一方面增加了芯片的复杂程度，另一方面用这种方式仍然很难检测微环境中各参数的空间分布。

发明内容

技术问题：针对现有技术的不足，本发明提出可用于器官芯片中的具备原位调控与传感功能的智能细胞支架及其制备方法。该方法制备的智能细胞支架可以在封闭的芯片内通过光控调节其力学性质，使得芯片内的细胞培养区可以实时的产生各向异性的微环境，从而得到不同细胞形态。另外可以在不打开芯片且不外加检测设备的情况下，通过支架的颜色直接获取支架的力学性质以及细胞生长状态，使得细胞与支架的作用变得易于观察研究。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明提供了一种光聚可颜色自反馈硬度分布的凝胶及制备方法、应用。

本发明公开了一种光聚可颜色自反馈硬度分布的凝胶；所述凝胶通过颜色变化直观的得到其硬度分布。该凝胶可以通过颜色变化直观的得到其硬度分布，适用范围广，操作简单。所述的凝胶可以无需外加检测设备，直接通过颜色变化得到凝胶各个位置硬度分布。

本发明公开了一种光聚可颜色自反馈硬度分布的凝胶的应用，采用该凝胶用于细胞支架。支架可以实现对细胞生长环境的原位调控和传感。

本发明公开了一种光聚可颜色自反馈硬度分布的凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)配制凝胶预聚液；具体方法为：将丙烯酰胺(8-15wt％)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)/聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA700)(0.08-0.45wt％)、光引发剂(2959)(0.08-0.45wt％)和单分散二氧化硅粒子(26-34vol％)等为原料，水为溶剂，超声混合均匀制成预聚液；

2)在步骤1)所制备的预聚液基础上，将预聚液灌入玻片夹具(垫片厚度10-125μm)中，用365nm紫外光照的条件下聚合成膜，光照时间从10s-30min梯度增加，制备不同颜色和硬度的凝胶薄膜；

3)在步骤2)所制备的凝胶薄膜基础上，在薄膜表面放置灰度掩模，在365nm紫外光照下，获得硬度和颜色具有区域化分布特性的凝胶。

本发明的制备方法的另一种技术方案为：步骤1)配制凝胶预聚液；具体方法为：将丙烯酰胺(8-15wt％)、Bis/PEGDA700(0.08-0.45wt％)、光引发剂(2959)(0.08-0.45wt％)、二氧化硅粒子(26-34vol％)和7-丙烯酰氧基氨基-4-甲基香豆素(2-4wt％)等为原料，DMSO为溶剂，混合均匀制成预聚液；

步骤2)在步骤1)所制备的预聚液基础上，将预聚液灌入玻片夹具(垫片厚度25-125μm)中，用365nm紫外光照，制备可光调控的智能凝胶薄膜；

步骤3)在步骤2)所制备的智能凝胶薄膜基础上，将薄膜置于预先设计好的器官芯片中，在需要改变薄膜的力学性质时，通过灰度掩膜或者不同光照时间，用254nm紫外光照射部分解聚得到不同硬度的各向异性智能凝胶薄膜。用254nm紫外光照使二聚香豆素解聚，调控凝胶的硬度，并可通过使用灰度掩膜，使凝胶图案化解聚得到硬度区域化分布的智能凝胶薄膜。对于解聚后的薄膜，使用365nm的紫外光照射可使香豆素重新结合，提升凝胶的硬度，且其硬度改变同样会以颜色变化的方式呈现出来。

在步骤3)、6)基础上，在需要获得调控后的凝胶的力学性质分布时，用相机对凝胶成像，并通过分析照片上不同区域的色相即可获得凝胶的硬度分布。

所述的凝胶可以无需外加检测设备，直接通过颜色变化得到凝胶各个位置硬度分布。可光控原位调控和传感的智能凝胶用作细胞培养支架，可通过光化学反应，原位调控支架硬度，使得细胞在其表面贴附和生长形态不同，并且可以在无外加仪器条件下，直接获得支架硬度的分布信息。可光控原位调控和传感的智能仿生细胞支架在器官芯片中的应用，在不打开芯片的条件下，可以通过紫外光照射对内部细胞支架原位调控，使其力学性能产生原位的、区域可控的变化，从而影响芯片内的细胞行为，并且可直接在芯片中观测细胞形态和读取颜色数据来得到细胞生长状态和基底性质间关系的信息。

其中：

本发明的进一步的技术方案为：将步骤1)中得到的预聚液在超声处理5分钟。

本发明的进一步的技术方案为：步骤1)所述的预聚液组成包括但不限于丙烯酰胺、Bis/PEGDA700、光引发剂(2959)和二氧化硅粒子、香豆素丙烯酸酯、水和DMSO等物质。

本发明的进一步的技术方案为：步骤2)所述的紫外光照条件是指波长为365nm紫外光，光照时间从10s-30min梯度增加。

本发明的进一步的技术方案为：步骤2)所述的紫外光照条件是指波长为254nm的紫外光，光照强度为0.1-10mW/cm^-2，光照时间为10s-30min。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、本本发明提出的一种器官芯片中微环境原位调控与传感的智能细胞支架及其制备方法。该方法可被应用于多种器官芯片中细胞培养支架。

2、本发明提出的一种器官芯片中微环境原位调控与传感的智能细胞支架，可以在封闭的芯片内通过光控调节支架的力学性质，使得芯片内的细胞培养区可以实时的产生各向异性的微环境，从而得到不同细胞形态。

3、本发明提出的一种器官芯片中微环境原位调控与传感的智能细胞支架，可以在不打开芯片且不外加检测设备的情况下，通过颜色直接获取支架的力学性质以及细胞生长状态。

4、首先根据预先计算好的配方配制预聚液；然后将预聚液灌入两块平行放置的玻璃片中，用365nm紫外光照射使之聚合。使用过程中可用254nm和365nm紫外光对凝胶的力学性质进行调控，通过掩膜或者控制局部光照时间来获得力学性质区域化分布的细胞支架。同时，改性后的细胞支架的硬度及其分布会以颜色的方式显现出来，可以通过拍摄照片原位的读取支架上的硬度分布。该方法可被应用于多种细胞培养系统，如细胞培养板、微阵列和微流控器官芯片中，可以在封闭的环境内通过光控调节支架的力学性质，实时的控制微环境的性质，原位引导其上细胞的行为。另外可以在不打开芯片且不外加检测设备的情况下，通过颜色分析直接获取调控后的细胞支架的力学参数，及细胞行为和支架性质间的关系，具有很大的应用潜力。

附图说明

图1是本发明提供的智能支架在紫外光调控下时颜色变化与力学性质变化图；

图2是本发明中细胞支架在器官芯片中的应用图；

图3是图2芯片中支架培养细胞后在显微镜下观测的图片；

图4是通过凝胶的色相分布计算弹性模量拟合值与通过压痕仪得到的弹性模量分布对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

1)将丙烯酰胺(7.00mg)，Bis/PEGDA700(0.08mg)和光引发剂2959(0.08mg)加入到水分散的二氧化硅纳米粒子(90μL，Ф152nm，30vol％)中；得到预聚液；

2)将1)中得到的预聚液在超声处理5分钟；

3)在2)基础上，将预聚液溶液通过毛细管力均匀渗透进入隔开的两个平行玻璃之间，间隙厚度为25μm，然后暴露于λ＝365nm的紫外光下10s、30s、45s、60s、120s使单体光聚合；由此获得不同颜色和硬度的水凝胶膜；

4)为了增加细胞亲和力，将明胶接枝到3)的水凝胶膜的表面上。然后将水凝胶膜在75％乙醇中在培养皿中，在无菌PBS中灭菌至少3小时并在细胞培养基中灭菌1小时；除去细胞培养基，注入新的细胞培养基。

在24孔板中，将HeLa细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的培养基中，37℃环境下，5％CO₂气氛中常规培养；随后，将预处理的细胞以2×10⁵个细胞/mL的浓度悬浮在水凝胶的表面上，并孵育24小时；得到细胞支架。

实施例2

1)将丙烯酰胺(10.00mg)，Bis/PEGDA700(0.2mg)和光引发剂2959(0.2mg)加入到水分散的二氧化硅纳米粒子(90μL，Ф152nm，34vol％)中；得到预聚液；

2)将1)中得到的预聚液在超声处理5分钟；

3)在2)基础上，将预聚液溶液通过毛细管力均匀渗透进入隔开的两个平行玻璃之间，间隙厚度为50μm，然后暴露于λ＝365nm的紫外光下10s、30s、45s、60s、120s使单体光聚合；由此获得不同颜色和硬度的水凝胶膜；

4)为了增加细胞亲和力，将明胶接枝到3)的水凝胶膜的表面上。然后将水凝胶膜在75％乙醇中在培养皿中，在无菌PBS中灭菌至少3小时并在细胞培养基中灭菌1小时；除去细胞培养基，注入新的细胞培养基。

5)在24孔板中，将HeLa细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的培养基中，37℃环境下，5％CO₂气氛中常规培养；随后，将预处理的细胞以2×10⁵个细胞/mL的浓度悬浮在水凝胶的表面上，并孵育24小时；得到细胞支架。

实施例3

1)将丙烯酰胺(14.00mg)，7-丙烯酰氧基氨基-4-甲基香豆素(2.00mg)，Bis/PEGDA700(0.45mg)和光引发剂2959(0.45mg)加入到二甲亚砜分散的二氧化硅纳米粒子(120μL，Ф152nm，26vol％)中；得到预聚液。

2)将1)中得到的预聚液在超声处理5分钟；

3)在2)基础上，将预聚液溶液通过毛细管力均匀渗透进入隔开的两个平行玻璃之间，间隙厚度为75μm，然后暴露于λ＝365nm的紫外光下5min使单体光聚合；由此获得可光调控的水凝胶膜。

4)为了增加细胞亲和力，将明胶接枝到水凝胶膜的表面上。然后将水凝胶膜在75％乙醇中在培养皿中，在无菌PBS中灭菌至少3小时并在细胞培养基中灭菌1小时。除去细胞培养基，注入新的细胞培养基。

5)将薄膜置于器官芯片细胞培养区，然后将凝胶暴露于λ＝254nm的紫外光下不同时间5min，10min，30min，由此使得凝胶颜色不同，力学性能不同。(如图2)

6)在器官芯片细胞培养区，将HeLa细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的培养基中，37℃环境下，5％CO₂气氛中常规培养。随后，将预处理的细胞以2×10⁵个细胞/mL的浓度悬浮在水凝胶的表面上，并孵育24小时；得到细胞支架。

实施例4

1)将丙烯酰胺(15.00mg)，7-丙烯酰氧基氨基-4-甲基香豆素(4.00mg)，Bis/PEGDA700(1mg)和光引发剂2959(0.30mg)加入到二甲亚砜分散的二氧化硅纳米粒子(120μL，Ф152nm，29vol％)中；得到预聚液。

2)将1)中得到的预聚液在超声处理5分钟；

3)在2)基础上，将预聚液溶液通过毛细管力均匀渗透进入隔开的两个平行玻璃之间，间隙厚度为100μm，然后暴露于λ＝365nm的紫外光下5min使单体光聚合；由此获得可光调控的水凝胶膜。

4)为了增加细胞亲和力，将明胶接枝到水凝胶膜的表面上。然后将水凝胶膜在75％乙醇中在培养皿中，在无菌PBS中灭菌至少3小时并在细胞培养基中灭菌1小时。除去细胞培养基，注入新的细胞培养基。

5)将薄膜置于器官芯片细胞培养区，然后将凝胶暴露于λ＝254nm的紫外光下不同时间2min，4min，5min，由此使得凝胶颜色不同，力学性能不同。(如图2)

在器官芯片细胞培养区，将HeLa细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的培养基中，37℃环境下，5％CO₂气氛中常规培养。随后，将预处理的细胞以2×10⁵个细胞/mL的浓度悬浮在水凝胶的表面上，并孵育24小时；得到细胞支架。

实施例5

1)将丙烯酰胺(7.00mg)，7-丙烯酰氧基氨基-4-甲基香豆素(1.00mg)，Bis/PEGDA700(1mg)和光引发剂2959(0.30mg)加入到二甲亚砜分散的二氧化硅纳米粒子(120μL，Ф152nm，33vol％)中；得到预聚液；

2)将1)中得到的预聚液在超声处理5分钟；

3)在2)基础上，将预聚液溶液通过毛细管力均匀渗透进入隔开的两个平行玻璃之间，间隙厚度为125μm，然后暴露于λ＝365nm的紫外光下5min使单体光聚合。由此获得可光调控的水凝胶膜。

4)在薄膜上放置一块点阵掩膜，然后暴露于λ＝254nm的紫外光下5min，由此获得各向异性凝胶。

5)为了增加细胞亲和力，将明胶接枝到水凝胶膜的表面上。然后将水凝胶膜在75％乙醇中在培养皿中，在无菌PBS中灭菌至少3小时并在细胞培养基中灭菌1小时。除去细胞培养基，注入新的细胞培养基。

6)在24孔板中，将HeLa细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的培养基中，37℃环境下，5％CO₂气氛中常规培养。随后，将预处理的细胞以2×10⁵个细胞/mL的浓度悬浮在水凝胶的表面上，并孵育24小时；得到细胞支架。

实施例6

1)将丙烯酰胺(7.00mg)，香豆素丙烯酸酯(1.00mg)，Bis/PEGDA700(1mg)和光引发剂2959(0.30mg)加入到二甲亚砜分散的二氧化硅纳米粒子(90μL，Ф152nm，29vol％)中；得到预聚液。

2)将1)中得到的预聚液在超声处理5分钟；

3)在2)基础上，将溶液通过毛细管力均匀渗透进入隔开的两个平行玻璃之间，间隙厚度为25μm，然后暴露于λ＝365nm的紫外光下5min使单体光聚合。由此获得可光调控的水凝胶膜。

4)在薄膜上放置一块灰度掩膜，然后暴露于λ＝254nm的紫外光下5min，由此获得各向异性凝胶。

5)为了增加细胞亲和力，将明胶接枝到水凝胶膜的表面上。然后将水凝胶膜在75％乙醇中在培养皿中，在无菌PBS中灭菌至少3小时并在细胞培养基中灭菌1小时。除去细胞培养基，注入新的细胞培养基。

6)在24孔板中，将HeLa细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的培养基中，37℃环境下，5％CO₂气氛中常规培养。随后，将预处理的细胞以2×10⁵个细胞/mL的浓度悬浮在水凝胶的表面上，并孵育24小时；得到细胞支架。

实施例7

采用实施例1-6所述的智能支架；如图1，图中明显可以看出在不同解聚时间后，凝胶薄膜的反射峰波长发生明显的位移。硬度也随解聚程度的增加呈规律性的降低。如图2，图中明显看出在芯片中，在不打开芯片的前提下，可以通过光对凝胶进行硬度调控，并且可以通过颜色自反馈。如图3，从图中可以明显看出，在调控后硬度不同的凝胶上培养细胞得到结果不同，硬的凝胶更适合细胞贴附生长。如图4，从图中可以明显看出，凝胶的硬度可以通过颜色的色相直接计算得出，应用于芯片中通过颜色就可以读取硬度信息。

应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。