阅读说明：本技术 类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素的生产 (Production of carotenoids and apocarotenoids ) 是由 张聪强 陈茜娴 朱兴奋 于 2018-02-26 设计创作，主要内容包括：公开生产类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素的方法。方法包括以下步骤：在宿主细胞中表达表达模块,该表达模块包含表达载体,该表达载体具有编码至少一种优化的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶的编码区,该编码区与启动子可操作地连接。还提供宿主细胞和试剂盒,所述宿主细胞包含表达载体,所述表达载体具有编码至少一种优化的类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶的编码区,所述编码区与启动子可操作地连接。特别地,类胡萝卜素或脱辅基类胡萝卜素生成酶形成选自以下的操纵子：a.用于生产α-紫罗酮的ΔN50-LsLcyE和TrxA-桂花CCD1；或b.用于生产β-紫罗酮的crtY和phCCD1；或c.用于生产ε-胡萝卜素的ΔN50-LsLcyE；或d.用于生产视黄醛的crtY和blh；或e.用于生产视黄醇的crtY、blh和ybbO。(Disclosed are methods for producing carotenoids and apoprotenoids. The method comprises the following steps: expressing an expression module in a host cell, the expression module comprising an expression vector having a coding region encoding at least one optimized carotenoid or apophotocarotenoid producing enzyme, the coding region being operably linked to a promoter. Also provided are host cells and kits comprising an expression vector having a coding region encoding at least one optimized carotenoid or apoproteolytic carotenoid producing enzyme, the coding region being operably linked to a promoter. In particular, the carotenoid or apoproteolytic carotenoid-producing enzyme forms an operon selected from the group consisting of: a. delta N50-LsLcyE and TrxA-sweet osmanthus CCD1 for producing alpha-ionone; crtY and phCCD1 for beta-ionone production; Δ N50-LsLcyE e for the production of epsilon-carotene; crtY and blh for the production of retinal; crtY, blh and ybbO for retinol production.)

具体实施方式

将被更详细地进一步描述，这些实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

材料与方法

在该研究中使用了大肠杆菌Bl21-Gold DE3菌株(Stratagene)。基因hmgS、hmgR、mevK、pmk和pmd(或MVD1)使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色体DNA通过PCR来扩增。基因atoB和idi从大肠杆菌基因组DNA扩增。将所有基因克隆到两个质粒中，p15A-spec-hmgS-atoB-hmgR(L2-8)和p15A-cam-mevK-pmk-pmd-idi(L2-5)。将从pAC-LYC质粒扩增的番茄红素生物合成途径中的基因(crtEBI)引入p15A-kan-crtEBI-ispA质粒。来自莴苣的LCYe基因(LsLCYe酶)、来自菠萝泛菌的crtY基因、来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、桂花、葡萄(Vitis vinifera)和矮牵牛的CCD1基因以及来自未培养海洋细菌HF10_19P19的blh基因(blh1)和来自未培养海洋细菌66A03的blh基因(blh2)经密码子优化并由Integrated DNA Technologies合成。将LsLCYe基因和crtY基因首先分别克隆到质粒p15A-amp-LsLCYe(L2-9)和p15A-amp-crtY(L2-9)中。将OfCCD1基因***p15A-amp-LsLCYe(L2-9)质粒中。随后将不同的CCD1或blh基因***p15A-amp-crtY(L2-9)菌株中。从由IntegratedDNA Technologies合成的引物引入定点诱变。将另外拷贝的crtY***p15A-spec-hmgS-atoB-hmgR(L2-8)质粒中。所有p15A质粒均源自pAC-LYC质粒。对p15A质粒起点中的RNA I的茎环结构进行突变以使质粒彼此兼容。T7启动子变体TM1、TM2和TM3总结于表1中。关于质粒和菌株的信息总结在表2和表3中。

表1总结了所使用的启动子序列。

表2总结了所使用的菌株和质粒。

表3描述了本研究中所使用的菌株。

培养基和培养条件

所有细胞均在补充有10g/L甘油、50mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸酸(HEPES)的2XPY培养基(20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物和10g/L NaCl)中生长。对于延长的孵育(48h)，还将5mg/L Tween80添加至培养基中以防止细胞聚集。简而言之，将10μL新鲜细胞培养物接种到14mL BD Falcon^TM管中的1mL新鲜培养基中。细胞最初在37℃以300rpm的振荡速度生长，并且当OD600达到约0.6时，通过一系列IPTG浓度(如文中所示)进行诱导。诱导后，将200μL十二烷补充到培养物上以提取紫罗酮或类视黄醇，并将细胞在28℃孵育另外的20h或48h,然后进行收获。将培养基补充适当的抗生素(100mg/L氨苄青霉素、34mg/L氯霉素、50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素)，以维持相应的质粒。

类胡萝卜素和类视黄醇的定量

根据丙酮提取方法从细胞沉淀物(pellet)中提取细胞内类胡萝卜素。简而言之，收集10-50μL细菌培养物(取决于细胞中类胡萝卜素的含量)并离心。用PBS洗涤细胞沉淀物，并将其重悬在20μL水中，然后加入180μL丙酮。HPLC方法采用Agilent 1260Infinity LC系统，其配备有ZORBAX，Eclipse Plus C18，4.6mm X 250mm，5μm柱和二极管阵列检测器(DAD)。以1.5mL/min维持等度条件(50％甲醇、48％乙酸乙酯和2％水)持续5min。在450nm的波长检测类胡萝卜素。使用商业标准品(包含ε-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、视黄醇和视黄醛)生成标准曲线。通过将20-50μL有机层稀释到1000μL己烷中来制备细胞外类视黄醇样品并通过相同的HPLC系统进行分析。等度条件如下使用。流动相为95％甲醇和5％乙腈，且流速为1.5ml/min。类视黄醇在340nm的波长检测。

α-紫罗酮、β-紫罗酮和ψ-紫罗酮的定量

通过将20-50μL有机层稀释到1000μL己烷中来制备α-紫罗酮或β-紫罗酮样品。在配备有Agilent VF-WAXms柱和Agilent 7200精确质量四极杆飞行时间的Agilent 7980B气相色谱(GC/MS)上分析样品。在240℃以不分流模式进行样品注射。升温程序(ovenprogram)在100℃开始2min，然后温度以30℃/min升高至240℃并在240℃保持另外的2min。通过用商业标准品制备的标准曲线进行内插来计算紫罗酮浓度。质谱仪在EI模式下通过全扫描分析(m/z 30-300,1spetra/s)运行。

手性分析

用配备有Agilent Cyclosil-B GC柱和Agilent 7200精确质量四极杆飞行时间的Agilent 7980B气相色谱(GC/MS)分析来自样品的α-紫罗酮的手性。升温程序在80℃开始2min，然后温度以5℃/min升高至210℃，并以20℃/min升高至250℃，并且最后在250℃保持另外的2min。通过用商业标准品制备的标准曲线进行内插来计算紫罗酮浓度。质谱仪在EI模式下通过全扫描分析(m/z 30-300,2spetra/s)运行。

补料分批发酵

起始培养基是化学成分确定的改良培养基，其含有15g/L葡萄糖、2g/L(NH₄)₂SO₄、4.2g/L KH₂PO₄和11.24g/L K₂HPO₄、1.7g/L柠檬酸、0.5g/L MgSO₄和10mL/L微量元素溶液。微量元素溶液(100X)含有0.25g/L CoCl₂·6H₂O、1.5g/L MnSO₄·4H₂O、0.15g/L CuSO₄·2H₂O、0.3g/L H₃BO₃、0.25g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.8g/L Zn(CH₃COO)₂、5g/L柠檬酸铁(III)和0.84g/L EDTA，pH8.0。将补料培养基(500g/L葡萄糖和5g/L MgSO₄)以0.6mL/h的初始速率泵入250mL Mini生物反应器(Applikon Biotechnology)中，并以近似指数方式在12h内增加至1.8mL/h并且在1.5mL/h保持另外的24h。当OD达到约40时，通过0.03mM IPTG诱导细胞。诱导后，将30mL肉豆蔻酸异丙酯补充到生物反应器中以提取紫罗酮。

实施例

通过“即插即用”生产胡萝卜素

实施例1.八氢番茄红素生产的优化

如本文所描述的“即插即用”平台从廉价的原料生产胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素(图1)。沿着重组途径维持高代谢通量是非常具有挑战性的，该重组途径在大肠杆菌细胞中同时过表达13种酶以生产胡萝卜素(图2)。紫外线-B(UVB，280-310nm)是最急剧的诱导皮肤损伤的阳光。无色胡萝卜素，八氢番茄红素，在280nm具有最大的UV吸光度(图3)，使其成为用于局部UV防护剂的理想成分。八氢番茄红素是可以被进一步转化为各种C40类胡萝卜素的首个关键中间体。为了产生八氢番茄红素，将来自乙酰-CoA的生物合成途径分为三个表达模块(图2，模块1，上游甲羟戊酸途径，包括hmgS-atoB-hmgR；模块2，下游甲羟戊酸途径，包括mevK、pmk、pmd和idi；模块3，八氢番茄红素生物合成途径，包括crtEB和ispA)，并通过EDASPO方法进行系统优化。简而言之，3个表达模块由具有不同强度的三种不同T7启动子变体控制，并且然后将八氢番茄红素产量与每个模块的启动子强度相关联，以找出每个表达模块的最佳转录范围(三元图(Ternary diagram)，图4)。结果，鉴定出每个表达模块的最佳范围，并获得了优化的菌株(221菌株)，其在摇瓶中生产～45mg/L或38,000ppm的八氢番茄红素(图4)。

实施例2.番茄红素生产的优化

番茄红素是另一种有价值的类胡萝卜素，其具有有效的抗氧化作用。生物合成途径极其长并且在异源微生物生产菌株中进行优化是具有挑战性的。本文，将途径分为三个不同模块(图2，模块1，上游甲羟戊酸途径，包括hmgS-atoB-hmgR；模块2，下游甲羟戊酸途径，包括mevK、pmk、pmd和idi；模块3，番茄红素生物合成途径，包括crtEBI和ispA)，并通过EDASPO方法过量生产番茄红素。简而言之，3个表达模块由具有不同强度的三种不同T7启动子变体控制，并且然后将番茄红素产量与每个表达模块的启动子强度相关联，以找出每个表达模块的最佳转录范围(三元图，图5)。结果，鉴定出每个表达模块的最佳范围，并获得了优化的菌株(121菌株)，其在摇瓶中生产～107mg/L或26,000ppm的番茄红素(图5)。将该番茄红素生产菌株用作亲本平台菌株，用于进一步生产下游类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素。

实施例3.胡萝卜素生产的优化

基于亲本番茄红素过量生产菌株，可以引入第四生物合成表达模块(图2)。取决于crtY和LCYe的表达水平，可以生产α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、γ-胡萝卜素和ε-胡萝卜素(图2)。然而，已知ε-胡萝卜素在自然界中以非常低的水平积累。迄今为止，已知仅来自莴苣的LCYe(LsLCYe)优先从番茄红素形成双环ε-环。当野生型LsLCYe酶在番茄红素菌株(121菌株)中过表达时，产生δ-胡萝卜素(具有在一端的一个ε-环的胡萝卜素)和ε-胡萝卜素(具有在两端的两个ε-环的胡萝卜素)的混合物，其中超过70％的番茄红素未环化(0.1mM，图6)。ε-胡萝卜素的生产最初通过调节转录水平来优化，并通过中等IPTG诱导(0.03mM)获得最高量的ε-胡萝卜素。然而，最高的ε-胡萝卜素滴度仅为18mg/L(2500ppm)，对应于总类胡萝卜素的小于30％(图6)，表明LsLCYe酶的活性不足。

通过Phobius的结构预测显示了LsLCYe酶中可能的膜相互作用区(第104-128位氨基酸)和弱信号肽区(第1-30位氨基酸)。先前已经报道了参与膜相互作用和信号肽编码区的N-末端残基的修饰以增加重组蛋白的溶解性和活性。因此，检查了参与锚定至膜的N-末端序列的截短，以确定其是否会增加LsLCYe的催化效率。通过使用截短交叉铺设体外组装方法(the truncate cross-lapping in vitro assembly method)一次系统地去除50个残基来构建一系列N-末端截短的LsLCYe。当前50个氨基酸被去除时，酶表达水平增加～40％(图7A和B)，其中伴随ε-胡萝卜素(>40mg/L，5500ppm和最终产物的80％)产生增加超过两倍(图6，121+L50菌株)。显著地，去除前100个残基(图6，121+L100菌株)导致蛋白浓度增加～140％(图7A和B)。然而，环化酶活性完全丢失。为了更好地理解截短如何影响LsLCYe表达，对截短的LsLCYe及其天然形式的转录水平和mRNA二级结构进行比较。结果表明，截短的LsLCYe的表达增加并未表现出是由于mRNA表达的显著增加(图7C)或是由于二级mRNA结构的修饰。

为了证明该模块化方法的更广泛的效用，通过用来自菠萝泛菌的番茄红素β环化酶(或crtY)的表达替换LCYe酶来生产其他脱辅基类胡萝卜素。与LsLCYe不同，天然番茄红素β环化酶活性高，并且将大于70％的番茄红素转化为β-胡萝卜素(65mg/L)，具有残余量的番茄红素(24mg/L)(图15中的crtY菌株)。

通过“即插即用”生产类胡萝卜素

实施例4.α-紫罗酮生产的优化

通过模块化方法，可以将类胡萝卜素裂解加氧酶添加至第四表达模块以产生各种脱辅基类胡萝卜素(图8)。N-末端50个氨基酸被截去的LsLCYe(ΔN50-LsLCYe)被进一步研究用于α-紫罗酮生产。先前已经证明，来自桂花的CCD1(OfCCD1)可以在C9-C10位置裂解胡萝卜素以产生α-紫罗酮和β-紫罗酮。因此，将OfCCD1酶在ε-胡萝卜素菌株中过表达(图6中的121-LL和121-L50)。然而，即使菌株121-L50-O中ε-胡萝卜素的可用性增加，检测到的α-紫罗酮的量也小于500μg/L(图9A，插图)。如先前注意到的，番茄红素和ε-胡萝卜素分别是LsLCYe和ΔN50-LsLCYe过表达菌株中积累的主要中间体(图9B)。虽然mRNA被良好地检测到(图7E)，SDS-PAGE分析显示，诱导后24小时几乎没有观察到任何OfCCD1蛋白(图7A和D)。结果表明，OfCCD1表达可能受到翻译不足的限制，这与先前针对其他CCD1过表达的研究一致。

文献表明，与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合将显著提高CCD1在大肠杆菌中的表达和溶解性。因此，检查融合伴侣对OfCCD1的功能表达的改善。测试了三种常用的N-末端融合伴侣，小泛素样修饰物(SUMO)蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)和硫氧还蛋白(TrxA)。当与三种融合伴侣融合时，OfCCD1显著增加了α-紫罗酮的滴度(图9A)。其中，具有TrxA融合的OfCCD1(或TOfCCD1)的菌株能够以低诱导(0.03mM IPTG)产生29.7mg/Lα-紫罗酮，这是多于50倍的提高(图9A)。为了研究融合伴侣的潜在机制，通过变性SDS-PAGE凝胶进一步研究蛋白表达。在没有融合伴侣的情况下，OfCCD1几乎不可检测(图7A和D)。相比之下，与SUMO、MBP和TrxA融合的OfCCD1酶良好地表达。SUMO-，MBP-和TrxA-融合的OfCCD1的相对蛋白条带强度与它们在图9A中的对应α-紫罗酮产量良好相关。例如，表达TOfCCD1的菌株具有最佳表达并产生最高量的α-紫罗酮。进一步研究了融合伴侣对OfCCD1溶解性的影响。所有融合的CCD1都具有明显的可溶性级分(图10)，然而，α-紫罗酮生产与SUMO-、MBP-和TrxA-融合的OfCCD1的溶解性之间没有明显的相关性。由于转录和mRNA二级结构保持相对相似，OfCCD1的表达增加可能是由于翻译效率的提高或蛋白稳定性的增加。有趣的是，即使使用最高的紫罗酮生产菌株(图9，121-L50-TrxA-O菌株，用0.03mM IPTG)，ε-胡萝卜素和番茄红素(～30mg/L总类胡萝卜素)仍然积累到与α-紫罗酮相似的水平(图9B)，表明α-紫罗酮产率可以被进一步提高。因此，实现了α-紫罗酮从500μg/L至29mg/L的生产的逐步提高。

为了进一步提高α-紫罗酮产率，使用同源建模来预测OfCCD1的3D结构(图11)。基于OfCCD1模型，存在两个膜相互作用螺旋。第一个螺旋位于蛋白的N-末端，且第二个螺旋被发现位于序列中(F148-I167)。序列比对表明，主要差异发生在亮氨酸-151、甲硫氨酸-152、天冬酰胺-154和异亮氨酸-167(图18)。通过同时将亮氨酸-151突变为苯丙氨酸、将甲硫氨酸-152突变为苏氨酸并将天冬酰胺-154突变为酪氨酸，α-紫罗酮滴度被进一步提高至～35mg/L(图12A)。蛋白表达分析显示，这些突变进一步提高了trxA融合的OfCCD1表达(图12C和D)。结果突出了CCD酶工程对于提高紫罗酮生产至关重要。

接下来，使用最好的α-紫罗酮生产菌株(121-L50-TrxA-O菌株)测试补料分批发酵中的性能。由于α-紫罗酮是挥发性的，在发酵过程中使用肉豆蔻酸异丙酯捕获化合物。如图13中所示，在48h内生产约480mg/L的α-紫罗酮。总之，实现了α-紫罗酮生产从最初的500μg/L至480mg/L的～1000倍增加。因此，在该研究中实现的α-紫罗酮滴度比先前报道的滴度高约1428倍。

此外，使生产的α-紫罗酮经历手性检查，并发现其是α-紫罗酮的100％R-对映体(图14)，这与天然α-紫罗酮相同。相比之下，化学合成的紫罗酮是50％R-对映体和50％S-对映体的混合物。更重要的是，紫罗酮的不同对映体具有不同的气味和潜在的不同活性。结果清楚地显示了通过“即插即用”平台进行的生物合成优于化学合成的优势。

实施例5.β-紫罗酮生产的优化

为了证明该模块化方法的更广泛的效用，通过共表达类胡萝卜素裂解双加氧酶与来自菠萝泛菌的番茄红素β环化酶(或crtY)来生产其他脱辅基类胡萝卜素。用表达野生型OfCCD1的菌株(Of菌株)生产的β-紫罗酮为140μg/L，对应仅低于1％的从β-胡萝卜素的转化率(图15)。由于N-末端TrxA融合的OfCCD1(TOfCCD1)提高了α-紫罗酮(图9)，测试了它可以类似地提高β-紫罗酮生产的可能性。令人失望的是，TOfCCD1表达没有导致β-紫罗酮生产的显著增加(图15A)。相反，在GC色谱图中检测到另一个在9.46min的主峰(图16和17)。该峰通过美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology；NIST)质谱库被预测为ψ-紫罗酮，并通过真正的ψ-紫罗酮标准品被进一步证实。TOfCCD1的表达导致ψ-紫罗酮生产从～0.4mg/L至～14.6mg/L的37倍增加。值得注意的是，ψ-紫罗酮也是由α-紫罗酮生产菌株生产的，尽管它是次要产品(图9A和12A)。因此，番茄红素表现出也被TOfCCD1裂解并产生ψ-紫罗酮(图8)，这与某些类型的CCD1可以将番茄红素转化为ψ-紫罗酮或6-甲基-5-庚烯-2-酮(MHO)的观察结果一致。此外，观察到在表达TOfCCD1的菌株(TOf菌株，图15B)中没有积累β-胡萝卜素，而是积累大量番茄红素。一个可能的原因可以是在指数期，番茄红素优先被TOfCCD1转化而不是被番茄红素β环化酶环化。

由于在TOf菌株中产生了大量番茄红素和番茄红素衍生的ψ-紫罗酮，因此假设增加crtY的基因剂量(TOf+Y菌株)可具有两个潜在益处。首先，它可以增加从番茄红素到β-胡萝卜素的碳通量，并从而增加β-紫罗酮的生产。其次，通过降低细胞内番茄红素的可用性可以减少ψ-紫罗酮的产生。为了检验该假设，首先将crtY***到我们系统的第一表达模块atoB-hmgS-hmgR中，产生新的操纵子，crY-atoB-hmgS-hmgR(如图15所示)。由于在该研究中使用的质粒为约10个拷贝/细胞，***使crtY拷贝数从10个拷贝/细胞增加到20个拷贝/细胞。有趣的是，crtY的基因剂量有效地导致更多的番茄红素转化为β-胡萝卜素，因此，从不可检测量的β-胡萝卜素(TOf菌株，图15)到显著的产量42.4mg/L(TOf+Y菌株，图15)。因此，β-紫罗酮的滴度从0.3mg/L显著增加至20.9mg/L，且ψ-紫罗酮从14.6mg/L降低至4.4mg/L(图15)，表明更高的碳通量转向通过β-胡萝卜素的β-紫罗酮生产。

尽管补充crtY显著提高了β-紫罗酮的生产，但仍然产生了4.4mg/L的ψ-紫罗酮。为了使β-紫罗酮的生产最大化并使副产物/中间体的形成最小化，筛选对β-胡萝卜素具有更高选择性的CCD。测试另外三种来自拟南芥(AtCCD1)、葡萄(VvCCD1)和矮牵牛(PhCCD1)的CCD1酶(图18)。本研究中使用的所有CCD1酶在表4中示出。通过野生型AtCCD1、VvCCD1和PhCCD1的表达，β-紫罗酮分别以0.1mg/L、13.0mg/L和27.0mg/L产生，分别伴有0.2mg/L、14.8mg/L和4.8mg/L的ψ-紫罗酮(图19A)。数据表明，野生型VvCCD1和PhCCD1在大肠杆菌中具有比AtCCD1和OfCCD1更高的活性。此外，PhCCD1还具有比VvCCD1和TOfCCD1更高的对β-胡萝卜素的选择性。然而，在表达PhCCD1的菌株中仍然积累13.3mg/L的β-胡萝卜素和13.8mg/L的番茄红素(图19B)。接下来，研究TrxA与PhCCD1的融合以及补充另外拷贝的crtY。通过另外补充crtY(Ph+Y菌株)，β-紫罗酮滴度从27mg/L增加至32.4mg/L，并且ψ-紫罗酮滴度从4.8mg/L降低至1.6mg/L。同时，β-胡萝卜素生产从13.3mg/L(Ph菌株)增加至24.3mg/L(Ph+Y菌株)，并且番茄红素生产从13.8mg/L降低至1.5mg/L。然而，TrxA的融合(TPh菌株)仅导致β-紫罗酮生产从27mg/L至30.4mg/L的中等增加，并且ψ-紫罗酮生产从4.8mg/L至3.2mg/L的略微降低。此外，crtY补充和TrxA融合的组合(TPh+Y菌株，图19)没有协同益处。总体来说，结果表明，与OfCCD1不同，天然PhCCD1活性足以有效地将β-胡萝卜素转化为β-紫罗酮。总而言之，β-紫罗酮生产从最初的140μg/L提高至32.4mg/L，在24h的时间段内于管和烧瓶中增加～230倍。此外，在补料分批发酵中，用Ph+Y菌株产生～500mg/L的β-紫罗酮(图19C)，其与初始菌株相比增加约3700倍。

表4总结了本研究中的CCD1酶。

来自生物反应器的有机相的颜色是黄色。为了鉴定黄色化合物，进行了超高效液相色谱-飞行时间质谱联用分析。鉴定出一些二醛(C17和C19)和醇(图20)。这些是由于PhCCD1的非特异性裂解的副产物。为了避免这个问题，进行了对更特异性的CCD的筛选。由于CCD4在底物和产物特异性方面显示出显著改进，我们筛选了表5中列出的几种CCD4酶，并发现PpCCD4对β-胡萝卜素的活性最高，而CmCCD4对ε-胡萝卜素的活性最高(图21)。

表5总结了本研究中的CCD2和CCD4酶。

实施例6.类视黄醇生产的优化

通过在C15-C15'位置裂解β-胡萝卜素生物合成类视黄醇。为了进一步说明“即插即用”系统生产其他脱辅基类胡萝卜素的效用，用来自未培养海洋细菌HF10_19P19(blh1)和未培养海洋细菌66A03(blh2)的两个blh基因(BCDO酶，图8)替换CCD1基因。在没有任何上游途径优化的情况下，“即插即用”系统在blh1菌株中产生18.5mg/L的视黄醇和5.1mg/L的视黄醛，并在blh2菌株中产生3.0mg/L的视黄醇和1.1mg/L的视黄醛(图22A)。在blh1菌株中，番茄红素积累(28.2mg/L)，但未检测到β-胡萝卜素(图22B)。因此，假设blh1菌株中类视黄醇生产受到番茄红素β-环化酶而非BCDO的限制。如预期的，共表达另外的crtY基因(blh1+Y)增加了类视黄醇的产生(从23.6mg/L增加至33.2mg/L)。关于blh2菌株，类视黄醇生产可能受到BCDO而不是番茄红素β-环化酶活性的限制，因为crtY基因剂量的增加尽管将>90％的番茄红素转化为β-胡萝卜素，但未能提高类视黄醇的生产(图22)。值得注意的是，在类视黄醇生产菌株中，预测为大肠杆菌中的氧化还原酶并且通过实验证实具有高视黄醇脱氢酶活性的ybbO基因(Genbank登录ID是ECD_00444，图8)没有过表达，但是大于80％的视黄醛转化为视黄醇。虽然潜在的机制尚不清楚，但这可能是由于ybbO酶或具有视黄醇脱氢酶活性的其他未知内源蛋白的相对高的细胞内表达。类视黄醇和紫罗酮的结果表明，该“即插即用”系统是通用的，并且将可用于生产共有共同上游途径的许多脱辅基类胡萝卜素(图22C)。

讨论

模块化代谢工程已被成功应用以合理改进通过微生物细胞工厂的小分子生产。这是一种减少参数优化空间并允许在与完整途径合并之前对表达模块子集进行顺序优化的强有力方法。通常，随着表达模块数目的增加，通路优化的准确性将提高，但完整组合也将呈指数增加。因此，必须确定平衡的表达模块数目。如本文所描述的，将包含13种基因的多基因途径铸成4个不同的表达模块：上游甲羟戊酸途径(表达模块1)、下游甲羟戊酸途径(表达模块2)、番茄红素生物合成途径(表达模块3)和脱辅基类胡萝卜素生物合成途径(表达模块4)。通过用EDASPO方法优化前三个代谢表达模块，获得了积累高含量番茄红素的稳定亲本菌株(图6中的菌株121)。随后，引入携带番茄红素环化酶和CCD的第四表达模块以产生各种脱辅基类胡萝卜素。使脱辅基类胡萝卜素表达模块独立于剩余表达模块提供了超过非模块化方法的三个主要优点。首先，它使对上游系统(甲羟戊酸途径和番茄红素生物合成途径)的潜在负面影响最小化。其次，它显著简化了菌株工程工作量。随着上游系统被优化并保持有效，工程工作可以集中在下游脱辅基类胡萝卜素生物合成表达模块上。最后，它使该系统成为用于生产有价值的脱辅基类胡萝卜素的“即插即用”底盘(chassis)。因此，“***”番茄红素环化酶(LCYe或crtY)和CCD1产生了α-紫罗酮或β-紫罗酮，并且“***”crtY和blh则产生视黄醇。更重要的是，在烧瓶中获得类似的脱辅基类胡萝卜素滴度(图9、15、19和22)，表明该模块化系统的稳健性。

总体来说，这些结果证明，调节关键蛋白表达对于脱辅基类胡萝卜素在大肠杆菌中的异源生物合成是必需的。从广义上讲，这突出了将蛋白工程和模块化途径设计相结合以过量生产有价值的化学品的益处。

天然成分标签监管方面的最近变化导致对天然调味剂(flavour)和香料的需求增加。因此，对微生物工程化以从可再生资源中生产成分的兴趣越来越高。然而，脱辅基类胡萝卜素途径的复杂代谢特征阻碍了高效微生物过程的发展。有利地，本公开内容提供了模块化代谢工程和酶工程策略，其被系统地应用以有效地使由13种酶的过表达所施加的代谢负担最小化，以克服来自低活性的关键酶的挑战。该策略使得能够开发出能够生产前所未有的产量的α-紫罗酮和β-紫罗酮的稳健的大肠杆菌菌株，证明了使用微生物生产天然调味剂和香料的巨大潜力。