一种利用肌酐处理巴氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法
阅读说明：本技术 一种利用肌酐处理巴氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法 (Method for producing carotenoid by treating Dunaliella bardawil with creatinine ) 是由 姜建国 吴芳纯 梁明华 李瑜 梁志聪 何羽婧 陈浩宏 于 2020-12-15 设计创作，主要内容包括：本发明一种利用肌酐处理巴氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法,属于食品科学技术领域。该方法为：将巴氏杜氏藻细胞接种至培养基中,培养,待OD_(630)达到0.7～1.1,加入肌酐至终浓度为300～500ppm,于4500～9500Lux光照条件下继续培养15～20天,提取色素,获得目标产物。本发明方法成本低廉、简单易行,加入肌酐之后可有效提高巴氏杜氏藻中多种类胡萝卜素的含量,而且巴氏杜氏藻培养简便,不易被污染。本发明是一种有效可行且经济的提高巴氏杜氏藻中类胡萝卜素含量的方法,具有广泛的应用前景。(The invention relates to a method for producing carotenoid by treating Dunaliella bardawil with creatinine, belonging to the technical field of food science. The method comprises the following steps: inoculating Dunaliella bardawil cells into culture medium, culturing until OD is reached 630 And when the concentration reaches 0.7-1.1, adding creatinine to the final concentration of 300-500 ppm, continuously culturing for 15-20 days under the illumination condition of 4500-9500 Lux, and extracting the pigment to obtain the target product. The method has low cost, is simple and feasible, can effectively improve the content of various carotenoids in the Dunaliella bardawil after adding the creatinine, is simple and convenient to culture, and is not easy to pollute. The invention is an effective, feasible and economic method for improving the carotenoid content in the Dunaliella bardawilThe method has wide application prospect.)
技术领域
本发明属于食品科学技术领域，具体涉及一种利用肌酐处理巴氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法。
背景技术
类胡萝卜素是具有类异戊二烯结构的亲脂性色素，可分为叶黄素类(如玉米黄素和叶黄体素)和胡萝卜素类(如番茄红素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素)。其广泛存在于高等植物、微藻类和非光合生物中，可由光合植物，真菌和藻类从头合成。类胡萝卜素可赋予各种水果和蔬菜独特的颜色如橙色、黄色或某些红色，并呈现独特的味道和香气。此外，类胡萝卜素对人和动物具有重要的生理功能，具有强大的抗氧化活性、保护视力、增强人体免疫力及抗炎抗癌等功效。在工业上，类胡萝卜素常被用作食品色素(乳制品、饮料等)、饲料添加剂、化妆品和药品，特别是在消费者对天然产品的需求日益增长的今天。
微藻被认为是生产类胡萝卜素和生物柴油的理想原料。巴氏杜氏藻(Dunaliellabardawil)因其含量丰富、生长速率快，不占耕地面积，并且不受季节变化限制，有利于在室外甚至开放水域低成本大规模培养；而且，巴氏杜氏藻细胞富含叶黄素和β-胡萝卜素等类胡萝卜素，被认为是生产天然类胡萝卜素的生物来源。此外，提高微藻中类胡萝卜素产量是众多相关课题组的研究重点。目前，对微藻施加非生物胁迫、基因工程调控或化学物质干扰，可促进微藻大量积累类胡萝卜素。化学诱导剂法是一种经济可行的积累类胡萝卜素的有效简便策略。因此，寻找可促进巴氏杜氏藻大量累积类胡萝卜素的化学物质，对类胡萝卜素积累有着重大意义。
发明内容
为了提高巴氏杜氏藻中类胡萝卜素的产量，本发明旨在提供一种利用肌酐处理巴氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种利用肌酐处理巴氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法，是将巴氏杜氏藻细胞接种至培养基中，培养，待OD630达到0.7～1.1(对数生长期)，加入肌酐至终浓度为300～500ppm，于4500～9500Lux光照条件下继续培养15～20天，提取色素，获得目标产物。
所述的巴氏杜氏藻优选为巴氏杜氏藻Dunaliella bardawil FACHB-847。
所述的培养基，其成分为：NaNO30.420g/L，NaCl87.69g/L，NaH2PO4·2H2O0.156g/L，NaHCO30.840g/L，KCl0.074g/L，MgSO4·7H2O1.230g/L，CaCl2·2H2O0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L，A5微量元素溶液1mL/L；
所述的A5微量元素溶液，其成分为：H3BO3 2.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.04g/L；
所述的Fe-EDTA液，其成分为：Na2EDTA0.189g/L，FeCl3·6H2O 0.244g/L。溶液中Fe离子浓度0.1mg/mL。
所述的培养基在使用前，需经灭菌处理，冷却至室温待用。
所述的灭菌处理的条件，优选为在102.9kPa大气压下121℃高温灭菌20min。
所述的巴氏杜氏藻细胞的接种量按体积比5％计。
所述的培养优选为培养至OD630达到1.0。
所述的肌酐的添加量，优选为按肌酐终浓度为400～500ppm计；更优选为按按肌酐终浓度为500ppm计。
所述的光照条件优选为4500～5000Lux；更优选为4500Lux。
所述的继续培养的条件优选为：光暗周期为14h/10h，温度为28～33℃，以50r/min的转速震荡培养。
所述的继续培养的时间优选为16天。
所述的提取色素的具体操作优选为：取培养液，8000rpm离心1min，弃去上清液，按体积比10:1加入丙酮，涡旋2min，浸提20min，以10000rpm离心10min，取上清液转移至新的离心管中，按体积比100:1加入60％KOH(去除叶绿素)，静置分层，用0.45μm的滤膜过滤。色素样品可于-20℃冰箱保存。
使用高效液相色谱法(HPLC)分离检测丙酮相中的类胡萝卜素，所用的色谱柱为Welch Ultimate XB-C18；所用的流动相为：A相：97％甲醇+3％超纯水，B相为100％叔丁基甲醚，所用的流速为1.0mL/min，所用的柱温为25℃。
叶黄素的峰面积/含量换算公式为：y＝63.124x-0.4755；
玉米黄素的峰面积/含量换算公式为：y＝47.805x-8.4906；
α-胡萝卜素的峰面积/含量换算公式为：y＝95.696x-12.952；
β-胡萝卜素的峰面积/含量换算公式为：y＝34.791x+59.973。
换算公式通过标准品标定而得。
本发明的效果为：肌酐处理巴氏杜氏藻可显著提高其总类胡萝卜素产量。结合光照培养，加入肌酐量为500ppm时，其中最有利于总类胡萝卜素积累的最适光照强度为4500Lux。本发明中肌酐用量少，对刺激巴氏杜氏藻积累类胡萝卜素效果显著，且巴氏杜氏藻培养简便，不易被污染。
相对于现有技术本发明具有的优点及效果：
(1)本发明加入肌酐后不仅仅增加了巴氏杜氏藻的总生物量，还使其体内叶黄素、α-胡萝卜素及β-胡萝卜素含量显著增加，玉米黄素含量降低，但总类胡萝卜素量有了显著的提升。而且，本发明中使用的肌酐用量少，成本低，对刺激巴氏杜氏藻积累类胡萝卜素效果佳。
(2)本发明使用的巴氏杜氏藻是一类自养真核生物，培养条件简单、生长速度快，不易污染，无毒无害。
(3)本发明发现肌酐与低光照强度相互结合培养巴氏杜氏藻，可进一步促进其积累类胡萝卜素。
附图说明
图1是光照强度为4500Lux时肌酐处理巴氏杜氏藻16天的类胡萝卜素液相图谱。
图2是光照强度为7500Lux时肌酐处理巴氏杜氏藻16天的类胡萝卜素液相图谱。
图3是光照强度为9500Lux时肌酐处理巴氏杜氏藻16天的类胡萝卜素液相图谱。
图4为不同光照强度下不同浓度肌酐处理对巴氏杜氏藻中类胡萝卜素含量的影响图；其中，A为4500Lux光照强度，B为7500Lux光照强度，C为9500Lux光照强度。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例所用巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil FACHB-847购于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(武汉)，采用液体培养基弱光保存；所用肌酐购于阿拉丁，产品编号C108393，CAS号60-27-5。
实施例1
(1)巴氏杜氏藻液体培养基的配制
其成分为：NaNO3 0.420g/L，NaCl 87.69g/L，NaH2PO4·2H2O 0.156g/L，NaHCO30.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO4·7H2O 1.230g/L，CaCl2·2H2O 0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L，A5微量元素溶液1mL/L。Fe-EDTA液成分如下：Na2EDTA0.189g/L，FeCl3·6H2O0.244g/L。A5微量元素溶液成分如下：H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.04g/L。基本培养液按200mL每瓶分装至500mL的三角瓶中，四层纱布封口，在102.9kPa大气压下121℃高温灭菌20min。室温冷却后使用。
(2)接种培养
将巴氏杜氏藻Dunaliella bardawil FACHB-847藻液于4000r/min下离心3min，弃除培养液，按体积比5％的接种量将藻细胞加入装有新鲜灭菌培养液的三角瓶中，用四层纱布包裹瓶口并用橡皮筋扎紧。将三角瓶置于光照培养箱中，当细胞处于对数生长期(OD630达到1.0左右)时分别加入肌酐至肌酐终浓度分别为0、300、400、500ppm，设置光照强度为4500，7500及9500Lux(光暗周期为14h/10h)，温度为28～33℃，以50r/min的转速震荡培养。继续培养约16天，每隔2天取样一次。
(3)类胡萝卜素的提取
取20mL藻液，8000rpm离心1min，弃去上清液，重新加入2mL丙酮，涡旋2min，浸提20min，以10000rpm离心10min，取上清液转移至4mL离心管，加0.2mL的60％KOH(去除叶绿素)，静置分层，用0.45μm的滤膜过滤，-20℃冰箱保存。
(4)类胡萝卜素含量的测定
使用高效液相色谱法(HPLC)分离检测丙酮相中的类胡萝卜素，所用的色谱柱为Welch Ultimate XB-C18；所用的流动相为：A相：97％甲醇+3％超纯水，B相为100％叔丁基甲醚，所用的流速为1.0mL/min，所用的柱温为25℃。
叶黄素的峰面积/含量换算公式为：y＝63.124x-0.4755；
玉米黄素的峰面积/含量换算公式为：y＝47.805x-8.4906；
α-胡萝卜素的峰面积/含量换算公式为：y＝95.696x-12.952；
β-胡萝卜素的峰面积/含量换算公式为：y＝34.791x+59.973。
换算公式通过标准品标定而得。
光照强度为4500Lux、7500Lux、9500Lux条件下培养约16天后，HPLC分离检测类胡萝卜素的结果分别如图1、2、3所示。总类胡萝卜素含量的变化如图4所示。
(5)结论
4500Lux光照与肌酐联合作用于巴氏藻16天，四种类胡萝卜素含量变化如图1所示：400μg/mL及500μg/mL肌酐作用下总类胡萝卜素含量提高10％以上，其中浓度为500μg/mL肌酐作用后，叶黄素含量提高46％，α-胡萝卜素含量提高40％，β-胡萝卜素含量提高近77％。
7500Lux光照与肌酐联合作用于巴氏藻16天，四种类胡萝卜素含量变化如图2所示：叶黄素总产量随着肌酐浓度升高而明显升高。其中浓度为500μg/mL的肌酐作用后叶黄素含量提高30％，单细胞含量提高10％；玉米黄素含量降低14％，单细胞含量降低25％。而α-胡萝卜素、β-胡萝卜素含量变化较小与浓度无明显相关性。
肌酐与9500Lux光照作用于巴氏藻16天，四种类胡萝卜素含量变化如图3所示：500μg/mL实验组叶黄素含量增加16％，但单细胞含量变化不显著，其他三种色素均呈现明显下降趋势。这显示高光照不利于肌酐提高巴氏藻细胞内各种类胡萝卜素的积累。
综上，最有利于类胡萝卜素在巴氏杜氏藻中积累的条件为500ppm的肌酐，4500Lux的光照强度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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