一种利用肌酐处理特氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法
阅读说明：本技术 一种利用肌酐处理特氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法 (Method for producing carotenoid by treating Dunaliella tertiolecta with creatinine ) 是由 姜建国 吴芳纯 梁明华 李瑜 何羽婧 陈浩宏 梁志聪 于 2020-12-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用肌酐处理特氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法,属于食品科学技术领域。该方法为：将特氏杜氏藻细胞接种至培养基中,培养,待OD_(630)达到0.7～1.1(对数生长期),加入肌酐至终浓度为400～800ppm,于6000Lux光照条件下继续培养20～28天,提取色素,获得目标产物。本发明方法成本低廉、简单易行,加入肌酐之后可有效提高特氏杜氏藻中多种类胡萝卜素的含量,而且特氏杜氏藻培养简便,不易被污染。本发明是一种可行且经济的提高特氏杜氏藻中类胡萝卜素含量的有效方法,具有广泛的应用前景。(The invention discloses a method for producing carotenoid by treating Dunaliella tertiolecta with creatinine, belonging to the technical field of food science. The method comprises the following steps: inoculating Dunaliella tertiolecta cells into culture medium, culturing until OD is reached 630 And (3) reaching 0.7-1.1 (logarithmic growth phase), adding creatinine till the final concentration is 400-800 ppm, continuously culturing for 20-28 days under the condition of 6000Lux illumination, and extracting the pigment to obtain the target product. The method has low cost, is simple and feasible, can effectively improve the content of multiple carotenoids in the Dunaliella tertiolecta after adding the creatinine, is simple and convenient to culture, and is not easy to pollute. The invention is a feasible and economic method for improving carotenoid in Dunaliella tertiolectaThe effective method of the content has wide application prospect.)
技术领域
本发明属于食品科学技术领域，具体涉及一种利用肌酐处理特氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法。
背景技术
类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称。类胡萝卜素普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类和细菌中。类胡萝卜素因其具有显著的生理活性而备受关注和研究。研究表明，类胡萝卜素中(如胡萝卜素)可保护视力、改善夜盲症和维持皮肤健康，并且具有显著的抗氧化作用和预防动脉粥样硬化等功效。如今，类胡萝卜素广泛被应用于食品、饲料、化妆品及药制品等行业。
人体自身不能合成类胡萝卜素，必须通过外界摄入；但类胡萝卜素在许多植物中含量较低，并很难用化学方法合成，主要是通过生物合成方式完成。目前，生产类胡萝卜素的方法主要有3种：化学合成法、天然提取法及微生物合成法。化学合成的类胡萝卜素活性差，一般只能用作色素，天然提取获得的类胡萝卜素虽具有多种功能活性，但低提取率和低收率且对环境造成污染。而利用微生物合成法可大量生产类胡萝卜素，并且原料成本低，环境污染小。微藻被认为是生产类胡萝卜素和生物柴油的理想原料。特式杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)，是常见的盐生绿藻，生长繁殖快、易于大规模培养、对环境友好无毒无害。此外，利用化学物质干扰特氏杜氏藻会大量积累类胡萝卜素如β-胡萝卜素。因此，寻求一种可刺激特氏杜氏藻大量积累类胡萝卜素的物质，有利于满足市场对类胡萝卜素的需求。
发明内容
为了提高特氏杜氏藻中类胡萝卜素的产量，本发明旨在提供一种利用肌酐处理特氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种利用肌酐处理特氏杜氏藻生产类胡萝卜素的方法，是将特氏杜氏藻细胞接种至培养基中，培养，待OD630达到0.7～1.1(对数生长期)，加入肌酐至终浓度为400～800ppm，于6000Lux光照条件下继续培养20～28天，提取色素，获得目标产物。
所述的特氏杜氏藻优选为Dunaliella tertiolecta FACHB-821。
所述的培养基，其成分为：NaNO30.420g/L，NaCl87.69g/L，NaH2PO4·2H2O0.156g/L，NaHCO30.840g/L，KCl0.074g/L，MgSO4·7H2O1.230g/L，CaCl2·2H2O0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L，A5微量元素溶液1mL/L；
所述的A5微量元素溶液，其成分为：H3BO3 2.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.04g/L；
所述的Fe-EDTA液，其成分为：Na2EDTA 0.189g/L，FeCl3·6H2O 0.244g/L。溶液中Fe离子浓度0.1mg/mL。
所述的培养基在使用前，需经灭菌处理，冷却至室温待用。
所述的灭菌处理的条件，优选为在102.9kPa大气压下121℃高温灭菌20min。
所述的特氏杜氏藻细胞的接种量按体积比5％计。
所述的培养优选为培养至OD630达到1.0。
所述的肌酐的添加量，优选按肌酐终浓度为600ppm计。
所述的继续培养的条件优选为：光暗周期为14h/10h，温度为28～33℃，以50r/min的转速震荡培养。
所述的继续培养的时间优选为24天。
所述的提取色素的具体操作优选为：取培养液，8000rpm离心1min，弃去上清液，按体积比10:1加入丙酮，涡旋2min，浸提20min，以10000rpm离心10min，取上清液转移至新的离心管中，按体积比100:1加入60％KOH(去除叶绿素)，静置分层，用0.45μm的滤膜过滤。色素样品可于-20℃冰箱保存。
使用高效液相色谱法(HPLC)分离检测丙酮相中的类胡萝卜素，所用的色谱柱为Welch Ultimate XB-C18；所用的流动相为：A相：97％甲醇+3％超纯水，B相为100％叔丁基甲醚，所用的流速为1.0mL/min，所用的柱温为25℃。
叶黄素的峰面积/含量换算公式为：y＝63.124x-0.4755；
玉米黄素的峰面积/含量换算公式为：y＝47.805x-8.4906；
α-胡萝卜素的峰面积/含量换算公式为：y＝95.696x-12.952；
β-胡萝卜素的峰面积/含量换算公式为：y＝34.791x+59.973。
换算公式通过标准品标定而得。
本发明的效果为：利用肌酐干扰特氏杜氏藻可显著提高其总类胡萝卜素产量。加入肌酐的量为600ppm时，特氏杜氏藻中叶黄素、α-胡萝卜素及β-胡萝卜素的总产量和单细胞产量均达到较高值。本发明中，肌酐用量少，且特氏杜氏藻培养简便，对干扰特氏杜氏藻积累类胡萝卜素效果显著。
相对于现有技术本发明具有的优点及效果：
(1)本发明加入肌酐后不仅仅增加了特氏杜氏藻的总生物量且具有浓度依赖性，还使其体内叶黄素、α-胡萝卜素及β-胡萝卜素含量的总产量和单细胞产量显著增加，玉米黄素含量降低，但总类胡萝卜素量有了显著的提升。
(2)本发明使用的特氏杜氏藻是一类自养真核生物，培养条件简单、生长繁殖快，不易被污染，无毒无害。
(3)本发明使用的肌酐用量少，成本低廉，对刺激特氏杜氏藻积累类胡萝卜素效果佳。
附图说明
图1是加入肌酐4天后特氏杜氏藻类胡萝卜素成分变化的液相图谱。
图2是加入肌酐8天后特氏杜氏藻类胡萝卜素成分变化的液相图谱。
图3是肌酐12天后特氏杜氏藻类胡萝卜素成分变化的液相图谱。
图4是肌酐16天后特氏杜氏藻类胡萝卜素成分变化的液相图谱。
图5为肌酐对特氏杜氏藻类胡萝卜素的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例所用特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolectaFACHB-821)购于中科院水生生物研究所(武汉)，采用液体培养基弱光保存；所用肌酐购于阿拉丁，产品编号C108393，CAS号60-27-5。
实施例1
(1)特氏杜氏藻液体培养基的配制
其成分为：NaNO3 0.420g/L，NaCl 87.69g/L，NaH2PO4·2H2O 0.156g/L，NaHCO30.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO4·7H2O 1.230g/L，CaCl2·2H2O 0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L，A5微量元素溶液1mL/L。Fe-EDTA液成分如下：Na2EDTA 0.189g/L，FeCl3·6H2O0.244g/L。A5微量元素溶液成分如下：H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.04g/L。基本培养液按200mL每瓶分装至500mL的三角瓶中，四层纱布封口，在102.9kPa大气压下121℃高温灭菌20min。室温冷却后使用。
(2)诱导培养
将特氏杜氏藻DunaliellatertiolectaFACHB-821藻液于4000r/min下离心3min，弃除培养液，按体积比5％的接种量将藻细胞加入装有新鲜灭菌培养液的三角瓶中，用四层纱布包裹瓶口并用橡皮筋扎紧。将三角瓶置于光照培养箱中，当特氏杜氏藻细胞处于对数生长期(OD630为1左右)，分别向藻液中添加不同终浓度的肌酐(0(对照组，T)、400、600、800ppm)，继续培养24天(培养条件为光照强度6000Lux；光暗周期为14h/10h；温度为28～33℃，以50r/min的转速震荡培养)，培养24天，每隔4天取样一次，测量类胡萝卜素含量。
(3)类胡萝卜素的提取
取20mL藻液，8000rpm离心1min，弃去上清液，重新加入2mL丙酮，涡旋2min，浸提20min，以10000rpm离心10min，取上清液转移至4mL离心管，加0.2mL的60％KOH(去除叶绿素)，静置分层，用0.45μm的滤膜过滤，-20℃冰箱保存。
(4)类胡萝卜素含量的测定
使用高效液相色谱法(HPLC)分离检测丙酮相中的类胡萝卜素，所用的色谱柱为Welch Ultimate XB-C18；所用的流动相为：A相：97％甲醇+3％超纯水，B相为100％叔丁基甲醚，所用的流速为1.0mL/min，所用的柱温为25℃。
叶黄素的峰面积/含量换算公式为：y＝63.124x-0.4755；
玉米黄素的峰面积/含量换算公式为：y＝47.805x-8.4906；
α-胡萝卜素的峰面积/含量换算公式为：y＝95.696x-12.952；
β-胡萝卜素的峰面积/含量换算公式为：y＝34.791x+59.973。
换算公式通过标准品标定而得。
分阶段性HPLC分离检测类胡萝卜素的结果如图1-4所示。总类胡萝卜素含量的变化如图5所示。
(5)结论
肌酐干扰特氏杜氏藻，可显著提高其类胡萝卜素累积量。从阶段性液相图来看，加入肌酐后不仅仅增加了特氏杜氏藻的总生物量且具有浓度依赖性，在不同时间阶段下类胡萝卜素成分有变化。
加药第四天，由图1可以看出不同浓度肌酐作用下特氏藻细胞内四种主要类胡萝卜素含量的变化。对照组叶黄素产量为1.52μg/mL，加入肌酐至浓度为400μg/mL作用后叶黄素产量达到1.6μg/mL，提高了5％。600μg/mL实验组叶黄素产量达1.78μg/mL，较对照组提高了17％。400μg/mL组与600μg/mL组的单细胞产量则分别提高了6％及18％。400μg/mL组玉米黄素总量下降至78％，而600μg/mL组下降至57％，单细胞含量下降至57％。α-胡萝卜素总含量提高，600μg/mL组总量提高35％。β-胡萝卜素总量与单细胞含量均随浓度明显提高，肌酐浓度为600μg/mL时达到最大，分别增加了33％与36％。
加药第八天，由图2可以看出不同浓度肌酐作用下特氏藻细胞内四种主要类胡萝卜素含量变化。作用浓度600μg/mL八天后，叶黄素总含量提高28％，单细胞含量提高24％。玉米黄素总量与单细胞含量依旧显著下降。α-胡萝卜素含量较少，但也随药物浓度增加有所增加。β-胡萝卜素在作用浓度为600μg/mL达到较高含量，其总含量提高33％，单细胞含量提高34％。
加药第十二天，由图3可以看出不同浓度肌酐作用下特氏藻细胞内四种主要类胡萝卜素含量变化。600μg/mL的肌酐使叶黄素产量提高14％，单细胞产量提高12％；玉米黄素总含量及单细胞含量均降低约50％；α-胡萝卜素总量升高7％，单细胞含量升高5％；β-胡萝卜素总量提高20％，单细胞含量提高18％。
加药第十六天，由图4可以看出不同浓度肌酐作用下特氏藻细胞中四种主要类胡萝卜素含量的变化。综合四种色素变化趋势，600μg/mL的肌酐作用能明显提高叶黄素、α-胡萝卜素及β-胡萝卜素含量，同时降低玉米黄素含量。600μg/mL肌酐作用对比对照组叶黄素产量为2.32μg/mL增加至3.02μg/mL，对比提高30％，单细胞含量亦提高接近30％；总α-胡萝卜素增长15％，单细胞含量增长16％；总β-胡萝卜素增长40％，单细胞含量增长30％；而玉米黄素总含量下降50％，单细胞含量下降40％。
总之，肌酐处理特氏藻可提高总类胡萝卜素含量，提高叶黄素、α-胡萝卜素及β-胡萝卜素含量，与此同时降低了玉米黄素含量。根据阶段性液相图来看，药物效果从第四天至第十六天一致。对三种色素增加效果最好的浓度为600μg/mL，叶黄素、α-胡萝卜素及β-胡萝卜素的总产量和单细胞产量均达到较高值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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