阅读说明：本技术 利用代谢组分析诊断***的方法 (Method for diagnosing Behcet's disease using metabolome analysis ) 是由 金京宪 车勋锡 金净衍 安重敬 于 2018-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用代谢组分析诊断白塞氏病的方法,并提供一种生物标记,通过所述生物标记可利用代谢组学有效地诊断白塞氏病,并且所述生物标记可用于研发白塞氏病的治疗剂。(The present invention relates to a method for diagnosing Behcet's disease using metabolomic analysis, and provides a biomarker by which Behcet's disease can be effectively diagnosed using metabolomics and which can be used to develop a therapeutic agent for Behcet's disease.)

利用代谢组分析诊断***的方法

技术领域

本发明涉及一种通过代谢组学分析(metabolomic analysis)来诊断***(Behcet’s disease)的方法。

背景技术

***是一种病因未知且由例如以下各种症状表征的系统性血管炎：口腔、生殖器及***溃疡、葡萄膜炎(uveitis)、关节炎、以及疾病入侵重要器官(例如，胃肠道、血管及中枢神经系统等)。据报道，***更频繁地发生在从地中海沿岸到远东亚地区，尤其是在韩国、中国、日本及土耳其。

***具有非常多样的临床表现，并可伴有轻度症状(例如，反复口腔溃疡)以及致命后遗症(例如，失明、肠溃疡及穿孔、动脉瘤引起的咯血、深静脉血栓形成及偏瘫)，所述后遗症是由疾病入侵眼球、胃肠道、血管及中枢神经系统等引起的。***的各种症状被视为在20多岁到40多岁之间具有最严重的活性，且因此预计所述疾病会导致非常巨大的经济及社会损失。

***依据对不同器官的入侵而表现出不同的临床表现及预后，且因此很难诊断及治疗所述疾病。因此，为了使由***引起的并发症及失调症最小化，在早期准确诊断***是非常重要的。

***的诊断主要依赖于临床症状，因为缺乏客观的诊断生物标记(biomarker)来将***患者与健康人区别开来。然而，事实上，由于遗传、环境及免疫异常导致疾病入侵若干器官，***伴随有各种临床症状，且因此众所周知的单一生物标记表现出低敏感度及低特异性(specificity)。因此，由于各种临床症状及现有生物标记的不准确性，难以进行准确的诊断，且因此在疾病发作后需要很长时间进行明确诊断。为了克服这些障碍，发明客观的诊断生物标记是非常重要的。

因此，通过发现能够诊断***的客观诊断生物标记，可在早期诊断***，且因此可减少明确诊断***所花费的时间，并且可对所述疾病进行恰当的治疗，从而使由于患者症状恶化而引起的并发症最小化。此外，此为患者提供定制的治疗，而不需要昂贵及不必要的治疗，并且为患者提供关于疾病相关预后的准确信息，且因此预期可获得更好的治疗分数(treatment score)。最近，代谢组学在发现风湿性疾病(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎及系统性红斑狼疮)的生物标记方面已引起了广泛关注。[马德森RK(Madsen RK)等人，类风湿性关节炎中代谢紊乱的诊断性质(Diagnostic propertiesof metabolic perturbations in rheumatoid arthritis)(2011)关节炎研究与治疗(Arthritis Res Ther.)。13(1)：R19；卡普尔(kappor)等人，代谢图谱预测类风湿性关节炎患者对抗肿瘤坏死因子α治疗的反应(Metabolic profiling predicts response toanti-tumor necrosis factorαtherapy in patients with rheumatoid arthritis)(2013)关节炎与风湿病(Arthritis Rheum)65:1448-65；金姆s(Kim s)等人，滑膜液的整体代谢物图谱用于类风湿性关节炎与其他炎性关节炎的特异性诊断(Global metaboliteprofiling of synovial fluid for the specific diagnosis of rheumatoid arthritisfrom other inflammatory arthritis)。(2014)公共科学图书馆(PLos one)9:e97501]。

迄今报道的发现***生物标记的技术是基于基因组或蛋白质组学(genomicor proteomic)方法，但结果并不清楚，或者难以将这些技术实际用于***的诊断[优子(Yuko)等人，伴葡萄膜炎***自身免疫的蛋白质组学监测：硒结合蛋白是***中的一种新颖自身抗原(Proteomic surveillance of autoimmunity in Behcet'sdisease with uveitis:selenium binding protein is a novel autoantigen inBehcet's disease)。(2007)实验眼研究(Experimental Eye Research)84：823-831；诚道(Seido)等人，通过蛋白质组学方法对***患者自身抗原进行蛋白质组学监测(Proteomic surveillance of autoantigens in patients with Behcet's disease bya proteomic approach)。(2010)微生物免疫学(Microbiol Immunol)54：354-361]，并且没有关于发现适用于利用代谢组学诊断及预测***预后的生物标记的研究报告。

发明内容

技术问题

因此，为发现血液样本中的特异生物标记从而快速且方便地诊断***，进行研究并作出努力以通过应用气相色谱/飞行时间质谱(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，GC/TOF MS)发现血液中代谢物(其能够将表现出各种症状的***患者与健康对照(healthy controls)区别开来)的代谢组学图谱以及特异代谢组，其结果是本发明的发明人通过将代谢组学应用于血液而发现了用于准确诊断***的新颖生物标记，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种通过代谢组学分析诊断***的试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种分析代谢物差异用于诊断***的方法。

技术解决方案

本发明提供一种***诊断试剂盒，所述***诊断试剂盒包括用于一种或多种血液代谢物的定量装置，所述一种或多种血液代谢物选自由癸酸(decanoic acid)、果糖(fructose)、塔格糖(tagatose)、油酸(oleic acid)、亚油酸(linoleic acid)、L-半胱氨酸(L-cysteine)、山梨醇(sorbitol)、尿苷(uridine)、肌苷(inosine)、植物半乳糖(galactonate)、乙醇酸(glycolate)、棕榈酸(palmitic acid)及组氨酸(histidine)组成的群组。

本发明还提供一种检测从正常对照获得的血液与从***患者获得的血液之间的代谢物差异的方法，所述方法包括：通过依序执行以下过程来分析来自血液的代谢物生物标志：

(1)利用气相色谱/飞行时间质谱(GC/TOF MS)来分析代谢物；

(2)通过对利用气相色谱/飞行时间质谱所识别的所述代谢物进行偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)来确认代谢物图谱(metabolite profile)之间的差异；

(3)在通过偏最小二乘判别分析获得的所述代谢物中选择变量投影重要性(variable-importance-for-projection，VIP)值为1.5或大于1.5的代谢物作为代谢物生物标记候选物，并通过偏最小二乘判别分析的负荷值来确认所述代谢物生物标记候选物的增加或减少；以及

(4)使用受试者操作特性曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)验证代谢物生物标记。

有利效果

根据本发明，已经发现能够通过代谢组学方法快速且准确诊断***的生物标记，以特异性地对***患者进行有差别的诊断。通过使用GC/TOF MS分析***患者及正常个体的血液样本中的代谢物，已经检测到104种代谢物。通过计算偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的值及变量投影重要性(VIP)的值、受试者操作特性(ROC)曲线的曲线下面积(area under the curve，AUC)的值、倍数变化、p值等，已经提出了13种有效的代谢物生物标记。此外，最终使用五种生物标记(癸酸、果糖、塔格糖、油酸及亚油酸)构建了用于诊断***的小组(panel)，并使用确认集(validation set)验证了其临床有效性。根据本发明，首先使用基于代谢组学的血液分析来确定能够特异性诊断***的生物标记。这些生物标记可作为揭示尚未完全被发现的***发病机制的研究基础。此外，这些生物标记也可用于研发针对各种临床症状优化的治疗剂。有助于诊断***的生物标记的发现使得能够快速且准确地诊断***患者，并且显著减少临床诊断所需的长时间，从而快速地为患者提供定制的治疗，并且因此预期例如快速恢复日常生活等社会及经济连锁效应是相当大的。

附图说明

图1示出使用PLS-DA获得的显示从***患者获得的血液与从健康对照获得的血液之间的代谢组学图谱中代谢物差异的结果，其显示***患者与健康对照之间的明显差异[BD：***；HC：健康对照]。

图2是组图，用于比较在***组中显示显著增加的前9种代谢物(A)的水平与在***组中显示显著减少的前4种代谢物(B)的水平[BD：***；HC：健康对照]。

图3a到图3c示出PLS-DA结果，其显示施用或未施用类固醇(steroid)、秋水仙碱(colchicine)或硫唑嘌呤(azathioprine)的***患者组之间的代谢物差异，其中每个施药组与未施药组之间的差异由于其非常低的Q²值而没有再现性(reproducibility)，并且在各组代谢物之间没有统计学上显著的差异。

图4示出通过PCA产生的多元分析模型，以使用在***组中显示显著增加的前3种代谢物(癸酸、果糖及塔格糖)及在***组中显示显著减少的前2种代谢物(油酸及亚油酸)产生用于诊断***的代谢物生物标记小组，其中当使用单轴(PC1)时，R²X值为0.721，其显示恰当的分类，并且所述模型显示出为0.515的Q²值，由此确认所述模型具有再现性[[BD：***；HC：健康对照]。

图5示出用于使用血液样本诊断***的代谢诊断小组的受试者操作特性曲线(ROC)结果，其中使用5种代谢物的组合的生物标记小组在诊断***时表现出100％的敏感度、97.1％的特异性及0.993的AUC值。

图6示出用于使用血液样本诊断***的代谢诊断小组的确认集验证结果，其中主成分分析结果显示，在***患者的10份血液样本及健康对照的10份血液样本中，所述小组能够准确预测***患者的9份血液样本及健康对照的10份血液样本[BD：***；HC：健康对照]。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明的配置。

本发明涉及一种***诊断试剂盒，所述***诊断试剂盒包括用于一种或多种血液代谢物的定量装置，所述一种或多种血液代谢物选自由癸酸、果糖、塔格糖、油酸、亚油酸、L-半胱氨酸、山梨醇、尿苷、肌苷、植物半乳糖、乙醇酸、棕榈酸及组氨酸组成的群组。

为了发现***的生物标记，本发明的发明人从***患者收集血液样本，对血液样本进行甲醇提取，使用GC/TOF MS比较及分析***患者与正常个体之间代谢物图谱的差异，并对利用所述差异发现能够诊断***患者的生物标记进行研究。

结果，识别出104种代谢物，所述104种代谢物被分类为胺、氨基酸、脂肪酸、有机酸、磷酸酯、糖等。其中，检测到最大量的氨基酸，然后依次是有机酸、脂肪酸、糖、胺、磷酸酯等。

当将35名***患者(BD)的血液样本与35名健康对照(HC)的血液样本进行比较时，通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)确认了***患者的血液样本与健康对照的血液样本之间代谢物图谱的明显差异，并将为1.5或大于1.5的VIP值、为1.2的倍数变化、为0.800或大于0.800的AUC值以及小于0.01的p值设定为每种代谢物的参考值，并且选择13种代谢物作为新颖生物标记候选物。在***患者及健康对照中，每种代谢物表现出统计学上显著的差异，由此确认代谢物是合适的候选生物标记。此外，为了确认***的特异代谢物图谱及生物标记候选物不是由于被施用以治疗***的药物的作用，将***患者根据施用的药物进行分组以进行PLS-DA，且结果确认了施予***患者的药物未导致代谢物差异。

此外，从选择作为候选生物标记的13种代谢物中，选择在***患者的血液样本中显示显著增加的3种代谢物(癸酸、果糖及塔格糖)及在***患者的血液样本中显示显著减少的2种代谢物(油酸及亚油酸)，以产生由5种代谢物组成的用于区别***的代谢物生物标记小组。为了确认由5种候选物组成的生物标记小组用于诊断***的潜力，使用ROC曲线进行了验证，并且所述生物标记小组具有100％的敏感度、97.1％的特异性及0.993的AUC值，从而显示出对诊断***来说非常好的结果。此外，为了确认模型的适用性，使用***患者的10份血液样本及健康对照的10份血液样本进行了主成分分析。结果，验证了使用本发明的发明人发现的5种代谢物的生物标记小组适用于诊断***。

此外，除了选自由癸酸、果糖、塔格糖、油酸及亚油酸组成的群组中的一者或多者之外，所述试剂盒还可包括关于选自由L-半胱氨酸、山梨醇、尿苷、肌苷、植物半乳糖、乙醇酸、棕榈酸及组氨酸组成的群组中的一者或多者的定量信息，所述L-半胱氨酸、山梨醇、尿苷、肌苷、植物半乳糖、乙醇酸、棕榈酸及组氨酸已经被本发明的发明人最新验证为***的指示代谢物，且因此使得能够对***进行更一致、高度可靠且准确的诊断。

本文中所用的术语“诊断”旨在包括确定实验对象对特定疾病或失调症的易感性，确定实验对象当前是否患有特定疾病或失调症(例如，识别***)，确定具有特定疾病或失调症的实验对象的预后，或治疗量度(therametrics)(例如，监测实验对象的状况以提供关于治疗功效的信息)。

本发明的诊断试剂盒中所包括的定量装置可以是色谱仪/质谱仪。

在本发明中使用的色谱仪包括用于气相色谱、液固色谱(liquid-solidchromatography，LSC)、纸色谱(paper chromatography，PC)、薄层色谱(thin-layerchromatography，TLC)、气固色谱(gas-solid chromatography，GSC)、液液色谱(liquid-liquid chromatography，LLC)、泡沫色谱(foam chromatography，FC)、乳液色谱(emulsionchromatography，EC)、气液色谱(gas-liquid chromatography，GLC)、离子色谱(ionchromatography，IC)、凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography，GFC)或凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)的色谱仪，但本发明并不仅限于此，且可使用所属领域中常用的任何用于定量的色谱仪。优选地，在本发明中使用的色谱仪是气相色谱仪。此外，在本发明中使用的质谱仪是MALDI-TOF MS或TOF MS，更优选地是TOF MS。

本发明的血液代谢物的各组分通过气相色谱分离，并且不仅通过准确的分子量信息、而且通过使用通过Q-TOF MS获得的信息的元素组成对所述各组分进行识别。

根据本发明的示例性实施例，其中选自由癸酸、果糖、塔格糖、L-半胱氨酸、山梨醇、尿苷、肌苷、植物半乳糖及乙醇酸组成的群组中的至少一者的浓度增加的情形指示***，并且其中选自由油酸、亚油酸、棕榈酸及组氨酸组成的群组中的至少一者的浓度降低的情形指示***。

本文中所用的术语“血液代谢物浓度的增加”是指***患者的血液代谢物浓度与健康个体相比可测量地显著增加，优选地增加70％或大于70％，且更优选地增加30％或大于30％。

本文中所用的术语“血液代谢物浓度的降低”是指***患者的血液代谢物浓度与健康个体相比可测量地显著降低，优选地降低40％或大于40％，且更优选地降低20％或大于20％。

根据本发明，与健康个体相比，在***患者中表现出选自由癸酸、果糖、塔格糖、L-半胱氨酸、山梨醇、尿苷、肌苷、植物半乳糖及乙醇酸组成的群组中的至少一者的浓度显著增加，且与健康个体相比，在***患者中表现出选自由油酸、亚油酸、棕榈酸及组氨酸组成的群组中的至少一者的浓度显著降低(见表1)。

本发明还提供一种检测从正常对照获得的血液样本与从***获得的血液样本之间的代谢物差异的方法，所述方法包括：通过依序执行以下过程来分析来自血液的代谢物生物标志：

(1)利用气相色谱/飞行时间质谱(GC/TOF MS)来分析代谢物；

(2)通过对利用气相色谱/飞行时间质谱所识别的所述代谢物进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)来确认代谢物图谱之间的差异；

(3)在通过偏最小二乘判别分析获得的所述代谢物中选择变量投影重要性(VIP)值为1.5或大于1.5的代谢物作为代谢物生物标记候选物，并通过偏最小二乘判别分析的负荷值来确认所述代谢物生物标记候选物的增加或减少；以及

(4)使用受试者操作特性曲线(ROC曲线)验证代谢物生物标记。

将详细描述根据本发明分析两个生物样本群组(即，从***患者获得的血液样本及从正常对照获得的血液样本)之间代谢物差异的方法作为实例。

首先，用100％甲醇提取从正常个体及***患者采集的血液样本，且然后用已知的技术进行衍生化(derivatized)以用于GC/TOF MS中。

使用GC/TOF MS分析血液样本的代谢物的方法包括：使用GC/TOF MS系统分析血液提取物，将分析结果转换成统计学上可处理的值，且然后使用经转换的值以统计方式验证两组生物样本之间代谢物的差异。

将GC/TOF MS结果转换成统计学上可处理的值可为在以单位时间间隔划分总分析时间后，确定代表单位时间的色谱峰的面积或高度的最大值作为所述单位时间的代表值。

根据本发明的一个实施例，作为GC/TOF MS的结果，识别出了104种代谢物，所述104种代谢物可被分类为胺、氨基酸、脂肪酸、有机酸、磷酸酯、糖等，且其中检测到最大量的氨基酸，然后依次是有机酸、脂肪酸、糖、胺、磷酸酯等。

通过将由GC/TOF MS获得的代谢物的强度除以所有已识别代谢物的强度之和，对每种代谢物进行正规化，并对其进行PLS-DA。

创建由代谢物的PLS-DA负荷值及VIP值组成的V图(V-plot)，选择VIP值为1.5或大于1.5的代谢物作为代谢物生物标记候选物，并且确认PLS-DA的负荷值的增加或减少，且就此来说，正的负荷值表示代谢物倾向于增加，且负的负荷值表示代谢物倾向于减少。

可使用通过GC/TOF MS分析的血液样本的代谢物的强度来确认代谢物的增加或减少。

通过ROC曲线验证了代谢物生物标记。

根据本发明的一个实施例，作为用于诊断***的生物标记，可使用选自由癸酸、果糖、塔格糖、油酸、亚油酸、L-半胱氨酸、山梨醇、尿苷、肌苷、植物半乳糖、乙醇酸、棕榈酸及组氨酸组成的群组中的一者或多者。

根据本发明，分析从正常组获得的血液样本与从***患者获得的血液样本之间代谢物差异的方法使得能够对***进行更一致、高度可靠且准确的诊断，并且可应用于治疗剂的研发。

本发明的模式

在下文中，将参照以下实例更详细地描述本发明，但这些实例并不旨在限制本发明的范围。

实例

实例1：使用GC/TOF MS识别代谢物

将***患者组及健康对照各20微升血液与980微升纯甲醇混合，并将混合物离心以提取代谢物。

GC/TOF MS的衍生化过程如下。

将每个所提取的样本在速度袋(speed bag)中进行了干燥，且然后向其中添加了5微升吡啶中40％(w/v)O-甲基羟胺盐酸盐(O-methylhydroxylamine hydrochloride)，以使它们之间在30℃及200转/分钟(rpm)下反应90分钟。然后，向其中添加了45微升的N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide)以使它们之间在37℃及200转/分钟下反应30分钟。

GC/TOF MS的仪器条件如下。

用于分析的柱是RTX-5Sil MS毛细管柱(长为30米、膜厚为0.25毫米且内径为25毫米)，且气相色谱柱(GC column)温度条件如下：首先，将温度保持在50℃下达5分钟，且然后将温度升高到330℃并保持1分钟。以无分流方式(splitless mode)注射每份样本1微升。将传输线(transfer line)温度及离子源温度分别保持在280℃及250℃下。在具有GC/TOF MS结果的库中发现了104种代谢物，并进行了识别(见表1)。

如下表1所示(由使用***患者及健康对照的血液样本分析代谢物而识别的104种代谢物)，当按代谢物组(metabolite group)分类时，存在26％氨基酸、19％有机酸、17％脂肪酸、15％糖、11％胺、5％磷酸酯及7％其他。

[表1]

实例2：使用PLS-DA获得的***患者的血液样本与健康对照的血液样本中代谢物图谱的差异

将根据实例1识别的每种代谢物的强度(intensity)除以所有所识别的代谢物的强度之和，以使每种代谢物正规化。随后，使用SIMCA-P+(版本12.0)对其进行PLS-DA。

如图1所示，确认***患者的血液样本与健康对照的血液样本中代谢物图谱存在明显差异。

表2显示VIP值及负荷值，此表示在PLS-DA模型中使用的104种代谢物对模型的影响程度及方向性。

[表2]

实例3：***患者特异性生物标记代谢物的选择

为了找到在***患者中显示出特异增加或减少的生物标记，获得了影响从实例2获得的每种代谢物的代谢组学图谱差异的VIP值、倍数变化、AUC值及p值。将为1.5或大于1.5的VIP值、为1.2的倍数变化、为0.800或大于0.800的AUC值及小于0.01的p值设定为每种代谢物的参考值，并且13种代谢物表现出对诊断***的适用性(见表3)。此外，按组比较了这些代谢物的绝对强度(见图2)。

下表3显示了被选择作为用于诊断***的潜在生物标记的13种代谢物的VIP值、AUC值、倍数变化(fold change)及p值(BD：***患者；对照：健康个体)。

[表3]

AUC，ROC曲线下的面积；BD，***；VIP，变量投影重要性

实例4：使用PLS-DA验证药物对***患者中代谢物表现出增加或减少是否有影响

为了验证***患者中表现出特异增加或减少的生物标记不受药物影响，使用PLS-DA对每个施药组及未施药组进行了比较，结果发现分离水平(level of separation)不充分且不可再现。根据被施用类固醇、秋水仙碱或硫唑嘌呤的3组中的药物，没有再现性且没有统计学显著差异。

因此，由于在实例3中表现出的***组的代谢物的增加或减少是由于疾病本身引起的变化，因此确认所述代谢物适合作为生物标记(见图3a-c)。

实例5：使用5种代谢物通过血液样本来诊断***的代谢诊断小组的建立

在实例3中所选择的用于诊断***的13种生物标记中，选择在***中表现出特异增加的前3种代谢物(癸酸、果糖及塔格糖)及在***中表现出特异减少的前2种代谢物(油酸及亚油酸)来建立能够诊断***的代谢诊断小组。因此，在主成分分析的基础上，建立了能够基于5种代谢物区别BD与HC的多元分类模型。当使用单轴(即，PC1)时，显示出BD与HC完全区别开，且模型表现出R²X值为0.721且Q²值为0.515，从而显示出***患者与健康对照被适当且可再现地区别开(见图4)。

实例6：通过ROC的模型验证及使用血液样本诊断***的代谢诊断小组的确认集验证

为了检查根据实例5产生的用于使用血液样本诊断***的代谢物生物标记小组是否适合于诊断，在模型中使用每个样本的PC1分数(PC1score)绘制了受试者操作特性(ROC)曲线。结果，所述模型表现出100％的敏感度、97.1％的特异性及0.993的AUC值，此显示出所述模型非常适合用于诊断***(见图5)。此外，为了检查所述小组是否能够使用确认集来预测***的诊断，使用了***患者的10份血液样本及健康对照的10份血液样本，即总共20份样本。结果显示出，所述小组能够准确预测总共20个样本中的19个样本为***患者还是健康对照，此表明具有5种代谢物的生物标记小组也适用于确认集的***诊断(见图6)。