具体实施方式

如本文所用的，包含所附权利要求书在内，词语的单数形式如“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含对应的其复数指代物，除非上下文中清楚地另有指明。

本文引用的所有参考文献均通过引用并入，达到如同明确地且单独地指示每个单独的出版物、专利申请或专利通过引用并入的相同程度。

I.定义.

分子的“活性”可以描述或指代分子与配体或受体的结合、催化活性、刺激基因表达的能力、抗原活性、对其它分子的活性的调节等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞间相互作用的活性(例如粘附)或保持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。“活性”还可以指比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]等。

如本文所用，如本文所用的术语“施用”或“引入”或“提供”是指将组合物递送到个体的一个细胞、多个细胞、组织、组织类器官和/或器官或递送到个体。此类施用或引入可以在体内、体外或离体发生。

如本文所用，术语“抗体”意指包含特异性结合抗原表位的必要可变区序列的分离的或重组的结合剂。因此，抗体是呈现所需生物学活性，例如结合特异性靶抗原的任何形式的抗体或其片段。因此，它在最广泛的意义上使用，并且确切地说涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、纳米抗体、双功能抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，包括(但不限于)scFv、Fab和Fab2，只要它们展现所需的生物活性即可。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；双功能抗体；线性抗体(例如Zapata等人,《蛋白质工程(Protein Eng.)》8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(例如scFv)；及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点；以及残余“Fc”片段，命名反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，所述片段具有两个抗原组合位点并且仍然能够交联抗原。

术语“抗原”是指能够由选择性结合剂例如抗体结合的分子或分子的一部分，以及另外能够用于动物中以产生能够与该抗原的表位结合的抗体的分子或分子的一部分。在某些实施例中，当结合剂(例如，WNT替代分子或其结合区或WNT拮抗剂)在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，所述结合剂被认为特异性结合抗原。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指含有免疫球蛋白重链和/或轻链、或(Nab)的至少一个CDR的多肽片段，其结合到所关注的抗原，特别是结合到一种或多种FZD受体、或结合到LRP5和/或LRP6。在这方面，本文所述的抗体的抗原结合片段可以包含来自结合一种或多种FZD受体或LRP5和/或LRP6的抗体的VH和VL的1、2、3、4、5或所有6个CDR。

如本文所用，术语“生物活性”和“生物学活性”是指归于细胞中的特定生物元件的活性。举例而言，WNT激动剂或其片段或变体的“生物活性”是指模仿或增强WNT信号的能力。作为另一实例，多肽或其功能片段或变体的生物活性是指多肽或其功能片段或其变体执行其天然功能，例如结合、酶活性等的能力。在一些实施例中，功能片段或变体保留相应天然蛋白质或核酸的活性的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。作为第三实例，基因调节元件，例如启动子、增强子、Kozak序列等的生物活性是指调节元件或其功能片段或变体调节，即分别促进、增强或活化其可操作地连接的基因的表达的能力。

如本文所用，术语“双功能抗体”是指包含对一个抗原位点具有特异性的第一臂和对不同抗原位点具有特异性的第二臂的抗体，即双功能抗体具有双特异性。

“双特异性抗体”在本文中用于指通过四源杂交瘤技术(参见Milstein等人,《自然(Nature)》,305(5934):537-540(1983))，通过化学结合两种不同单克隆抗体(参见Staerz等人,《自然》,314(6012):628-631(1985))，或通过旋钮入孔(knob-into-hole)或类似方法产生的全长抗体，所述方法在Fc区中引入突变(参见Holliger等人，《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，90(14)：6444-6448(1993))，产生多种不同的免疫球蛋白物质，其中仅一种为功能双特异性抗体。双特异性抗体在其两个结合臂中的一个(一对HC/LC)上结合一个抗原(或表位)，并且在其第二臂(另一对HC/LC)上结合不同的抗原(或表位)。根据该定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者中)，并且对于它与之结合的每种抗原是一价的。

“包含”意指在例如组合物、方法、试剂盒等中需要所述元件，但可包括其它元件以在权利要求书的范畴内形成例如组合物、方法、试剂盒等。举例而言，“包含”编码可操作地连接到启动子的治疗性多肽的基因的表达卡匣为如下表达卡匣，其除基因和启动子外还可包括其它元件，例如聚腺苷酸化序列、增强子元件、其它基因、连接子结构域等。

“基本上由......组成”意指将例如所描述的组合物、方法、试剂盒等的范围限制于并不实质上影响例如组合物、方法、试剂盒等的基本和新颖特征的指定材料或步骤。举例而言，“基本上由”编码可操作地连接到启动子和聚腺苷酸化序列的治疗性多肽的基因“组成”的表达卡匣可包括额外序列，例如连接子序列，只要其并不实质上影响基因的转录或翻译即可。作为另一实例，“基本上由所述序列组成的”变异或突变多肽片段具有所述序列的氨基酸序列加上或减去基于其衍生的全长天然多肽的序列的边界处的约10个氨基酸残基，例如比所述边界氨基酸残基少10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个残基，或比所述边界氨基酸残基多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基。

“由......组成”意指排除权利要求书中未指定的任何元件、步骤或成分的组合物、方法或试剂盒。举例而言，“由所述序列组成”的多肽或多肽结构域仅含有所述序列。

“控制元件”或“控制序列”是指参与分子相互作用的核苷酸序列，所述核苷酸序列有助于多核苷酸的功能调节，包含多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。所述调节可能影响过程的频率、速度或特异性，并且可能本质上是增强或抑制的。所属领域中已知的控制元件包括例如转录调节序列，如启动子和强化子。启动子是能够在某些条件下与RNA聚合酶结合并且启动通常位于启动子下游(3'方向)的编码区转录的DNA区。

“表位”是抗体识别并结合的抗原上的特异性区，并且也称为“抗原决定子”。表位通常在蛋白质的表面上为5-8个氨基酸长。蛋白质是三维折叠结构，并且表位可以仅以其存在于溶液中的形式或其天然形式来识别。当表位由通过三维结构聚集在一起的氨基酸构成时，表位是构象的或不连续的。如果表位存在于单个多肽链上，则其是连续或线性表位。取决于抗体识别的表位，其可以仅结合蛋白质的片段或变性区段，或者其也可以能够结合天然蛋白质。

识别表位的抗体或其抗体片段的部分被称为“表位结合结构域”或“抗原结合结构域”。抗体或抗体片段的表位或抗原结合结构域在Fab片段中，并且效应子在Fc片段中起作用。六个区段，称为重链和轻链的可变区(V_H和V_L)内的互补决定区(CDR)，从抗体的其余部分的构架(FR区)球状结构环出，并且相互作用以在分子的一端处形成暴露表面。这是抗原结合结构域。一般来讲，4-6个CDR将直接涉及结合抗原，但较少的CDR可以提供主要结合基序。

“表达载体”是一种载体，例如本文讨论的或所属领域已知的质粒、小环、病毒载体、脂质体等，其包含编码所关注的基因产物的区域，并且用于实现基因产物在预期靶细胞中的表达。表达载体还包含与编码区可操作地连接的控制元件，例如启动子、增强子、UTR、miRNA靶向序列等，以促进基因产物在靶标中的表达。控制元件和其可操作地连接以进行表达的一个基因或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中许多是所属领域已知的并可获得的，或者可以容易地由在所属领域可获得的组件建构。

如本文所用，术语“FR组”是指构成重链或轻链V区的CDR组的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠到抗原结合位点中，特别是直接邻近CDR的FR残基。在FR内，某些氨基残基和某些结构特征是极其高度保守的。在这方面，所有V区序列含有约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠到结合位点中时，CDR显示为突出环基序，形成抗原结合表面。一般认为，FR存在保守的结构区，其影响CDR环形状折叠成某些“规范”结构，而与精确的CDR氨基酸序列无关。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链与轻链相互作用的非共价结构域间接触。

术语“个体”，“宿主”，“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，包含(但不限于)人类和非人灵长类动物，包含猿猴和人类；哺乳动物运动动物(如马)；哺乳动物农场动物(如绵羊，山羊等)；哺乳动物宠物(狗，猫等)；和啮齿动物(例如，小鼠，大鼠等)。

“单克隆抗体"是指均质抗体群体，其中单克隆抗体由与表位的选择性结合有关的氨基酸(天然存在和非天然存在)构成。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个表位。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且涵盖它们的片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)，单链(scFv)，它们的变体，包含单克隆抗体的抗原结合片段的融合蛋白，人源化单克隆抗体，嵌合单克隆抗体和包含具有所需的特异性和结合到表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型，包括本文公开的WNT替代分子。。并不打算对抗体的来源或制备抗体的方式作限制(例如通过融合瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)。所述术语包括上文在“抗体”定义下描述的全免疫球蛋白以及片段等。

如本文所用，术语“天然”或“野生型”是指存在于野生型细胞、组织、器官或生物中的核苷酸序列，例如基因或基因产物，例如RNA或蛋白质。如本文所用，术语“变体”是指参考多核苷酸或多肽序列，例如天然多核苷酸或多肽序列的突变体，即与参考多核苷酸或多肽序列具有小于100％的序列一致性。换句话说，变体包含相对于参考多核苷酸序列，例如天然多核苷酸或多肽序列的至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)。举例而言，变体可以是与全长天然多核苷酸序列具有50％或更多、60％或更多、或70％或更多的序列一致性的多核苷酸，例如与全长天然多核苷酸序列具有75％或80％或更大，例如85％、90％或95％或更大，例如98％或99％的一致性。作为另一实例，变体可以是与全长天然多肽序列具有70％或更多的序列一致性的多肽，例如与全长天然多肽序列具有75％或80％或更大的一致性，例如85％、90％或95％或更大，例如98％或99％一致性。变体还可包括参考序列，例如天然序列的变体片段，所述变体片段与参考序列，例如天然序列的片段共享70％或更大的序列一致性，例如与天然序列共享75％或80％或更大的一致性，例如85％、90％或95％或更大，例如98％或99％一致性。

“可操作地连接(operatively linked或operably linked)”是指基因元件的并置，其中所述元件处于允许其以预期方式操作的关系中。例如，如果启动子帮助启动对编码序列进行转录，则启动子与编码区域操作性地连接。只要保持这种功能关系，在启动子和编码区之间就可能存在间插残基。

如本文所使用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物。术语还涵盖已经改性的氨基酸聚合物：例如包括双硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记组分结合。

术语“多核苷酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以包括经过修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可以间杂有非核苷酸组分。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。如本文中所使用的术语多核苷酸可互换地指双股和单股分子。除非另外说明或需要，否则本文中所描述的本发明的任何实施例(其是多核苷酸)涵盖双股形式和已知或预测组成双股形式的两个互补单股形式中的每一种。

多核苷酸或多肽与另一种多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列一致性”，这意味着当比对时，碱基或氨基酸的百分比在与两种序列比较时是相同的。序列相似性可以以多种不同方式确定。为了确定序列一致性，可以使用包括可通过万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得的BLAST的方法和计算机程序对序列进行比对。另一种比对算法是FASTA，在美国威斯康辛州麦迪逊的Genetics Computing Group(GCG)程序包中获得，所述公司是牛津分子集团有限公司(Oxford Molecular Group，Inc.)的全资子公司。用于比对的其它技术描述于Enzymology，第266卷：用于大分子序列分析的计算机方法(Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis)(1996)，编辑Dolittle，学术出版社(AcademicPress,Inc.)，美国加利福利亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.，USA)的Harcourt Brace&Co.的子公司。特别感兴趣的是允许序列中存在间隙的比对程序。Smith-Waterman是一种允许序列比对中存在间隙的算法类型。参见《分子生物学方法(Meth.Mol.Biol.)》70:173-187(1997)。此外，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可以用于比对序列。参见《分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)》48:443-453(1970)。

有趣的是使用Smith和Waterman的本地同源算法以确定序列一致性的BestFit程序(《应用数学进展(Advances in Applied Mathematics)》2：482-489(1981)。间隙产生罚分一般在1到5之间，通常为2到4，并且在许多实施例中将是3。间隙延伸罚分一般在约0.01到0.20范围内，并且在许多情况下为0.10。所述程序具有由输入以进行比较的序列确定的默认参数。优选地，使用由程序确定的默认参数来确定序列一致性。该程序也可从美国威斯康辛州麦迪逊市的Genetics Computing Group(GCG)程序包获得。

另一个感兴趣的程序是FastDB算法。FastDB描述于序列比较和分析中的现行方法(Current Methods in Sequence Comparison and Analysis)，大分子测序和合成(Macromolecule Sequencing and Synthesis)，选定方法和应用(Selected Methods andApplications)，第127-149页，1988，Alan R.Liss公司。序列一致性百分比由FastDB根据以下参数计算：不匹配罚分：1.00；间隙罚分：1.00；间隙大小罚分：0.33；和合并罚分：30.0.

如本文所用，“启动子”涵盖指导RNA聚合酶的结合并且由此促进RNA合成的DNA序列，即足以引导转录的最小序列。启动子和对应的蛋白质或多肽表达可为普遍存在的，意指广泛范围的细胞、组织和物种的强活性或细胞类型特异性、组织特异性或物种特异性。启动子可为“组成型”，意指持续活性，或“诱导型”，意指启动子可通过生物或非生物因子的存在或不存在活化或去活。本发明的核酸构建体或载体中还包括可与启动子序列邻接或不邻接的增强子序列。增强子序列影响启动子依赖性基因表达且可位于天然基因的5'或3'区域。

如应用于多核苷酸的“重组”是指多核苷酸是克隆、限制或连接步骤的各种组合的产物，以及产生不同于在自然界中发现的多核苷酸的构建体的其它程序。

如本文所用，“RNA干扰”是指通过内源性基因沉默路径(例如，Dicer和RNA诱导的沉默复合物(RISC))降解靶mRNA来减少靶基因表达的试剂的使用。RNA干扰可以使用各种试剂来实现，包括shRNA和siRNA。“短发夹RNA”或“shRNA”是指具有发夹转弯的双股人造RNA分子，其可用于经由RNA干扰(RNAi)沉默靶基因表达。shRNA在细胞中的表达通常通过质粒的递送或通过病毒或细菌载体来实现。shRNA是RNAi的有利介体，因为它具有相对较低的降解率和周转率。小干扰RNA(siRNA)是一类双股RNA分子，通常长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，并且在RNA干扰(RNAi)路径内操作。它通过在转录后降解mRNA来干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达，从而防止翻译。在某些实施例中，siRNA长度为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸，并且在其3'末端具有2个碱基悬垂。siRNA可以引入单个细胞和/或培养系统，并且导致靶mRNA序列的降解。如本文所用，“吗啉代”是指经修饰的核酸寡聚物，其中标准核酸碱基与吗啉环结合并且通过二氨基磷酸酯键连接。类似于siRNA和shRNA，吗啉代与互补mRNA序列结合。然而，吗啉代通过mRNA翻译的立体抑制和mRNA剪接的改变而非靶向互补mRNA序列进行降解而起作用。

术语“治疗(treatment、treating)”等在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果在完全或部分地预防疾病或其症状方面可以是预防性的，例如降低个体体内发生疾病或其症状的可能性，和/或在部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的副作用方面可以是治疗性的。如本文所使用的“治疗”覆盖哺乳动物的疾病的任何治疗，且包括：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未诊断患有所述疾病的个体中发生；(b)抑制疾病，即，遏制其发展；或(c)缓解疾病，即，使疾病消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。发展中的疾病的治疗为备受关注的，其中治疗稳定或减少患者的非所需临床症状。期望在受影响组织的功能完全丧失之前执行这种治疗。期望在疾病的有症状的阶段期间并且在一些情况下在疾病的有症状的阶段之后施用主题疗法。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用细胞生物学、分子生物学技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在所属领域的技术人员的范围内。这类技术在例如以下文献中充分解释：“《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》”，第二版(Sambrook等人，1989)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait编，1984)；“《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》”(R.I.Freshney编，1987)；“《酶学方法(Methods inEnzymology)”(学术出版社(Academic Press,Inc.))；“《实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)》”(D.M.Weir&C.C.Blackwell编)；“《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》”(J.M.Miller&M.P.Calos编，1987)；“《分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》”(F.M.Ausubel等人编，1987)；“《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase ChainReaction)》”，(Mullis等人编，1994)；和“《免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)》”(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献各自以引用的方式明确并入本文。

以下参照用于说明目的的实例应用来描述本发明的若干方面。应理解，给出的许多具体细节、关系及方法提供了对本发明的完整理解。然而，相关领域的普通技术人员将易于认识到，本发明可以不遵照所述具体细节中的一或多个实施，或者用其它方法实施。本发明不受动作或事件的说明次序限制，因为一些动作可以与其它动作或事件按不同次序发生和/或同时发生。此外，根据本发明方法的实施不需要所有所说明的动作或事件。

本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不意欲限制本发明。如本文所使用，除非上下文另外明确指示，单数形式“一(a、an)”以及“所述”意欲还包括复数形式。此外，就具体实施方式和/或权利要求书中使用术语“包括(including、includes)”、“具有(has、with)”或其变化形式的程度而言，此类术语意欲以类似于术语“包含”的方式是包含性的。

术语“约”或“大约”意指在如由所属领域的一般技术人员测定的具体值的可接受的偏差范围内，其将部分取决于所述值如何测量或测定，即，测量系统的限制。举例而言，根据所属领域中的实践，“约”可意指在1或大于1个标准差内。替代地，“约”可意指至多给定值的20％，优选至多10％，更优选至多5％，且更优选仍至多1％的范围。替代性地，特别是对于生物系统或过程，术语可以表示处于一个数量级内，优选地在值的5倍内，并且更优选地在2倍内。在申请案和权利要求中描述具体值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指处于具体值的可接受误差范围内。

本文中提及的所有公开案均以引用的方式并入本文中，从而公开和描述与所列公开案相关的方法和/或材料。应了解，在存在抵触的范围内，本公开取代了合并的出版物的任何公开。

应进一步注意，权利要求书可经起草而排除任何任选的元件。因而，本陈述意图与对所主张元件的引述结合而充当使用如“仅仅(solely)”、“仅(only)”等排他性术语或使用“负性”限制的前提基础。

除非另外指明，否则本文使用的所有术语的含义与它们对所属领域技术人员所具有的含义相同，并且本发明的实践将采用在所属领域技术人员的知识范围内的微生物学和重组DNA技术的常规技术。

II.概述.

本发明提供调节WNT信号以改善包括(但不限于)炎性肠病的胃肠道病症的方法，所述炎性肠病包括(但不限于)克罗恩氏病、伴有瘘管形成的克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。特别地，本发明提供了WNT/β-连环蛋白信号传导激动剂，其用于增强由于由于这些病症的损伤而导致的肠上皮的再生。

WNT(“无翼相关整合位点”或“无翼和Int-1”或“无翼-Int”)配体及其信号在控制许多重要器官和组织的发育、稳态和再生中起关键作用，包括骨、肝、皮肤、胃、肠、肾脏、中枢神经系统、乳腺、味蕾、卵巢、耳蜗、肺以及许多其它组织(由Clevers、Loh和Nusse，2014；346:1248012综述)。对WNT信号传导路径的调节具有治疗退行性疾病和组织损伤的潜力。

调节WNT信号传导作为治疗的挑战之一是存在多个WNT配体和WNT受体，即卷曲受体1-10(FZD 1-10)，其中许多组织表达多个和重叠的FZD。典型WNT信号除了涉及FZD之外，还涉及作为共受体的低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)或低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白6(LRP6)，其在各种组织中广泛表达。

R-脊椎蛋白(R-spondin)1-4是扩增WNT信号的配体家族。每个R-脊椎蛋白通过受体复合物起作用，所述受体复合物一端含有锌和环指3(ZNRF3)或环指蛋白43(RNF43)，并且另一端含有含富亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体4-6(LGR4-6)(例如由Knight和Hankenson 2014，基质生物学(Matrix Biology)；37：157-161综述)。R-脊椎蛋白也可通过其它作用机制发挥作用。ZNRF3和RNF43是两种膜结合的E3连接酶，专门靶向WNT受体(FZD1-10和LRP5或LRP6)进行降解。R-脊椎蛋白与ZNRF3/RNF43和LGR4-6的结合引起三元复合物的清除或螯合，其从WNT受体去除E3连接酶并稳定WNT受体，导致WNT信号增强。每种R-脊椎蛋白含有两个弗林蛋白酶(Furin)结构域(1和2)，其中弗林蛋白酶结构域1与ZNRF3/RNF43结合，并且弗林蛋白酶结构域2与LGR4-6结合。含有弗林蛋白酶结构域1和2的R-脊椎蛋白的片段足以扩增WNT信号传导。虽然R-脊椎蛋白效应取决于WNT信号，但由于LGR4-6和ZNRF3/RNF43均在各种组织中广泛表达，R-脊椎蛋白的效应不是组织特异性的。

通过RSPO或通过WNT激动剂活化WNT信号传导可用于胃肠道病症的治疗。文献中的先前研究工作表明RSPO可用于实验性结肠结肠炎的治疗(J.Zhao等人，2007)。WNT激动剂分子也可以用于胃肠道病症的治疗。特别地，活性WNT信号传导可以提供主要干细胞维持信号，并且在调节稳态和损伤中的肠上皮再生中发挥关键作用。吸收性和分泌性的两种肠道上皮谱系限定了肠道器官的两种主要功能：分泌性细胞分泌激素，并且主要通过粘液和抗微生物肽的分泌来提供针对食源性微生物、毒素和抗原的重要屏障。相比之下，吸收性细胞进行饮食营养素的摄取，因为它们主要定位在小肠中的绒毛尖端或结肠隐窝的顶部，因此构成肠表面区域的大部分的腔细胞(参见例如Santos等人(2018)印刷中的《细胞生物学趋势(Trends in Cell Biol.)》，https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.08.001)。在稳态条件下，肠上皮中的所有细胞在3-10天内再生。

不同的小生境因子维持ISC活性，并且独特的非上皮和/或上皮细胞精心制作了构成细胞小生境的各种信号。此类小生境因子包括规范信号，例如WNT、R-spondin、切口和骨形态生成蛋白(BMP)，但也包括炎性和饮食影响。在损伤后，ISC小生境适应超越其稳态以解释致病刺激并且将其转化为上皮再生。这种再生由存活的Lgr5+ISC或其它可以转换回到Lgr5+ISC以帮助上皮再生的如肠细胞、肠内分泌细胞或潘氏(Paneth)细胞的成熟细胞类型介导(Beumer和Clevers(2016)，《发育(Development)》143：3639-3649)。

肠隐窝底部的肠干细胞(ISC)，也称为柱状基底细胞(CBC)，插入有分泌WNT的潘氏细胞(Cheng和Leblond(1974)《美国神经放射性杂志(Am.J.Anat.)》141：537-561)。围绕肠上皮的间充质细胞也分泌一些WNT蛋白，在体内提供重叠的干细胞小生境功能(Farin等人(2012)《胃肠病学(Gastroenterol)》.143：1518-1529)。在WNT信号传导的存在下，ISC分裂以产生自更新干细胞并分化子细胞，所述子细胞首先经历几个快速转运扩增(TA)分裂，然后分化为功能性细胞类型。肠隐窝+4细胞中还存在静止干细胞群体，当CBC受损时，其可促成上皮再生(Tian等人(2011)《自然(Nature)》478：255-259)。当TA细胞沿着隐窝-绒毛轴迁移出，远离产生WNT的细胞时，发生个体谱系提交和末端分化。

在一些实施例中，WNT/β-连环蛋白信号传导激动剂可以包括结合一种或多种FZD受体并抑制或增强WNT信号传导的结合剂或表位结合结构域。在某些实施例中，药剂或抗体特异性结合到与之结合的一种或多种人卷曲受体内的富含半胱氨酸结构域(CRD)。另外，还可以使用含有针对LRP的表位结合结构域的结合剂。在一些实施例中，WNT/β-连环蛋白激动剂具有结合E3连接酶ZNRF3/RNF43的结合剂或表位结合结构域。E3连接酶激动剂抗体或其片段可以是单一分子或与其它例如FZD受体拮抗剂、LRP受体拮抗剂等WNT拮抗剂组合。

如所属领域中众所周知，抗体为能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区上的表位结合结构域特异性结合于靶向物，如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用，所述术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其含有表位结合结构域的片段(例如，dAb、Fab、Fab'、(F(ab')₂、Fv、单链(scFv)、(Nabs；也称为sdAbs或VHH结构域)、DVD-Igs、其合成变体、天然存在的变体、包含表位结合结构域的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体和包含具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。“双功能抗体”是通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等人，《美国科学院院刊》90 6444-6448，1993)，其也是本文涵盖的特定形式抗体。本文还包括包含与CH3结构域接合的scFv的微型抗体(S.Hu等人，《癌症研究(Cancer Res.)》，56，3055-3061，1996)。参见例如Ward,E.S.等人，《自然》341，544-546(1989)；Bird等人，《科学(Science)》，242，423-426，1988；Huston等人，《美国科学院院刊(PNAS USA)》，85，5879-5883，1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P.Holliger等人，《美国科学院院刊》90 6444-6448，1993；Y.Reiter等人，《自然生物技术(Nature Biotech)》，14，1239-1245，1996；S.Hu等人，《癌症研究》，56，3055-3061，1996。

蛋白水解酶番木瓜酶优先使IgG分子裂解以产生若干片段，其中两者(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。酶胃蛋白酶能够使IgG分子裂解以提供若干片段，包括F(ab')2片段，其包含两个抗原结合位点。根据本公开的某些实施例的Fv片段可以通过IgM，并且在罕见情况下通过IgG或IgA免疫球蛋白分子的优先蛋白水解裂解产生。然而，更通常地使用所属领域中已知的重组技术衍生Fv片段。Fv片段包括非共价VH::VL异二聚体，所述非共价VH::VL异二聚体包括保留天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点。Inbar等人(1972)《美国科学院院刊》69:2659-2662；Hochman等人(1976)《生物化学(Biochem)》15:2706-2710；和Ehrlich等人(1980)《生物化学》19:4091-4096。

在某些实施例中，涵盖了单链Fv或scFV抗体。例如，Kappa抗体(Ill等人，《蛋白质工程(Prot.Eng.)》10：949-57(1997))；微型抗体(Martin等人，《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)》13：5305-9(1994))；双功能抗体(Holliger等人，《美国科学院院刊》90：6444-8(1993))；或Janusins(Trautecker等人，《欧洲分子生物学学会杂志》10：3655-59(1991)和Trautecker等人，《国际癌症杂志增刊(Int.J.Cancer Suppl.)》7：51-52(1992))可以使用标准分子生物学技术按照在本申请案关于选择具有所需特异性的抗体的教示来制备。在其它实施例中，可以制备涵盖本公开的配体的双特异性或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可以包含来自不同抗体的CDR和构架区，而可以生成通过一个结合结构域特异性结合到一个或多个FZD受体并通过第二结合结构域特异性结合到第二分子的双特异性抗体。这些抗体可以通过重组分子生物学技术产生或可以物理方式结合在一起。

单链Fv(scFv)多肽是由基因融合物表达的共价连接的VH：VL异二聚体，所述基因融合物包括通过肽编码连接子连接的VH-和VL-编码基因。Huston等人(1988)《美国科学院院刊》85(16):5879-5883。已经描述了许多方法，以辨别用于将抗体V区的天然聚集但化学上分离的轻链和重链多肽链转换为scFv分子的化学结构，所述scFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构大体上相似的三维结构。参见例如颁予Huston等人的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号；和颁予Ladner等人的美国专利第4,946,778号。

在某些实施例中，如本文所述的抗体呈双功能抗体的形式。双功能抗体是多肽的多聚体，每种多肽包括包含免疫球蛋白轻链的结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白重链的结合区的第二结构域，所述两个结构域被连接(例如，通过肽连接子连接)但无法彼此缔合形成抗原结合位点：抗原结合位点通过所述多聚体内一种多肽的第一结构域与所述多聚体内另一种多肽的第二结构域的缔合而形成(WO94/13804)。

抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward,E.S.等人，《自然》341，544-546(1989))。

在使用双特异性抗体时，这些可以是常规双特异性抗体，其可以各种方式制造(Holliger,P.和Winter G.，《生物技术新观点(Current Opinion Biotechnol.)》4，446-449(1993))，例如以化学方式或由杂交瘤制备，或可以是上文提及的任何双特异性抗体片段。双功能抗体和scFv能够在没有Fc区的情况下仅使用可变结构域构建而成，潜在地减少了抗个体基因型反应的影响。

相对于双特异性全抗体，双特异性双功能抗体也可能是特别有用的，因为它们可以容易地在大肠杆菌中构建和表达。可以使用噬菌体呈现(WO94/13804)从文库容易地选择具有适当结合特异性的双功能抗体(和许多其它多肽，如抗体片段)。如果双功能抗体的一个臂欲保持恒定，例如具有针对抗原X的特异性，则能够制备文库，其中另一臂被改变且选择具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可以通过旋钮入孔工程化来制备(J.B.Ridgeway等人，《蛋白质工程(Protein Eng.)》，9，616-621(1996))。

在某些实施例中，本文所述的抗体可以的形式提供。是去除铰链区的IgG4抗体(参见荷兰乌得勒支(Utrecht,The Netherlands)GenMab；还参见例如US20090226421)。这种专有的抗体技术产生稳定较小抗体型式，其治疗窗比当前小抗体型式预期更长。IgG4抗体被认为是惰性的，因此不与免疫系统相互作用。可以通过消除抗体的铰链区来修饰完全人IgG4抗体，以获得相对于对应的完整IgG4(乌得勒支GenMab)具有独特稳定性特性的半分子片段。使IgG4分子减半在上仅留下一个可结合到同源抗原(例如，疾病靶标)的区域，因此仅与靶细胞上的一个位点单价结合。

在某些实施例中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包括重链和轻链CDR组，所述重链和轻链CDR组分别插入为CDR提供支持并且限定CDR相对于彼此的空间关系的重链和轻链构架区(FR)组之间。如本文所用，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区域

分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。包含单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中称为“分子识别单元”。对许多抗原-抗体复合物的结晶分析已证实CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。

如本文所用，术语“FR组”是指构成重链或轻链V区的CDR组的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠到抗原结合位点中，特别是直接邻近CDR的FR残基。在FR内，某些氨基残基和某些结构特征是极其高度保守的。在这方面，所有V区序列含有约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠到结合位点中时，CDR显示为突出环基序，形成抗原结合表面。一般认为，FR存在保守的结构区，其影响CDR环形状折叠成某些“规范”结构，而与精确的CDR氨基酸序列无关。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链与轻链相互作用的非共价结构域间接触。

“单克隆抗体"是指均质抗体群体，其中单克隆抗体由与表位的选择性结合有关的氨基酸(天然存在和非天然存在)构成。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个表位。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且涵盖它们的片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)，单链(scFv)，它们的变体，包含单克隆抗体的抗原结合片段的融合蛋白，人源化单克隆抗体，嵌合单克隆抗体和包含具有所需的特异性和结合到表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型，包括本文公开的WNT替代分子。。并不打算对抗体的来源或制备抗体的方式作限制(例如通过融合瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)。所述术语包括上文在“抗体”定义下描述的全免疫球蛋白以及片段等。

蛋白水解酶番木瓜酶优先使IgG分子裂解以产生若干片段，其中两者(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。酶胃蛋白酶能够使IgG分子裂解以提供若干片段，包括F(ab')2片段，其包含两个抗原结合位点。根据本公开的某些实施例的Fv片段可以通过IgM，并且在罕见情况下通过IgG或IgA免疫球蛋白分子的优先蛋白水解裂解产生。然而，更通常地使用所属领域中已知的重组技术衍生Fv片段。Fv片段包括非共价VH::VL异二聚体，所述非共价VH::VL异二聚体包括保留天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点。Inbar等人(1972)《美国科学院院刊》69:2659-2662；Hochman等人(1976)《生物化学(Biochem)》15:2706-2710；和Ehrlich等人(1980)《生物化学》19:4091-4096。

在某些实施例中，涵盖了单链Fv或scFV抗体。例如，Kappa抗体(Ill等人，《蛋白质工程(Prot.Eng.)》10：949-57(1997))；微型抗体(Martin等人，《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)》13：5305-9(1994))；双功能抗体(Holliger等人，《美国科学院院刊》90：6444-8(1993))；或Janusins(Trautecker等人，《欧洲分子生物学学会杂志》10：3655-59(1991)和Trautecker等人，《国际癌症杂志增刊(Int.J.Cancer Suppl.)》7：51-52(1992))可以使用标准分子生物学技术按照在本申请案关于选择具有所需特异性的抗体的教示来制备。在其它实施例中，可以制备涵盖本公开的配体的双特异性或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可以包含来自不同抗体的CDR和构架区，而可以生成通过一个

结合结构域特异性结合到一个或多个FZD受体并通过第二结合结构域特异性结合到第二分子的双特异性抗体。这些抗体可以通过重组分子生物学技术产生或可以物理方式结合在一起。

单链Fv(scFv)多肽是由基因融合物表达的共价连接的VH：VL异二聚体，所述基因融合物包括

通过肽编码连接子连接的VH-和VL-编码基因。Huston等人(1988)《美国科学院院刊》85(16):5879-5883。已经描述了许多方法，以辨别用于将抗体V区的天然聚集但化学上分离的轻链和重链多肽链转换为scFv分子的化学结构，所述scFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构大体上相似的三维结构。参见例如颁予Huston等人的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号；和颁予Ladner等人的美国专利第4,946,778号。

在某些实施例中，如本文所述的抗体呈双功能抗体的形式。双功能抗体是多肽的多聚体，每种多肽包括包含免疫球蛋白轻链的结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白重链的结合区的第二结构域，所述两个结构域被连接(例如，通过肽连接子连接)但无法彼此缔合形成抗原结合位点：抗原结合位点通过所述多聚体内一种多肽的第一结构域与所述多聚体内另一种多肽的第二结构域的缔合而形成(WO94/13804)。

抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward,E.S.等人，《自然》341，544-546(1989))。当使用双特异性抗体时，这些可以是常规双特异性抗体，其可以多种

方式制造(Holliger，P.和Winter G.，《生物技术新观点(Current OpinionBiotechnol.)》4，446-449(1993))，例如化学制备或由杂交瘤制备，或可以是上文提及的任何双特异性抗体片段。双功能抗体和scFv能够在没有Fc区的情况下仅使用可变结构域构建而成，潜在地减少了抗个体基因型反应的影响。

相对于双特异性全抗体，双特异性双功能抗体也可能是特别有用的，因为它们可以容易地在大肠杆菌中构建和表达。可以使用噬菌体呈现(WO94/13804)从文库容易地选择具有适当结合特异性的双功能抗体(和许多其它多肽，如抗体片段)。如果双功能抗体的一个臂欲保持恒定，例如具有针对抗原X的特异性，则能够制备文库，其中另一臂被改变且选择具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可以通过旋钮入孔工程化来制备(J.B.Ridgeway等人，《蛋白质工程(Protein Eng.)》，9，616-621(1996))。

在某些实施例中，本文所述的抗体可以的形式提供。是去除铰链区的IgG4抗体(参见荷兰乌得勒支(Utrecht,The Netherlands)GenMab；还参见例如US20090226421)。这种专有的抗体技术产生稳定较小抗体型式，其治疗窗比当前小抗体型式预期更长。IgG4抗体被认为是惰性的，因此不与免疫系统相互作用。可以通过消除抗体的铰链区来修饰完全人IgG4抗体，以获得相对于对应的完整IgG4(乌得勒支GenMab)具有独特稳定性特性的半分子片段。使IgG4分子减半在上仅留下一个可结合到同源抗原(例如，疾病靶标)的区域，因此仅与靶细胞上的一个位点单价结合。

在某些实施例中，本公开的抗体可以采用单个结构域(sdAb)或VHH抗体片段(也称为)的形式。sdAb或VHH技术最初是在发现和鉴定骆驼科动物(例如骆驼和羊驼)具有仅由重链组成并因此缺乏轻链的完全功能性抗体之后开发的。这些仅重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2，CH3)。克隆和分离的单个可变结构域具有完全抗原结合能力并且是非常稳定的。这些具有其独特结构和功能特性的单个可变结构域构成的基础。sdAb或VHH由单一基因编码，并且在几乎所有原核和真核宿主中有效地产生，例如大肠杆菌(参见例如美国专利第6,765,087号)、霉菌(例如，曲霉或木霉)和酵母(例如，酵母(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母(Kluyvermyces)、汉逊酵母(Hansenula)或毕赤酵母(Pichia))(参见例如，美国专利第6,838,254号)。生产过程是可扩展的，并且已经生产了数公斤量的sdAb或VHH可配制为具有较长保质期的即用型溶液。方法(参见例如WO06/079372)是基于B细胞的自动高通量选择的针对所需靶标产生的专用方法。sdAb或VHH是仅骆驼科特异性重链抗体的单结构域抗原结合片段。

设想的另一个抗体片段是双变体结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)是将两种单克隆抗体的功能和特异性在一个分子实体中组合的工程化蛋白质。DVD-Ig被设计为IgG样分子，不同之处在于每条轻链和重链含有通过短肽键串联的两个可变结构域，而不是IgG中的一个可变结构域。两个可变结构域的融合取向和连接子序列的选择对于分子的功能活性和有效表达至关重要。DVD-Ig可以由常规哺乳动物表达系统产生为用于制造和纯化的单一物质。DVD-Ig具有亲本抗体的特异性，在体内稳定，并且表现出IgG样物理化学和药代动力学特性。DVD-Ig及其制备方法描述于Wu,C.等人，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》，25:1290-1297(2007))中。

在某些实施例中，如本文所公开的抗体或其抗原结合片段是人源化的。这是指一般使用重组技术制备的嵌合分子，所述嵌合分子具有衍生自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或仅包含移植到可变结构域中的适当构架区上的CDR。表位结合位点可以是野生型的或由一个或多个氨基酸取代修饰。这消除了恒定区作为人类个体中的免疫原，但对外来可变区的免疫反应的可能性仍然存在(LoBuglio,A.F.等人，(1989)《美国科学院院刊》86:4220-4224；Queen等人，PNAS(1988)86:10029-10033；Riechmann等人，《自然》(1988)332：323-327)。用于

本文公开的抗FZD或LRP抗体的人源化的说明性方法包括美国专利第7,462,697号中所述的方法。

另一种方法不仅专注于提供人类衍生的恒定区，而且还修饰可变区，以便尽可能将它们重塑为人类形式。已知重链和轻链的可变区都含有三个互补决定区(CDR)，其响应于所讨论的表位而变化并且确定结合能力，侧接有给定物种中相对保守并且推定为CDR提供支架的四个框架区(FR)。当关于特定表位制备非人抗体时，可变区可以通过在待修饰的人抗体中存在的FR上移植衍生自非人抗体的CDR而“重塑”或“人源化”。已经报道了将该方法应用于各种抗体：Sato,K.等人，(1993)《癌症研究》53：851-856；Riechmann,L.等人，(1988)《自然》332：323-327；Verhoeyen,M.等人，(1988)《科学》239：1534-1536；Kettleborough,C.A.等人，(1991)《蛋白质工程》4：773-3783；Maeda,H.等人，(1991)《人抗体杂交瘤(HumanAntibodies Hybridoma)》2：124-134；Gorman,S.D.等人，(1991)《美国科学院院刊》88：4181-4185；Tempest,P.R.等人，(1991)《生物技术(Bio/Technology)》9：266-271；Co,M.S.等人，(1991)《美国科学院院刊》88：2869-2873；Carter,P.等人，(1992)《美国科学院院刊》89：4285-4289；和Co,M.S.等人，(1992)《免疫学杂志(J Immunol)》148：1149-1154。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施例中，人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，也称为“衍生自”原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。

在某些实施例中，本公开的抗体可以是嵌合抗体。在这方面，嵌合抗体由可操作地连接或以其它方式融合到不同抗体的异源Fc部分的抗体的抗原结合片段构成。在某些实施例中，异源Fc结构域具有人来源。在其它实施例中，异源Fc结构域可以来自与亲本抗体不同的Ig类别，包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。在另外的实施例中，异源Fc结构域可以由来自一种或多种不同Ig类别的CH2和CH3结构域构成。如上文关于人源化抗体所述，嵌合抗体的抗原结合片段可以仅包含本文所述的抗体的一个或多个CDR(例如，本文所述的抗体的1、2、3、4、5或6个CDR)，或者可以包含整个可变结构域(VL、VH或两者)。

免疫球蛋白CDR和可变结构域的结构和位置可以通过参考以下来确定：Kabat,E.A.等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.)》第4版。美国卫生和公众服务部(US Department of Health and HumanServices)，1987年，及其更新版，现已在互联网上获得(immuno.bme.nwu.edu)。

在一些实施例中，WNT替代分子包含一个或多个Fab或其抗原结合片段和一个或多个VHH或sdAb或其抗原结合片段(或替代地，一个或多个scFv或其抗原结合片段)。在某些实施例中，Fab特异性结合一种或多种Fzd受体，并且VHH或sdAb(或scFv)特异性结合LRP5和/或LRP6。在某些实施例中，Fab特异性结合LRP5和/或LRP6，并且VHH或sdAb(或scFv)特异性结合一种或多种Fzd受体。在某些实施例中，VHH或sdAb(或scFv)融合到Fab的N末端，而在一些实施例中，VHH或sdAb(或scFv)融合到Fab的C末端。在特定实施例中，Fab以完整IgG形式存在，并且VHH或sdAb(或scFv)融合到IgG轻链的N末端和/或C末端。在特定实施例中，Fab以完整IgG形式存在，并且VHH或sdAb(或scFv)融合到IgG重链的N末端和/或C末端。在特定实施例中，两个或更多个VHH或sdAb(或scFv)以这些位置的任何组合融合到IgG。

Fab可以例如使用基因工程改造转换为包括Fab和Fc片段两者的完整IgG形式，产生包含与Fc区融合的Fab的融合多肽，即Fab以完整IgG形式存在。用于完全IgG形式的Fc区可以源自各种不同Fc中的任一种，包括但不限于野生型或经修饰的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其它同种型，例如野生型或经修饰的人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、人IgG4Pro(包含阻止IgG4半分子形成的核心铰链区突变)、人IgA、人IgE、人IgM或被称作IgG1 LALAPG的经修饰的IgG1。L235A、P329G(LALA-PG)变体已显示消除了鼠类IgG2a和人IgG1中的补体结合和固定以及以及Fc-γ依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。这些LALA-PG取代允许更准确翻译小鼠和灵长类动物之间“无效应”抗体构架支架生成的结果。在本文公开的任何IgG的特定实施例中，IgG包含以下氨基酸取代中的一种或多种：N297G、N297A、N297E、L234A、L235A或P236G。

本发明提供了针对一种或多种Fzd受体和LRP5和/或LRP6为二价的二价和双特异性WNT替代分子的非限制性实例。VHH或sdAb(或scFv)可与两条轻链的N末端融合，与两条重链的N末端融合，与两条轻链的C末端融合，或与两条重链的C末端融合。还进一步涵盖例如VHH或sdAb(或scFv)可与重链和/或轻链的N末端和C末端两者融合，与轻链和重链的N末端融合，与重链和轻链的C末端融合，与重链的N末端和轻链的C末端融合或与重链的C末端和轻链的N末端融合。在其它相关实施例中，两个或更多个VHH或sdAb(或scFv)可任选地经由接头部分融合在一起，并且在这些位置中的一个或多个处融合到Fab或IgG。在一个相关实施例中，WNT替代分子具有异源IgG形式，而Fab作为半抗体存在，并且一个或多个VHH或sdAb(或scFv)融合到Fc的一个或多个N末端、Fab的N末端、Fc的C末端或Fab的C末端。在某些实施例中，Fab或其抗原结合片段(或IgG)直接融合到VHH或sdAb(或scFv)或其抗原结合片段，而在其它实施例中，结合区经由接头部分融合。

在多个实施例中，WNT替代分子包含结合一个或多个FZD受体的一个或多个Fab或其抗原结合片段，以及结合LRP5和/或LRP6的一个或多个Fab或其抗原结合片段。在某些实施例中，其包含结合一个或多个FZD受体的两个Fab或其抗原结合片段和/或结合LRP5和/或LRP6的两个Fab或其抗原结合片段。在特定实施例中，一个或多个Fab以完整IgG形式存在，并且在某些实施例中，两个Fab以完整IgG形式存在。在某些实施例中，完整IgG形式的Fab特异性结合一种或多种FZD受体，并且另一Fab特异性结合LRP5和/或LRP6。在某些实施例中，Fab特异性结合一种或多种FZD受体，并且完整IgG形式的Fab特异性结合LRP5和/或LRP6。在某些实施例中，Fab特异性结合LRP5和/或LRP6，并且完整IgG形式的Fab特异性结合一种或多种FZD受体。在某些实施例中，Fab任选地经由接头融合到IgG的N末端，例如重链或轻链N末端。在某些实施例中，Fab融合到IgG的重链的N末端，而不融合到轻链。在特定实施例中，两条重链可以直接或通过接头融合在一起。相对于两受体的此类双特异性和二价的实例展示在图1B顶部。在其它相关实施例中，两个或更多个VHH或sdAb可任选地经由接头部分融合在一起，并且在这些位置中的一个或多个处融合到Fab或IgG。在相关实施例中，WNT替代分子具有异源IgG形式，而Fab之一作为半抗体存在，另一Fab融合到Fc的N末端、Fab的N末端或Fc的C末端中的一者或多者。在某些实施例中，Fab或其抗原结合片段直接融合到另一Fab或IgG或其抗原结合片段，而在其它实施例中，结合区经由接头部分融合。

在某些实施例中，本发明的WNT激动剂可具有、包含表2、表4、表5、表6或表7中提供的序列中的任一个、或其功能片段或变体，或由它们组成。

在某些实施例中，拮抗剂或激动剂结合剂以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、或约10nM或更小的解离常数(K_D)结合。例如，在某些实施例中，本文所述的与多于一个FZD结合的FZD结合剂或抗体以约l00nM或更小、约20nM或更小、或约10nM或更小的K_D结合那些FZD。在某些实施例中，结合剂以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、或约1nM 20或更小的EC50结合到一种或多种其靶抗原。

本发明的抗体或其它药剂可以通过所属领域已知的任何方法进行特异性结合测定。可以使用的免疫测定包括(但不限于)使用如BIAcore分析的技术的竞争性和非竞争性测定系统、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。此类测定是所属领域中常规且众所周知的(参见例如Ausubel等人，编辑，1994，《分子生物学实验指南(Current Protocolsin Molecular Biology)》，第1卷，纽约约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.，NewYork)，其以全文引用的方式并入本文)。

例如，抗体与靶抗原的特异性结合可以使用ELISA来确定。ELISA测定包括制备抗原、用抗原涂布96孔微量滴定板的孔，将结合到如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的可检测化合物的抗体或其它结合剂添加到孔，培育一段时间并检测抗原的存在。在一些实施例中，抗体或药剂不与可检测化合物结合，而是将识别第一抗体或药剂的第二结合抗体添加到孔中。在一些实施例中，代替用抗原涂布孔，可以将抗体或药剂涂布到孔，并且在将抗原添加到经涂布的孔之后可以添加与可检测化合物结合的第二抗体。所属领域的技术人员将了解哪些参数可以修改以增加所检测到的信号以及所属领域中已知的ELISA的其它变化(参见例如Ausubel等人，编辑，1994，《分子生物学实验指南》，第1卷，纽约约翰·威利父子公司，11.2.1)。

抗体或另一种药剂与靶抗原的结合亲和力和抗体-抗原相互作用的解离速率可以通过竞争性结合测定来确定。竞争性结合测定的一个实例是放射性免疫测定，其包含在存在增加量的未标记的抗原的情况下，将标记的抗原(例如，FZD、LRP)或其片段或变体与所关注的抗体一起培育，随后检测与标记的抗原结合的抗体。抗体的亲和力和结合解离速率可通过斯卡查德(scatchard)图分析从数据确定。在一些实施例中，BIAcore动力学分析用于确定抗体或药剂的结合速率和解离速率。BIAcore动力学分析包含分析抗体与固定抗原在其表面上的芯片的结合和解离。

本发明的WNT替代分子在结合到一种或多种FZD受体以及LRP5和LRP6中的一者或多者，并且在WNT信号传导的活化中具有生物活性，即WNT替代分子是WNT激动剂。术语“WNT激动剂活性”是指激动剂模仿WNT蛋白与卷曲受体蛋白和/或LRP5或LRP6结合的作用或活性的能力。本文公开的WNT替代分子和其它WNT激动剂模仿WNT活性的能力可通过许多测定来确认。WNT激动剂通常引发的反应或活性与由受体的天然配体引发的反应或活性类似或相同。特别地，本文公开的WNT激动剂活化、增强或增加规范的WNT/β-连环蛋白信号传导路径。如本文所用，术语“增强”是指与无WNT激动剂，例如不存在本文公开的WNT替代分子的情况下的水平相比，WNT/β-连环蛋白信号传导水平的可测量增加。在特定实施例中，例如在相同细胞类型中与在不存在WNT激动剂的情况下的WNT/β-连环蛋白信号传导水平相比，WNT/β-连环蛋白信号传导水平的增加是至少10％、至少20％、至少50％、至少两倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。测量WNT/β-连环蛋白信号传导的方法是本领域已知的，并且包括本文所述的那些。

在特定实施例中，本文公开的WNT替代分子是双特异性的，即它们特异性结合两种或更多种不同的表位，例如一种或多种FZD受体，以及LRP5和/或LRP6。在某些实施例中，WNT替代分子结合到FZD 5和/或FZD 8，以及LRP5和/或LRP6。

在特定实施例中，本文公开的WNT替代分子是多价的，例如它们包含各自特异性结合到相同表位的两个或更多个区域，例如结合到一个或多个FZD受体内的表位的两个或更多个区域和/或结合到LRP5和/或LRP6内的表位的两个或更多个区域。在特定实施例中，它们包含结合到一个或多个FZD受体内的表位的两个或更多个区域，以及结合到LRP5和/或LRP6内的表位的两个或更多个区域。在某些实施例中，WNT替代分子包含的结合一个或多个FZD受体的区域数目与结合LRP5和/或LRP6的区域数目的比率为或约：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、2:3、2:5、2:7、7:2、5:2、3:2、3:4、3:5、3:7、3:8、8:3、7:3、5:3、4:3、4:5、4:7、4:9、9:4、7:4、5:4、6:7、7:6、1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。在某些实施例中，WNT替代分子是双特异性和多价的。

在某些方面，本公开提供了能够以组织或细胞特异性方式增强WNT活性的新颖组织特异性WNT信号增强分子。在某些实施例中，组织特异性WNT信号增强分子是双功能分子，其包含结合到一种或多种ZNRF3和/或RNF43连接酶的第一结构域，以及以组织或细胞特异性方式结合到一种或多种靶向组织或细胞类型的第二结构域。第一结构域和第二结构域中的每一者可以是分别能够结合到连接酶复合物或靶向组织或细胞的任何部分。例如，第一结构域和第二结构域中的每一者可以是但不限于选自以下的部分：多肽(例如，抗体或其抗原结合片段或与抗体不同的肽或多肽)、小分子、以及天然配体或其变体、片段或衍生物。在某些实施例中，天然配体是多肽、小分子、离子、氨基酸、脂质或糖分子。第一结构域和第二结构域可以是彼此相同类型的部分，或者它们可以是不同类型的部分。在某些实施例中，组织特异性WNT信号增强分子结合到组织或细胞特异性细胞表面受体。在特定实施例中，与阴性对照相比，组织特异性WNT信号增强分子增加或增强WNT信号传导至少50％、至少两倍、至少三倍、至少五倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍或至少五十倍。

组织特异性WNT信号增强分子可以具有不同的形式。在特定实施例中，组织特异性WNT信号增强分子是融合蛋白，其包含结合到ZNRF3/RNF43的第一多肽序列和以组织或细胞特异性方式结合到一种或多种靶向组织或细胞类型的第二多肽序列。在某些实施例中，两个多肽序列可以直接或通过接头融合。在某些实施例中，组织特异性WNT信号增强分子包含两种或更多种多肽，例如包含两种或更多种融合蛋白的二聚体或多聚体，各自包含第一结构域和第二结构域，其中两种或更多种多肽例如通过接头部分或通过两种或更多种多肽中的每个多肽中的氨基酸残基之间的键连接，例如半胱氨酸残基之间的分子间二硫键。

在特定实施例中，组织特异性WNT信号增强分子是包含构成第一结构域或第二结构域的抗体重链和轻链(或其抗原结合片段)的抗体，其中另一结构域(即，第二结构域或第一结构域)作为融合蛋白或经由接头部分连接到抗体重链或轻链。在特定实施例中，另一个结构域连接到重链的N末端、重链的C末端、轻链的N末端或轻链的C末端。此类结构在本文中可被称为附接的IgG支架或形式。例如，组织特异性WNT信号增强分子可以是结合ZNRF3/RNF43的抗体，其中结合组织特异性受体或细胞特异性受体的结合结构域融合或附接到结合ZNRF3/RNF43的抗体的重链或轻链。在另一个实例中，组织特异性WNT信号增强分子可以是结合组织或细胞特异性受体的抗体，其中结合ZNRF3/RNF43的结合结构域融合或附接到结合组织或细胞特异性受体的抗体的重链或轻链。

在特定实施例中，肠特异性WNT信号增强分子是结合GPA33、CDH17、MUC-13的抗体或其抗原结合片段，其中结合ZNRF3/RNF43的结合结构域融合或附接到抗体或其抗原结合片段的重链或轻链。在特定实施例中，结合ZNRF3/RNF43的结合结构域包含Fu1和Fu2结构域，其中Fu1和Fu2结构域任选包含一种或多种氨基酸修饰，包括本文公开的那些修饰中的任一种，例如F105R和/或F109A。

在某些实施例中，组织特异性WNT信号增强分子包含结合ZNRF3/RNF43的第一结构域(“动作模块”)和例如以高亲和力结合组织或细胞特异性受体的第二结构域(“靶向模块”)。在某些实施例中，这两个结构域中的每一者具有基本上减少的活性，或本身在增强WNT信号方面不起作用。然而，当组织特异性WNT信号增强分子与表达组织特异性受体的靶组织接合时，将E3连接酶ZNRF3/RNF43募集到与组织特异性受体的三元复合物，使其被隔离，和/或经由受体介导的内饮作用从细胞表面清除。最终结果是以组织特异性方式增强WNT信号。

在某些实施例中，动作模块是ZNRF3/RNF43 E3连接酶的结合剂，并且其可基于R-spondins，例如R-spondins-1-4，包括但不限于人R-spondins-1-4来设计。在某些实施例中，动作模块是R-spondin，例如野生型R-spondin-1-4，任选地人R-spondin-1-4，或其变体或片段。在特定实施例中，其是与相应野生型R-spondins-1-4序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的R-spondins-1-4中任一者的变体。在某些实施例中，动作模块包含R-spondin的弗林蛋白酶结构域1或由其组成，例如结合ZNRF3/RNF43的R-spondin 1-4中的任一者。也可使用弗林蛋白酶结构域1的扩展形式(包括但不限于具有不再与LGR4-6结合或与LGR4-6结合减少的突变弗林蛋白酶结构域2的那些)或与能够特异性结合ZNRF3/RNF43的抗体不同的工程化抗体或任何其它衍生物或任何工程化多肽。在某些实施例中，动作模块包括R-spondin的一个或多个弗林蛋白酶结构域1。

在某些实施例中，与野生型弗林蛋白酶结构域2相比，所述动作模块不包含R-spondin的弗林蛋白酶结构域2，或者其包含R-spondin的经修饰的或变体弗林蛋白酶结构域2，例如具有减少活性的弗林蛋白酶结构域2。在某些实施例中，动作模块包含R-spondin的弗林蛋白酶结构域1，但不包含弗林蛋白酶结构域2。在某些实施例中，动作模块包含两种或更多种弗林蛋白酶结构域1或弗林蛋白酶结构域1的多聚体。动作结构域可以包含R-spondin的一个或多个野生型弗林蛋白酶结构域1。在特定实施例中，与野生型弗林蛋白酶结构域1相比，所述动作模块包含具有增加的活性，例如与ZNRF3/RNF43结合的R-spondin的经修饰的或变体弗林蛋白酶结构域1。可以例如通过筛选包含R-spondin弗林蛋白酶结构域1的变体的噬菌体或酵母呈现文库来鉴定与ZNRF3/RNF43结合增加的变体。还可以通过筛选鉴定与R-spondin弗林蛋白酶结构域1无关但与ZNRF3/RNF43结合增加的肽或多肽。动作模块可以进一步包含另外的部分或多肽序列，例如另外的氨基酸残基，以稳定作用模块的结构或模块存在于其中的组织特异性WNT信号增强分子。

在其它实施例中，作用模块包含另一个抑制部分，例如减少或防止ZNRF3/RNF43活性或表达的核酸分子，例如反义寡核苷酸；小干扰RNA(siRNA)；短发夹RNA(shRNA)；微小RNA(miRNA)；或核糖核酸酶。如本文所用，“反义”是指与核酸序列互补的核酸序列，无论长度如何。在某些实施例中，反义RNA是指可以引入到单个细胞、组织或个体的单链RNA分子，并且通过不一定依赖于内源性基因沉默路径的机制导致靶基因的表达减少。反义核酸可以含有经修饰的主链，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其它主链，或者可以含有非天然核苷间键。反义核酸可以包含例如锁核酸(LNA)。在特定实施例中，另一抑制剂部分抑制ZNRF3/RNF43中的一者或两者的活性，或抑制ZNRF3/RNF43中的一者或两者的基因、mRNA或蛋白质表达。在某些实施例中，抑制部分是结合到ZNRF3/RNF43基因或mRNA或其补体的核酸分子。

在某些实施例中，靶向模块特异性结合到细胞特异性表面分子，例如细胞特异性表面受体，并且可以是例如天然配体、抗体或合成化学物质。在特定实施例中，细胞特异性表面分子优先在靶器官、组织或细胞类型上表达，例如希望在其中增强WNT信号传导，以例如治疗或预防疾病或病症的器官、组织或细胞类型。在特定实施例中，例如与一个或多个其它非靶向器官、组织或细胞类型相比，细胞特异性表面分子在靶器官、组织或细胞类型上具有增加或增强的表达，例如希望增强WNT信号传导的器官、组织或细胞类型以例如治疗或预防疾病或病症。在某些实施例中，分别与一种或多种其它器官、组织或细胞类型相比，细胞特异性表面分子优先在靶器官、组织或细胞类型的表面上表达。举例来说，在特定实施例中，如果细胞表面受体在靶器官、组织或细胞中表达的水平分别比在一个或多个、五个或大于五个、所有其它器官、组织或细胞或平均数的所有其它器官、组织或细胞中的表达高至少两倍、至少五倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍，那么其被视为组织特异性或细胞特异性细胞表面分子。在某些实施例中，组织特异性或细胞特异性细胞表面分子是细胞表面受体，例如包含位于细胞表面膜内的区域和靶向模块可与之结合的胞外区域的多肽受体。在各种实施例中，本文所描述的方法可以通过以下方式实践：特异性靶向仅在靶组织或包括靶组织的组织子集上表达的细胞表面分子，或特异性靶向相比于所有、大部分或大量其它组织在靶组织上具有更高表达水平的细胞表面分子，例如在靶组织上的表达比在至少两个、至少五个、至少十个或至少二十个其它组织上高。

组织特异性和细胞特异性细胞表面受体是本领域已知的。组织和细胞特异性表面受体的实例包括但不限于GPA33、CDH17和MUC-13。在某些实施例中，靶向模块包含特异性结合这些肠特异性受体的抗体或其抗原结合片段。

在某些实施例中，WNT替代物和WNT信号增强分子的组分可以组合以赋予更多组织特异性。

III.药物组合物

还公开了包含本文所述的WNT激动剂分子和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物。

在另外的实施例中，还公开了包含多核苷酸和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物，所述多核苷酸包含编码本文所述的WNT激动剂分子的核酸序列。在某些实施例中，多核苷酸为DNA或mRNA，例如经修饰mRNA。在特定实施例中，多核苷酸为进一步包含5'帽序列和/或3'加尾序列(例如，聚A尾)的经修饰的mRNA。在其它实施例中，多核苷酸是包含与编码序列可操作地连接的启动子的表达盒。

在一些实施例中，WNT激动剂是并入有与WNT信号传导路径中的各种分子结合的各种表位结合片段的工程化重组多肽。举例而言，FZD和LRP抗体片段(例如Fab、scFv、sdAb、VHH等)可以直接或与各种大小的接头在一个分子上接合在一起。类似地，例如RSPO的多肽可以被工程化为含有针对组织特异性细胞表面抗原，例如MUC-13的抗体或其片段。RSPO也可以与E3连接酶，ZNRF3/RNF43的增强子同时或依次施用。E3连接酶增强子可以是结合ZNRF3/RNF43并增强E3连接酶活性的激动剂抗体或片段。

相反，工程化WNT激动剂也可以是并入有与WNT信号传导路径中的各种分子结合并增强WNT信号传导的表位结合片段的重组多肽。举例而言，WNT拮抗剂可以是与FZD受体和/或LRP受体结合并增强WNT信号传导的抗体或其片段。FZD和LRP抗体片段(例如Fab、scFv、sdAb、VHH等)可以直接或与各种大小的接头在一个分子上接合在一起。

在另外的实施例中，还公开了包括包含多核苷酸的例如病毒载体的表达载体和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物，所述多核苷酸包含编码本文所述的WNT激动剂分子的核酸序列。

本公开进一步涵盖一种包括包含表达载体的细胞和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物，所述表达载体包括包含与编码WNT激动剂分子的核酸可操作地连接的启动子的多核苷酸。在特定实施例中，药物组合物进一步包括包含表达载体的细胞，所述表达载体包括包含与编码WNT激动剂的核酸序列可操作地连接的启动子的多核苷酸。在特定实施例中，细胞是从待治疗的个体获得的异源细胞或自体细胞。

单独的或组合的主题分子可以与可用于制备配制物的药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和试剂组合，所述配制物通常安全、无毒且合乎需要并且包括可接受用于哺乳动物，例如人或灵长类动物使用的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体或气体(在气溶胶组合物的情况下)。所述载剂、稀释剂和赋形剂的实例包括(但不限于)水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以将补充性活性化合物并入配制物中。用于配制物的溶液或悬浮液可以包括：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂，如用于防止聚集的吐温(Tween)20；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调整，例如盐酸或氢氧化钠。在特定实施例中，药物组合物是无菌的。

药物组合物可以进一步包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载剂包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些情况下，所述组合物是无菌的，并且应当是流体的，使得其可以抽吸到注射器中或从注射器递送至个体。在某些实施例中，其在制造和存储条件下稳定且针对微生物(例如细菌和真菌)的污染作用而保存。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用涂层(如卵磷脂)、在分散液情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。内部组合物的延长吸收可通过在组合物中纳入延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

无菌溶液可以通过将WNT激动剂抗体或其抗原结合片段(或编码多核苷酸或包含编码多核苷酸的细胞)以所需量根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这产生了来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何其它所希望的成分的粉末。

在一个实施例中，药物组合物用载剂制备，所述载剂将保护抗体或其抗原结合片段免于从身体快速消除，例如控制释放配制物，包括植入剂和微封装递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制物的方法对所属领域技术人员而言将是显而易见的。材料也可以商购获得。还可以使用脂质体悬浮液作为药学上可接受的载剂。这些悬浮液可以根据所属领域的技术人员已知的方法来制备。

可能有利的是将药物组合物配制成单位剂型以便于施用和剂量均一性。如本文所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗个体的物理离散单位；每个单位含有与所需药物载剂结合，经计算以产生所期望的治疗效果的预定数量的活性抗体或其抗原结合片段。单位剂型的规格是由以下各项指示并且直接取决于以下各项：抗体或其抗原结合片段的独特特征和有待实现的具体治疗效果，以及在混配这种活性抗体或其抗原结合片段以治疗个体的领域中的固有局限性。

药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器(例如注射器，例如预填充注射器)中。

本公开的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或在施用于包含人的动物后能够(直接或间接地)提供生物活性抗体或其抗原结合片段的任何其它化合物。

本公开包括本文所述的WNT激动剂分子的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的生理学上和药学上可接受的盐：即，保留了亲本化合物的期望生物活性并且不对亲本化合物产生不期望的毒理效果的盐。多种药学上可接受的盐是所属领域已知的并且描述于例如“雷明顿的医药科学(Remington's PharmaceuticalSciences)”，第17版，Alfonso R.Gennaro(编)，美国宾夕法尼亚州伊斯顿马克出版公司(Mark Publishing Company,Easton,PA,USA)，1985(和其更近期的版本)，“制药技术百科全书(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)”，第3版，James Swarbrick(编)，美国纽约美国医疗保健公司(Inc.)，2007和《药物科学杂志(J.Pharm.sci.)》66：2(1977)。此外，有关合适的盐类的综述，请参见“药物盐手册：特性、选择和使用(Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use)”，由Stahl和Wermuth撰写(Wiley-VCH，2002)。用如碱金属和碱土金属或有机胺等金属或胺形成药学上可接受的碱加成盐。

用作阳离子的金属包含钠、钾、镁、钙等。胺包含N-N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见例如Berge等人,“药用盐(Pharmaceutical Salts)”,《药学杂志(J.Pharma Sci)》,1977,66,119)。所述酸性化合物的碱加成盐通过使游离酸形式与足够量的所需碱接触来制备，从而以常规方式产生所述盐。游离酸形式可以通过使盐形式与酸接触并以常规方式分离游离酸来再生。游离酸形式在某些物理性质(如在极性溶剂中的溶解度)方面与其相应的盐形式略有不同，但另外，出于本公开的目的，盐等同于其相应的游离酸。

在一些实施例中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的WNT激动剂分子或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其它蛋白质的掺合物。示例性氨基酸、聚合物和糖等为辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧化乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露糖醇、葡聚糖、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏和汉克氏溶液(Ringer's and Hank's solution)、半胱氨酸、精氨酸、肉碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和二醇。优选地，此配制物在4℃下稳定至少六个月。

在一些实施例中，本文提供的药物组合物包含缓冲剂，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、无菌水和所属领域的一般技术人员已知的其它缓冲剂，如由Good等人(1966)《生物化学(Biochemistry)》5：467所描述的那些。缓冲剂的pH可以在6.5至7.75的范围内，优选7至7.5，并且最优选7.2至7.4。

V.使用方法

本公开还提供了用于使用WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子例如调节WNT信号传导路径，例如增加WNT信号传导，以及在各种治疗环境中施用WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子的方法。本文提供了使用WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子的治疗方法。本文公开的任何方法也可使用WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强分子的组合或包含WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强的组合分子(组合分子)来实践，例如如本文所述。在一个实施例中，向患有涉及不当或失调的WNT信号传导的疾病的个体提供WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子。在某些实施例中，本文公开的方法包含向有需要的个体提供单独的或组合的WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子。在某些实施例中，WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强分子以相同或不同的药物组合物提供给个体。在一些实施例中，WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强分子在同一时间或在不同时间，例如一种在另一种之前或之后提供给个体。在一些实施例中，所述方法包括向个体提供有效量的WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子。在一些实施例中，在重叠时间段，例如一天、两天或一周期间，个体中存在有效量的WNT激动剂分子和组织特异性WNT信号增强分子。在某些实施例中，本文公开的方法包含向有需要的个体提供包含WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子的组合分子(组合分子)。

在某些实施例中，可以实践本文所公开的任一种方法以减少炎症(例如与IBD相关的炎症或受IBD影响的组织，如胃肠道组织，例如小肠、大肠或结肠中的炎症)、增加WNT信号传导、减少IBD的组织学症状中的任一种(例如本文所公开的那些)、减少发炎组织(例如胃肠道组织)中的细胞因子水平或减少如本文所公开的疾病活动性指数。

在某些实施例中，WNT激动剂分子或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子可用于增强组织或细胞中的WNT信号传导路径。激动WNT信号传导路径可以包括例如增加组织或细胞中的WNT信号传导或增强WNT信号传导。因此，在一些方面，本公开提供了一种用于在细胞中激动WNT信号传导路径的方法，其包含使组织或细胞与有效量的本文所公开的WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子或其药学上可接受的盐接触，其中所述WNT激动剂分子和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子是WNT信号传导路径激动剂。在一些实施例中，接触在体外、离体或体内发生。在特定实施例中，细胞是培养的细胞，并且接触在体外发生。

WNT激动剂和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子可用于治疗胃肠道病症，包括但不限于炎性肠病，包括但不限于克罗恩氏病、伴有瘘管形成的克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。特别地，本发明提供了WNT/β-连环蛋白信号传导WNT/β-连环蛋白激动剂，其用于增强由于由于这些病症的损伤而导致的肠上皮的再生。

在另一实施例中，激动剂分子还可以并入组织靶向部分，例如识别肺组织特异性受体或细胞表面分子的抗体或其片段。

本发明还提供了用已知治疗剂组合治疗胃肠道病症，特别是炎性肠病(IBD)。举例而言，WNT激动剂和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子可与若干已知针对IBD的疗法组合，包含但不限于5-氨基水杨酸盐(5-ASA)；免疫抑制剂，如皮质类固醇、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤和环孢素-A或他克莫司；TNF抑制剂，如英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗；抗整合素，如维多珠单抗；炎性细胞因子拮抗剂，如优特金单抗(ustekinumab)；janus激酶(JAK)抑制剂，如托法替尼(tofacitinib)；SMAD 7抑制剂，如mongersen；和S1P调节剂，如奥扎尼莫德(ozanimod)和依曲莫德(etrasimod)。以上治疗性药物可以与本发明的分子依次或同时施用。

治疗剂(例如，WNT激动剂和/或组织特异性WNT信号增强分子或组合分子)可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。发展中的疾病的治疗为备受关注的，其中治疗稳定或减少患者的非所需临床症状。期望在受影响组织的功能完全丧失之前执行这种治疗。期望在疾病的有症状的阶段期间并且在一些情况下在疾病的有症状的阶段之后施用主题疗法。在一些实施例中，本发明方法产生治疗效益，例如预防病症发展，中断病症进展，逆转病症进展等。在一些实施例中，本发明方法包含检测已获得的治疗效益的步骤。所属领域的一般技术人员将了解，此类治疗功效的量度将适用于正在改变的特定疾病，且将认识到用于测量治疗功效的适当的检测方法。

本说明书中所提到和/或本申请数据表中所列出的所有以上美国专利、美国专利申请公开案、美国专利申请案、外国专利、外国专利申请案以及非专利出版物以其全文引用的方式并入本文中。

从前述内容应了解，尽管本文中已出于说明的目的描述了本公开的特定实施例，但可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下做出各种修改。因此，本公开不受所附权利要求书的限制。

最好参考以下实例来理解本发明的广泛范围，所述实例并不意欲将本发明限制于所述特定实施例。

示例

I.一般方法

描述了分子生物学中的标准方法。Maniatis等人(1982)《分子克隆，实验室手册》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约州冷泉港(ColdSpring Harbor,N.Y.)；Sambrook和Russell(2001)《分子克隆(Molecular Cloning)，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港；Wu(1993)《重组DNA(Recombinant DNA)》，第217卷，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥。标准方法也出现在Ausbel等人(2001)《分子生物学实验指南》，第1-4卷，纽约州纽约约翰·威利父子公司，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖结合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。

描述了蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶。Coligan等人(2000)《蛋白质科学实验指南(Current Protocols in Protein Science)》，第1卷，纽约约翰·威利父子公司。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化。参见例如Coligan等人(2000)《蛋白质科学实验指南》，第2卷，纽约约翰·威利父子公司；Ausubel等人(2001)分子生物学实验指南，第3卷，纽约州纽约约翰·威利父子公司，第16.0.5-16.22.17页；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Co.)(2001)《生命科学研究的产物(Products for Life Science Research)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,Mo.)；第45-89页；安玛西亚制药生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)(2001)BioDirectory，新泽西州皮斯卡特维(Piscataway,N.J.)，第384-391页。描述了多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化。Coligan等人(2001)免疫学实验指南，第1卷、纽约约翰·威利父子公司；Harlow和Lane(1999)《使用抗体(Using Antibodies)》，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港；Harlow和Lane，同上。可获得用于表征配体/受体相互作用的标准技术。参见例如Coligan等人(2001)免疫学实验指南，第4卷，纽约约翰·威利公司。

可获得用于流式细胞术的方法，包括荧光活化的细胞分选检测系统参见例如，Owens等人(1994)《临床实验室实践的流式细胞术原理(Flow CytometryPrinciples for Clinical Laboratory Practice)》，约翰·威利父子公司，新泽西州霍博肯(Hobooken,N.J.)；Givan(2001)《流式细胞术(Flow Cytometry)》，第2版；Wiley-Liss，新泽西州霍博肯；Shapiro(2003)《实用流式细胞术(Practical Flow Cytometry)》，约翰·威利父子公司，新泽西州霍博肯。可获得荧光试剂，其适用于修饰核酸，包括核酸引物和探针、多肽和抗体，用于例如作为诊断试剂。《分子探针(Molecular Probes)(2003)目录(Catalogue)，分子探针公司(Molecular Probes,Inc.)，俄勒冈州尤金(Eugene,Oreg.)；西格玛-奥德里奇(2003)目录，密苏里州圣路易斯。

描述了免疫系统的组织学的标准方法。参见例如，Muller-Harmelink(编)(1986)《人胸腺：组织病理学和病理学(Human Thymus:Histopathology and Pathology)》，施普林格(Springer Verlag)，纽约州纽约；Hiatt等人(2000)《组织学的彩色图谱(Color Atlasof Histology)》，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams,andWilkins)，费城(Phla,Pa.)；Louis等人(2002)《基本组织学：文本和图谱(BasicHistology:Text and Atlas)》，麦格劳-希尔(McGraw-Hill)，纽约州纽约。

可获得用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库。参见例如GenBank，Suite(Informax有限公司，马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.))；GGC Wisconsin Package(Accelrys有限公司，加利福利亚州圣地亚哥)；(TimeLogic公司，内华达州水晶湾(Crystal Bay,Nev.))；Manne等人(2000)《生物信息学(Bioinformatics)》16：741-742；Menne等人(2000)《生物信息学应用笔记(Bioinformatics Applications Note)》16：741-742；Wren等人(2002)《生物医学中的计算机方法和程序(Comput.Methods Programs Biomed.)》68：177-181；von Heijne(1983)《欧洲生物化学学会联合会杂志(Eur.J.Biochem)》133：17-21；vonHeijne(1986)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》14:4683-4690。

II.卷曲受体在小鼠小肠中和在小鼠和人结肠中的表达。

为了确定小鼠小肠和结肠上皮中每个卷曲受体的表达模式，通过(ACD)检测用于单个卷曲受体的mRNA。表1中列出了所用的探针。遵循标准2.5HD Assay-Red方案。

表1：

FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8和FZD9以不同水平在小鼠肠上皮中表达(图1)。FZD5在肠隐窝和绒毛中以最高水平表达。在隐窝中，FZD 5表达在含有转运扩增(TA)细胞的顶端隔室附近要高得多。在肠上皮和紧邻肠隐窝周围的固有层中均检测到低水平的FZD1。FZD4、FZD6和FZD7以低水平表达，并且在肠绒毛和隐窝两者中均匀分布。FZD2、FZD3、FZD8、FZD9和FZD10的表达非常低，并且主要在肠隐窝中检测到。

FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8和FZD9也在小鼠结肠中以不同水平表达。FZD5在结肠隐窝中以最高水平表达，并且表达朝向腔侧更高。在结肠上皮中以较低水平检测到FFZD1和FZD7。FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD8和FZD9以低水平表达，并且在结肠隐窝中均匀分布。在肠中不存在FZD10的可检测表达。FZD表达水平在小鼠DSS结肠炎IBD模型的结肠和人溃疡性结肠炎患者结肠中受影响。

为了确定人结肠上皮中每个卷曲受体的表达模式，通过(ACD)检测用于单个卷曲受体的mRNA。遵循标准2.5HD Assay-Red方案。FZD5在结肠隐窝中以最高水平表达。在结肠上皮和涵盖结肠隐窝的基质细胞中以较低水平检测到FZD7。

III.工程化可溶性WNT激动剂的活性

在人肝细胞系Huh7细胞中检查了三种卷曲受体偏向的WNT激动剂，R2M3-26(FZD1，2，5，7，8和LRP6结合剂)、1RC07-03(FZD1，2，7和LRP5结合剂)和R2M13-03(FZD5，8和LRP5结合剂)的活性，以确定其活化WNT信号传导的能力。先前在WO2019126398中描述了三种WNT激动剂。表2提供了所使用的三种WNT激动剂的LC和HC链的序列。

表2：WNT激动剂序列

在第1天时，细胞以每96孔板100万接种并生长过夜。在20nM R-spondin的存在下，将蛋白质从100nM开始以10倍稀释一式三份添加到细胞中。以荧光素酶测定系统(普洛麦格(Promega))测定孔中荧光素酶报告基因活性，并在SpectraMax板读取器(分子仪器公司(Molecular Devices))上读取。示出了每种蛋白质稀释液一式三份的平均绝对RLU值(图2)。R2M3-26(FZD1,2，5，7，8)显示出最高的报告基因活性。R2M13-03(FZD5，8)在STF测定中显示出最低活性。

IV.通过FZD5和FZD8特异性活化WNT信号传导刺激小鼠小肠类器官增殖

小鼠小肠类器官维持在小鼠IntestiCult^TM类器官生长培养基(干细胞技术有限公司)中。为了测定类器官增殖，用温和细胞解离试剂(干细胞技术有限公司)振荡解离类器官10分钟，在冷PBS(Gibco)中洗涤两次，并且1：1再悬浮于Matrigel(康宁(Corning))的冰块上。将Matrigel中的25微升细胞再悬浮液接种到每个孔的中心预热的48孔组织培养板上，并且在37℃下固体化5分钟。将300微升基础培养基(表3)、基础培养基+IWP2或基础培养基+IWP2+替代WNT激动剂施用于孔。每个条件包括5-6次重复。培养基和处理在铺板后第4天改变一次。在第7天时获得的3D培养的类器官的图像示出在图3中。在第7天时，对处理的类器官进行细胞滴度Glow 3D(普洛麦格)。

表3.基础培养基组合物

在存在WNT激动剂处理的情况下，肠类器官增殖并且在形态上变成圆形。内源性WNT表达在用豪猪抑制剂IWP-2进行的测定中被抑制。R2M3-26(FZD1，2，5，7，8)和R2M13-03(FZD5，8)两者都有效地刺激了类器官增殖，这反映在类器官数量增加和单个类器官的增大(图3A和3C)。1RC07-03(FZD1,2,7)也刺激了类器官增殖，但程度要低得多。所有WNT激动剂都展现出比18R5-Dkk1c更高的活性(其结构描述于Janda等人(2017)《自然》545：234-237中)。FZD拮抗剂可以在类器官培养物中类似地进行测试。

VI.小鼠类器官培养物的IHC分析

用增殖标记Ki67染色证实R2M3-26对小鼠小肠类器官的活性。如上所述，用100nMR2M3-26处理在8孔室载玻片(Lab-Tek II，154534)中生长于培养基浸没的Matrigel中的小鼠小肠类器官7天。然后将类器官固定在4％PFA中，在PBS+0.2％Triton中渗透20分钟，并且在阻断缓冲液(PBS+0.2％Triton+3％BSA)中阻断。将初级抗体兔抗Ki67(Abcam ab15580，1：1000)和山羊抗E-钙粘蛋白(R&D AF748，1：2000)在阻断缓冲液中混合并添加到类器官中。在室温下与初级抗体一起温育1小时后，用3次PBS+0.2％Triton洗涤类器官，然后在室温下与1：1000稀释的二级抗体驴抗兔Alexa568(Abcam)和驴抗山羊Alexa488(Abcam)一起温育30分钟。然后将类器官用PBS+0.1％Tween洗涤3次，并安装在ProLong^TM戈尔德(Gold)抗荧光衰减固定剂(赛默飞世尔(Thermo Fisher))中。使用蔡司(Zeiss)DMi8荧光显微镜拍摄Z堆叠信号通道图像，以数字方式解卷积，投射在2D上，并且合并两个通道用于说明。WNT激动剂处理刺激小鼠小肠类器官的增殖。用100nM R2M3-26处理之后的小鼠小肠类器官用抗Ki67(红色)和抗E-钙粘蛋白(绿色)染色，示出了在WNT激动剂处理后的细胞增殖(图4)。

VII.体内葡聚糖硫酸钠(“DSS”)IBD小鼠模型

从杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(美国缅因州巴尔港(Bar Harbor,ME,USA))获得6周龄C57Bl/6J雌性小鼠，并且每笼饲养4只。所有动物实验均符合国家科学院编制的“实验室动物护理和使用指南”的标准。用于动物实验的方案由Surrozen机构动物护理和使用委员会批准。在开始实验之前，使小鼠适应至少两天。在30％至70％湿度环境和在20℃至26℃范围内的室温下将小鼠保持12/12小时光/暗循环。

为了诱导急性结肠炎，给7至8周龄雌性小鼠自由饮用含有4.0％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS，MP生物医疗公司(MP生物医疗公司)，MFCD00081551)的饮用水7天和含有1.0％(w/v)DSS的饮用水2天(图5A)。经受DSS的小鼠发展出重症结肠炎，其特征是深度和持续体重减轻(图5B)和血性腹泻，导致如粪便评分所表示的疾病指数增加(图5C)。RSPO2-Fc(R-Spondin 2-Fc；SEQ ID NO:24)加R2M3-26联合治疗，每周两次或每日，在第9天时的疾病活动性指数(DAI)与阴性对照相比显著改善。单独的R2M3-26和R2M3-26加RSPO2-Fc处理在第10天时显著改善体重。

DSS模型小鼠的横结肠的组织学评价显示从粘膜延伸到浆液的炎症、隐窝增生、杯状细胞损失和溃疡(图6A-6E)；相比之下，WNT激动剂处理的小鼠的结肠几乎正常，在所有处理组中具有最低的组织学评分(图6C)。RSPO2-Fc对结肠组织的组织学评分没有显著的积极影响。与对照抗GFP组相比，RSPO2-Fc加R2M3-26联合组具有较低的结肠组织的组织学评分(P<0.0，图7A)。R2M3-26似乎不影响小肠隐窝或绒毛(图8C)，而RSPO2-Fc和联合诱导了绒毛和隐窝的增生(图8D-8E)。如上文Geboes等人(2000)中所述评估组织学评分。

血清炎性细胞因子通过促炎性面板1试剂盒(麦索斯盖尔诊断学有限责任公司(Meso Scale Diagnostics)，K15048D)以及R2M3-26、RSPO2-Fc和R2M3-26加RSPO2-Fc的处理来分析，所有这些都降低了IFN-γ、TNF-α和IL-1β的细胞因子水平(图9A-9J，具体地说分别为图9A、图9J和图9B)。

单独的RSPO2-Fc诱导小肠增生，并且对体重减轻和DAI没有显著益处。WNT激动剂/RSPO2-Fc联合处理降低了疾病活动性，修复了受损的结肠上皮，同时诱导了小肠的增生。单独的R2M3-26：a)改善体重；b)修复受损的结肠上皮；c)减少血清炎性细胞因子标记；和d)不引起小肠增生，因此证明单独的WNT激动剂可以通过改善上皮屏障来治疗急性结肠炎，从而减少炎症。

VIII.肠道炎症的改善和上皮组织修复

先前研究证实，多特异性WNT激动剂R2M3-26能够在DSS结肠炎小鼠模型中改善肠道炎症并修复上皮损伤。考虑到结肠中FZD 5和FZD 8的选择性表达，测试FZD5，8特异性WNT激动剂R2M13-26和FZD1，2，7特异性WNT激动剂1RC07-26,以确定其中之一或两者是否能够减轻小鼠模型中DSS诱导的结肠炎。

从杰克逊实验室(美国缅因州巴尔港)获得6周龄C57Bl/6J雌性小鼠，并且每笼饲养5只。所有动物实验均符合国家科学院编制的“实验室动物护理和使用指南”的标准。用于动物实验的方案由内部机构动物护理和使用委员会批准。

为了诱导急性结肠炎，给7至8周龄雌性小鼠自由饮用含有4.0％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS，MP生物医疗公司，MFCD00081551)的饮用水7天和含有1.0％(w/v)DSS的饮用水3天。经受DSS的小鼠发展出重症结肠炎，其特征是深度和持续体重减轻(图10A)和血性腹泻，导致粪便评分(图10B)和疾病活动性指数增加。R2M3-26、R2M13-26和1RC07-26分别每周两次处理与阴性对照(PBS或抗GFP)相比显著改善在第10天的体重(图10A)和粪便评分(图10B)。DSS模型小鼠的横结肠的组织学评价显示出嗜中性粒细胞浸润、隐窝增生、杯状细胞损失和溃疡(图11B和11C)。R2M3-26、R2M13-26和1RC07-26处理修复了结肠组织结构，显示出上皮侵蚀、杯状细胞损失和嗜中性粒细胞迁移的改善(图11D-H)。R2M3-26、R2M13-26或C07-3不引起小肠增生(图11B和11C),而R2M3-26/RSPO联合处理诱导小肠增生(图12D-H)。使用促炎性面板1试剂盒(麦索斯盖尔诊断学有限责任公司，K15048D)分析血清和结肠组织中的炎性细胞因子，结果表明R2M3-26和R2M13-26处理显著降低血清中的TNF-α和IL-8水平(图13A和13C)，以及结肠组织中的IL-6和IL-8水平(图13E和13F)。

如上文实例IV中所提及，R2M3-26减少了DSS结肠炎小鼠中的肠道炎症并修复了上皮损伤。本研究进一步证实，FZD5，8特异性WNT激动剂R2M13-26和FZD1，2，7特异性WNT激动剂1RC07-26能够改善DAI，修复受损的结肠上皮而无小肠增生，并且降低结肠和血清中的炎性细胞因子水平。

IX.小鼠DSS模型中R2M13-26的剂量反应分析

为了确定IBD的DSS小鼠模型中R2M13-26(FZD5，8结合剂)的最佳剂量，从杰克逊实验室(美国缅因州巴尔港)获得六周龄C57Bl/6J雌性小鼠，并且每笼饲养5只。所有动物实验均符合国家科学院编制的“实验室动物护理和使用指南”的标准。用于动物实验的方案由Surrozen机构动物护理和使用委员会批准。

为了诱导急性结肠炎，给7至8周龄雌性小鼠自由饮用含有4.0％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS，MP生物医疗公司，MFCD00081551)的饮用水7天和含有1.0％(w/v)DSS的饮用水3天。经受DSS的对照小鼠发展出重症结肠炎，其特征是深度和持续体重减轻和血性腹泻，导致疾病活动性指数增加(DAI，图14A-14B)。

0.3、1、3、10mpk，每周两次的R2M13-26处理以剂量反应模式改善DAI(图14A)。其它浓度1，3，10，30mpk，每周一次的R2M13-26处理以剂量反应模式改善DAI(图14B)。DSS模型小鼠的横结肠的组织学评价显示出嗜中性粒细胞浸润、水肿、隐窝增生、杯状细胞损失和溃疡。以不同剂量和频率进行的R2M13-26处理都显示出在DSS结肠炎小鼠中关于上皮侵蚀、杯状细胞损失和嗜中性粒细胞迁移的改善(图15A-15J)。使用促炎性面板1试剂盒(麦索斯盖尔诊断学有限责任公司，K15048D)分析血清和结肠组织中的炎性细胞因子，结果表明不同剂量和频率的R2M13-26处理都显著减少血清图16A-16C)以及结肠组织(图17A-17C)中的TNF-α、IL-6和IL-8水平。

在DSS结肠炎小鼠模型中，广泛剂量范围的RR2M13-26减少了肠道炎症并修复了上皮损伤，进一步验证了FZD5，8特异性分子(R2M13-26)通过改善肠上皮屏障来治疗急性结肠炎。

X.不同FZD5,8特异性WNT激动剂在急性DSS模型中的功效

在人肝细胞系Huh7细胞中检查四种FZD5，8特异性WNT激动剂，即57SE8-26、57SB8-26、174R-E01-26和57SA10-26的活性，以确定其活化WNT信号传导的能力。表4提供了FZD5，8WNT激动剂的组分的序列。这些WNT激动剂包含FZD结合结构域和LRP结合结构域，所述FZD结合结构域是含有重链(HC)和轻链(LC)的Fab，所述LRP结合结构域是经由接头与LC的N末端处的FZD Fab连接的VHH。WNT激动剂包括所示LC链中的两条和所示HC链中的两条。

表4：FZD5，8特异性WNT激动剂

FZD-VH序列以粗体指示；FZD-CH1序列以斜体指示；铰链序列以粗体斜体指示；CH2序列以带下划线的斜体指示；CH3序列以粗体下划线指示；LRP(26)VHH序列，通过接头连接到VL的N末端，以粗体斜体下划线指示；接头序列仅加下划线；FZD-VL是阴影灰色；并FZD-CL是阴影灰色和带下划线。

特异性结合FZD5和FZD8(并且不显著结合其它FZD)的FZD5/8特异性结合结构域示于表5中。

表5：FZD5，8特异性结合结构域

在某些实施例中，本公开提供了包含与SEQ ID NO:7-14或33-40中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性的序列的多肽。在某些实施例中，本公开提供了一种包含FZD结合结构域的WNT激动剂，所述FZD结合结构域包含与SEQ ID NO:7-14或33-40中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性的序列。在某些实施例中，本公开提供一种抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:33-40中的任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性的序列。在某些实施例中，本公开提供了一种包含FZD结合结构域的组合分子，所述FZD结合结构域包含与SEQ ID NO:7-14或33-40中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性的序列。

表6提供了上述FZD5，8结合结构域的VH和VL的CDR序列。在某些实施例中，本公开提供了包含FZD5，8结合结构域中任一者的VH和/或VL CDR序列中的一者或两者的多肽。在某些实施例中，本公开提供了一种包含FZD结合结构域的WNT激动剂，所述FZD结合结构域包含本文鉴定的FZD5，8结合结构域，例如57SE8、57SB8174RE或57SA10中任一者的重链(CDRH1-3)和/或轻链(CDRL1-3)CDR序列中的一者或二者。在某些实施例中，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含FZD5，8结合结构域中任一者的VH和/或VL CDR序列中的一者或两者。在某些实施例中，本公开提供了一种WNT激动剂，其包含FZD5，8结合结构域中任一者的VH和/或VL CDR序列中的一者或两者。在某些实施例中，本公开提供了一种包含FZD结合结构域的组合分子，所述FZD结合结构域包含FZD5，8结合结构域中任一者的VH和/或VL CDR序列中的一者或两者。在其它实施例中，多肽、抗体或其结合片段、WNT激动剂或组合分子合成存在于任何结合结构域中的六个CDR中的至少5个。在其它实施例中，多肽、抗体或其结合片段、WNT激动剂或组合分子包含存在于任何结合结构域中的六个CDR，其中与天然CDR相比，CDR共同包含一个或多个，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个氨基酸修饰。在特定实施例中，WNT激动剂或组合分子包含共同具有所公开的CDR或其变体中任一者的两条重链和两条轻链。

表6.FZD5，8结合结构域的CDR序列

在第1天时，细胞以每96孔板100万接种并生长过夜。在20nM R-spondin的存在下，将蛋白质从100nM开始以10倍稀释一式三份添加到细胞中。以荧光素酶测定系统(普洛麦格)测定孔中荧光素酶报告基因活性，并在SpectraMax板读取器(分子仪器公司)上读取。示出了每种蛋白质稀释液一式三份的平均绝对RLU值(图18)。R2M13-26包括在相同的测定中用于比较。

为了确定IBD的DSS小鼠模型中另外FZD5，8WNT激动剂的功效，从杰克逊实验室(美国缅因州巴尔港)获得六周龄C57Bl/6J雌性小鼠，并且每笼饲养5只。所有动物实验均符合国家科学院编制的“实验室动物护理和使用指南”的标准。用于动物实验的方案由Surrozen机构动物护理和使用委员会批准。

为了诱导急性结肠炎，给7至8周龄雌性小鼠自由饮用含有4.0％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS，MP生物医疗公司，MFCD00081551)的饮用水7天和含有1.0％(w/v)DSS的饮用水3天。经受DSS的对照小鼠发展出重症结肠炎，其特征是深度和持续体重减轻和血性腹泻，导致疾病活动性指数增加(DAI，图19A)。

10mpk，每周两次的FZD5，8特异性WNT激动剂改善DAI，类似于R2M13-26(图19A)。使用促炎性面板1试剂盒(麦索斯盖尔诊断学有限责任公司，K15048D)分析血清中的炎性细胞因子，结果表明除58SE8-26外的FZD5，8特异性WNT激动剂都显著减少血清图16A-16C)以及结肠组织(图19B-19D)中的TNF-α、IL-6和IL-8水平。

在DSS结肠炎小鼠模型中，FZD5，8特异性WNT激动剂减少了肠道炎症并修复了上皮损伤，引起改善的DAI，进一步验证了本文所述的FZD5，8特异性WNT激动剂分子通过改善肠上皮屏障来治疗急性结肠炎。

XI.组织特异性WNT信号增强分子在体外有效地活化WNT信号传导并刺激肠类器官 生长

将MUC-13结合剂C4、C7和C14(参见例如WO2016168607A1)克隆并且以全长IgG形式产生，并且其与MUC13的结合能力通过对表达MUC13的HT29细胞的FACS分析来测定。还分析它们与不表达MUC-13的HEK293细胞的潜在结合作为阴性对照。收获细胞并用FACS缓冲液(PBS(-Ca²⁺，-Mg²⁺)、0.1％BSA、0.5％叠氮化钠)洗涤2次，并以10⁶个细胞/毫升再悬浮于FACS缓冲液中。将60微升细胞悬浮液等分到96孔v底板的每个孔中，并且将板在1500rpm下旋转3分钟，以去除FACS缓冲液，然后添加10nM在FACS缓冲液中稀释并在4C温育1小时的相应MUC-13抗体或抗GFP对照抗体。然后旋转板以去除初级抗体，并且用FACS缓冲液洗涤1次，随后添加Alexa488山羊抗人二级抗体(赛默飞世尔科技)，并且在4C下温育30分钟。然后在旋转之后去除这一培养基，并且在FACS缓冲液中洗涤板1次。然后将细胞再悬浮于150FACS缓冲液中，并且在10，000个事件下在BD Accuri^TM细胞分析仪(百克顿-迪金森公司(Becton Dickinson))上进行分析。比较HT29(图20A-20C)和HEK293细胞(图20D-20F)的FACS图，所测试的MUC-13结合剂中仅一种C14示出了HT29细胞中的特异性FACS移位，指示C14的MUC-13特异性结合活性。表7提供了所测试的MUC-13结合剂的序列。

表7：组织靶向WNT增强子

为了检查上述MUC-13结合剂是否可用于驱动肠特异性WNT信号传导增强分子的组织特异性，以15个氨基酸的GS接头将突变型(F105R/F109A)RSPO2(mutRSPO2，其具有在Furin2结合结构域中的氨基酸突变，从而减少与LGR1-4的结合(参见例如WO2020014271)与MUC-13IgG抗体(或作为阴性对照的GFP抗体)重链的C末端融合。如上所述，通过HT29细胞或HEK293细胞中的Super TOPFlash荧光素酶报告基因(STF)测定来测试这些MUC-13靶向的mutRSPO2(mutRSPO)分子的信号传导活性。测量C4-mutRSPO2、C7-mutRSPO2和C14-mutRSPO2荧光素酶报告基因活性的剂量反应曲线(图21)。同样，在MUC-13靶向的WNT增强分子中，仅C14-mutRSPO2在HT29细胞中但未在HEK293细胞中显示出剂量反应曲线的特定左移，其中EC50与野生型Fc-RSPO2(SEQ ID NO:24)相当。这与作为IgG的C-14的MUC-13结合活性一致，表明当被MUC-13结合靶向时，缺乏Lgr4-6结合能力的WNT增强分子可以像天然RSPO2一样起作用以调节细胞中的WNT信号传导。

还检查了人小肠类器官中MUC-13靶向的WNT信号传导增强分子的信号传导活性。上文描述了类器官培养物的生长和维持。当培养基中的野生型RSPO被C14-mutRSPO2替换时维持人小肠类器官的生长。人小肠类器官在基础培养基中生长，其中RSPO-1被所示的浓度稀释系列的非肠上皮细胞靶向的mutRSPO1(ASGR1-mutRSPO1；参见例如WO2020014271)替换(图21A-21C)或被相同浓度C14-mutRSPO2(图21D-21F)替换。虽然在ASGR1-mutRSPO1中生长的类器官停止生长并且开始变性，类似于在不含任何RSPO的基础培养基中生长时观察到的结果(图21G),但C14-mutRSPO能够维持类似于含有野生型RSPO的IntestiCultTM(干细胞技术有限公司(StemCell Technologies))类器官生长培养基的类器官生长(图21H)。该测定证实,MUC-13靶向的WNT信号传导增强分子可以对人小肠微型组织中的完整上皮起作用。

上文所描述的各种实施例可以组合以提供另外的实施例。本说明书中所提到和/或本申请数据表中所列出的所有美国专利、美国专利申请公开案、美国专利申请案、外国专利、外国专利申请案以及非专利出版物以其全文引用的方式并入本文中。如果需要，可以修改实施例的各方面，以便使用各个专利、申请案以及公开案的观点来提供另外的实施例。可以根据以上详细描述对实施例进行这些和其它改变。

总体而言，在以下权利要求书中，所使用的术语不应理解为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的具体实施例，但应理解为包括所有可能的实施例以及这份权利要求书所有权获得的等效物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开限制。

序列表

<110> Surrozen, Inc.

Li, Yang

Lu, Chenggang

Baribault, Helene

Yeh, Wen-Chen

Xie, Liqin

Wang, I-Chieh

Meng, Weixu

<120> 调节胃肠道病症中的WNT信号传导

<130> SRZN-014/02WO 328202-2067

<150> US 62/816,720

<151> 2019-03-11

<150> US 62/888,749

<151> 2019-08-19

<160> 64

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ser Lys Glu Lys Ala Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 2

<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 2

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr

20 25 30

Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Ala Val Val

115 120 125

Leu Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

130 135 140

Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Asn Tyr Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Tyr

165 170 175

Thr Asn Thr Arg Ser Ser Asp Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ile

180 185 190

Val Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Pro Asp Asp

195 200 205

Glu Ser Val Tyr Phe Cys Leu Leu Tyr Leu Gly Arg Gly Ile Trp Val

210 215 220

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala

225 230 235 240

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn

245 250 255

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val

260 265 270

Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu

275 280 285

Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser

290 295 300

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser

305 310 315 320

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro

325 330 335

Thr Glu Cys Ser

340

<210> 3

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 3

Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Thr Tyr Arg

20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ser Met Val Arg Val Pro Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 4

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 4

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Ala Asn Ile Asn Ser Ile Glu

20 25 30

Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Ala Asn Met Arg Gly Gly Gly Tyr Met Lys Tyr Ala Gly Ser Leu Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Glu Ser Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr

85 90 95

Val Lys Leu Arg Asp Asp Asp Tyr Val Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp Ile Gln

115 120 125

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

130 135 140

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

180 185 190

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

195 200 205

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly

210 215 220

Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

245 250 255

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

260 265 270

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

275 280 285

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

290 295 300

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

305 310 315 320

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

325 330 335

Gly Glu Cys

<210> 5

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Phe Ser Gly His

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp His Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Glu Pro Ser Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Asn Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Asp Trp Gly His Tyr His Gly Leu Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 6

<211> 335

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 6

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Ala Asn Ile Asn Ser Ile Glu

20 25 30

Thr Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Ala Asn Met Arg Gly Gly Gly Tyr Met Lys Tyr Ala Gly Ser Leu Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Met Ser Thr Glu Ser Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr

85 90 95

Val Lys Leu Arg Asp Asp Asp Tyr Val Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Val Leu Thr Gln

115 120 125

Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys

130 135 140

Ser Gly Asp Lys Val Gly His Lys Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Asp Ser Gln Arg Pro

165 170 175

Ser Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala

180 185 190

Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

195 200 205

Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr

210 215 220

Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val

245 250 255

Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys

260 265 270

Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser

275 280 285

Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr

290 295 300

Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His

305 310 315 320

Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

325 330 335

<210> 7

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 8

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 8

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr

20 25 30

Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

115 120 125

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

130 135 140

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ser Trp Leu Ala Trp Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser

165 170 175

Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

180 185 190

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

195 200 205

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln

210 215 220

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

245 250 255

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

260 265 270

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

275 280 285

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

290 295 300

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

305 310 315 320

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

325 330 335

Glu Cys

<210> 9

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Asp

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Pro Pro Ala Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Phe Gln His

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

225 230 235 240

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 10

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 10

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr

20 25 30

Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

115 120 125

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

130 135 140

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asn Asp Trp Leu Ala Trp Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser

165 170 175

Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

180 185 190

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

195 200 205

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro

210 215 220

Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

245 250 255

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

260 265 270

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

275 280 285

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

290 295 300

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

305 310 315 320

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

325 330 335

Glu Cys

<210> 11

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Asp Thr Phe Gly Val Gly His Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 12

<211> 343

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 12

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr

20 25 30

Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp Val Val Met

115 120 125

Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser

130 135 140

Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn

145 150 155 160

Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile Ser Arg Val Glu

195 200 205

Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Leu His Thr Pro

210 215 220

Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

225 230 235 240

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

245 250 255

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

260 265 270

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

275 280 285

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

290 295 300

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

305 310 315 320

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

325 330 335

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

340

<210> 13

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Val Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Ala Met Val Arg Gly Gly Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 14

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt激动剂

<400> 14

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Arg Ile Phe Ala Ile Tyr

20 25 30

Asp Ile Ala Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Asn Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Met Ile Arg Pro Val Val Thr Glu Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Met Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Lys Arg Pro Trp Gly Ser Arg Asp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

115 120 125

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

130 135 140

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

180 185 190

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

195 200 205

Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln

210 215 220

Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

245 250 255

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

260 265 270

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

275 280 285

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

290 295 300

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

305 310 315 320

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

325 330 335

Glu Cys

<210> 15

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 15

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Val Pro Thr Met Ile Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 16

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 16

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 17

<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 17

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Val Pro Thr Met Ile Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn

465 470 475 480

Gly Cys Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu

485 490 495

Gly Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr

500 505 510

Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile

515 520 525

Glu Asn Cys Asp Ser Cys Arg Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys

530 535 540

Val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp

545 550 555 560

Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu

565 570

<210> 18

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe His Asp Tyr

20 25 30

Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val Tyr Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Lys Ala Tyr

65 70 75 80

Val Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Val Arg Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 19

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 19

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Thr Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Ile Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Ile Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 20

<211> 565

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe His Asp Tyr

20 25 30

Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val Tyr Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Lys Ala Tyr

65 70 75 80

Val Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Val Arg Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Ile Cys Lys Gly

450 455 460

Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys Ser Arg Cys Gln Gln Lys

465 470 475 480

Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys

485 490 495

Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp Met

500 505 510

Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn Cys Asp Ser Cys Arg Ser

515 520 525

Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly

530 535 540

Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr

545 550 555 560

Met Glu Cys Val Glu

565

<210> 21

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Val Phe Trp Asp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 22

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 22

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Met Glu Thr Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 23

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Val Phe Trp Asp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly

435 440 445

Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Ile Cys Lys

450 455 460

Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys Ser Arg Cys Gln Gln

465 470 475 480

Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met Arg Gln Tyr Gly Glu

485 490 495

Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp

500 505 510

Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn Cys Asp Ser Cys Arg

515 520 525

Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly Phe Tyr Leu His Arg

530 535 540

Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu

545 550 555 560

Thr Met Glu Cys Val Glu

565

<210> 24

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 实验室制造-合成的wnt增强子

<400> 24

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn

245 250 255

Gly Cys Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu

260 265 270

Gly Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr

275 280 285

Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile

290 295 300

Glu Asn Cys Asp Ser Cys Phe Ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp

325 330 335

Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu

340 345

<210> 25

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(63)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (84)..(84)

<223> n为a、c、g或t

<400> 25

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcntc agtgaaggtt 60

tcntgcaagg catctggata cacnttcacc aactactata tgcactgggt gcgtcaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaattat 180

gcacagaagt ttcagggccg tgtcaccatg acccgcgaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgcg ttctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggcac 300

tggtacttcg atctctgggg ccgtggcacc ctggtcaccg tctcctca 348

<210> 26

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 26

gacatccgga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtga gagtattagg agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatcgcgtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccttggac gttcggccaa 300

ggtaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 27

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 27

gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcacc aaagactata tgcactgggt gcggcaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tatttggtac agcaaactac 180

gcacagaggt tccagggccg ggtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgcg gtctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggactc 300

ccaccagcag ctggtggcgg cggatacttc cagcactggg gccagggcac cctggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 28

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 28

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gaatgttaat gactggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatagt gcatccaatt tgcaatctgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatccgcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacagta ccccattcac tttcggccct 300

ggtaccaaag tggatatcaa a 321

<210> 29

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 29

gaggtccagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctttat 240

ctgcaaatga acagcctcag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gggggacacc 300

tttggagtgg gacacttcta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagc 354

<210> 30

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 30

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagactttac actgcaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtc tattactgca tgcaaggact tcacactccg 300

gtcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336

<210> 31

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 31

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctctgtta tcagctgggt gcggcaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagtgttt acaatggtaa cacaaactat 180

gcagagaagt tccagggccg ggtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgcg gtctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatttgct 300

atggttcggg gaggggtcta ctactttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 32

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 32

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc agttatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacat tattataatc tcccgctcac cttcggccaa 300

ggtacccgac tggagattaa a 321

<210> 33

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 35

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Asp

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Pro Pro Ala Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Phe Gln His

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asn Asp Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Asp Thr Phe Gly Val Gly His Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 38

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Leu His Thr Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 39

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 39

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Val Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Ala Met Val Arg Gly Gly Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Asn Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH1

<400> 41

Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH1

<400> 42

Tyr Thr Phe Thr Lys Asp Tyr Met His

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH1

<400> 43

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH1

<400> 44

Gly Thr Phe Ser Ser Ser Val Ile Ser

1 5

<210> 45

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH2

<400> 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala

1 5 10

<210> 46

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH2

<400> 46

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala

1 5 10

<210> 47

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH2

<400> 47

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala

1 5 10

<210> 48

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH2

<400> 48

Gly Trp Ile Ser Val Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala

1 5 10

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH3

<400> 49

Cys Ala Arg Gly His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp

1 5 10

<210> 50

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH3

<400> 50

Cys Ala Arg Gly Leu Pro Pro Ala Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Phe Gln

1 5 10 15

His Trp

<210> 51

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH3

<400> 51

Cys Ala Gly Asp Thr Phe Gly Val Gly His Phe Tyr Trp

1 5 10

<210> 52

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRH3

<400> 52

Cys Ala Arg Phe Ala Met Val Arg Gly Gly Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 15

Trp

<210> 53

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL1

<400> 53

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL1

<400> 54

Arg Ala Ser Gln Asn Val Asn Asp Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 55

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL1

<400> 55

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL1

<400> 56

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL2

<400> 57

Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser

1 5

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL2

<400> 58

Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser

1 5

<210> 59

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL2

<400> 59

Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL2

<400> 60

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 61

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL3

<400> 61

Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe

1 5 10

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL3

<400> 62

Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe

1 5 10

<210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL3

<400> 63

Cys Met Gln Gly Leu His Thr Pro Val Thr Phe

1 5 10

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽-CDRL3

<400> 64

Gln His Tyr Tyr Asn Leu Pro Leu Thr Phe

1 5 10