具体实施方式

I.引言

基于AAV的基因治疗非常有望用于治疗血友病患者。对于B型血友病，第一临床数据振奋人心，因为至少在一些患者中可维持约10％的FIX水平超过1年。然而，对于A型血友病，出于种种原因，用AAV载体实现5％-10％的治疗表达水平仍然具有挑战性。首先，因子VIII编码序列对于常规的基于AAV的载体而言过大。第二，即使进行密码子优化，经工程化的B-结构域缺失或截短的因子VIII构建体仍然在体内表达不良。第三，这些B-结构域缺失或截短的因子VIII变体构建体的体内半衰期短，从而加重不良表达的影响。第四，即使表达，FVIII也未如其他凝血因子诸如因子IX一样从细胞有效地分泌。

本公开部分关于含有密码子改变的因子VIII变体编码序列的基因治疗载体的发现，其解决与因子VIII基因治疗相关的这些问题及其他问题。举例而言，在一些实施方案中，本文公开的因子VIII变体多核苷酸、多肽和基因治疗构建体提高哺乳动物细胞中外源性因子VIII表达。在一些实施方案中，本文公开的因子VIII变体多核苷酸、多肽和基因治疗构建体提高体内生物利用率(例如提高患者血液中的因子VIII活性)。在一些实施方案中，本文公开的因子VIII变体多核苷酸、多肽和基因治疗构建体提高患者血液中外源性因子VIII的循环半衰期。如本文所述，通过使用对基因治疗系统的以下改善中的一者或多者的任何组合，来实现这些优点中的一者或多者。

在一些实施方式中，通过如本文所述，将X5突变工程化至由密码子改变的因子VIII多肽编码的因子VIII变体多肽中来实现这些优点中的一者或多者。有利地，如本文所述，编码因子VIII多肽中X5突变的包含提高体内和体外外源性表达的因子VIII的生物效能。举例而言，如实施例4中所述，在施用编码Refacto因子VIII-X5变体的AAV基因治疗载体之后，与施用编码野生型Refacto因子VIII变体的另外同一基因治疗载体的小鼠相比，在Refacto FVIII多肽的重链的A1结构域中包含五个X5突变可使品系E2小鼠中体内外源性因子VIII生物效能增加3倍(图12中比较vX5/CS24与vCS04)。与体内结果一致，在用编码Refacto因子VIII-X5变体的AAV基因治疗载体感染HepG2细胞之后，与用编码野生型Refacto因子VIII变体的另外同一基因治疗载体的HepG2细胞相比，在因子FVIII重链的A1结构域中包含五个X5突变可使体外外源性因子VIII生物效能增加4倍(图12中比较vX5/CS24与vCS04)。

在一些实施方式中，如本文所述，通过将NG5糖基化肽工程化至由密码子改变的因子VIII多肽编码的因子VIII变体多肽的B-结构域接头中来实现这些优点中的一者或多者。有利地，如本文所述，编码的因子VIII多肽中包含NG5糖基化肽提高体内外源性表达的因子VIII的生物效能。举例而言，如实施例3中所述，在施用编码Refacto因子VIII-NG5变体的AAV基因治疗载体之后，与施用编码野生型Refacto因子VIII变体的另外同一基因治疗载体的小鼠相比，在Refacto FVIII多肽的SQ-接头中包含NG糖基化肽可使品系E2小鼠中体内外源性因子VIII生物效能增加2倍(图12中比较vNG5/CS04与vCS04)。

在一些实施方式中，如本文所述，通过将X5突变与NG5糖基化肽两者工程化至由密码子改变的因子VIII多肽编码的因子VIII变体多肽中来实现这些优点中的一者或多者。有利地，如本文所述，编码的因子VIII多肽中包括X5突变和NG5糖基化肽提高体内和体外外源性表达的因子VIII的生物效能。举例而言，如实施例5中所述，在施用编码Refacto因子VIII-X5/NG5变体的AAV基因治疗载体之后，与施用编码野生型Refacto因子VIII变体的另外同一基因治疗载体的小鼠相比，在Refacto FVIII多肽的重链的A1结构域中包含五个X5突变和在Refacto FVIII多肽的SQ-接头中包含NG5糖基化肽可使品系E2小鼠中体内外源性因子VIII生物效能增加4.5倍(图12中比较vX5/NG5/CS125与vCS04)。与体内结果一致，在用编码Refacto因子VIII-X5/NG5变体的AAV基因治疗载体感染HepG2细胞之后，与用编码野生型Refacto因子VIII变体的另外同一基因治疗载体的HepG2细胞相比，在Refacto FVIII多肽的重链的A1结构域中包含五个X5突变和在Refacto FVIII多肽的SQ-接头中包含NG5糖基化肽可使体外外源性因子VIII生物效能增加3倍(图12中比较vX5/NG5/CS125与vCS04)。

在一些实施方式中，通过在编码因子VIII变体多肽的多核苷酸序列上游使用人hTTR启动子和一个或多个肝特异性CRM8元件来实现这些优点中的一者或多者。有利地，hTTR启动子和一个或多个肝特异性CRM8元件的使用在体外提高人细胞中外源性表达的因子VIII的生物效能。举例而言，如实施例2中所述，与小鼠TTR启动子和增强子序列的使用相比，hTTR启动子和一个或两个肝特异性CRM8元件的使用分别使HepG2细胞中体内外源性因子VIII生物效能增加约2倍和4倍(图12中比较vCS115和vCS116与vCS04)。

在一些实施方式中，通过移除位于编码因子VIII变体蛋白的AAV基因治疗载体的各种元件之间的外来核苷酸来实现这些优点中的一者或多者。有利地，移除各种元件之间的外来核苷酸在体外提高人细胞中外源性表达的因子VIII的生物效能。举例而言，如实施例6中所述，从编码Refacto因子VIII-X5/NG5变体的vX5/NG5/CS120AAV基因治疗载体移除仅71个核苷酸可使表达的因子VIII变体的体外生物效能提高50％(图14中比较vX5/NG5/CS12与vX5/NG5/CS120)。

在一些实施方式中，通过将X5突变和NG5糖基化肽两者工程化至由密码子改变的因子VIII多肽编码的因子VIII变体多肽中和在编码因子VIII变体多肽的多核苷酸序列上游使用人hTTR启动子和一个或多个肝特异性CRM8元件来实现这些优点中的一者或多者。有利地，使用提高措施的这种组合在体内和体外提高外源性表达的因子VIII的生物效能。举例而言，如实施例6中所述，相对于包含针对编码的野生型Refacto因子VIII具有使用鼠类TTR启动子和增强子序列的相同密码子改变的多核苷酸的AAV基因治疗载体的使用，AAV基因治疗载体中提高措施的这种组合的使用使体内生物效能增加14.5倍(图14中比较vX5/NG5/CS120与vSC04)。与体内结果一致，相对于包括针对编码的野生型Refacto因子VIII具有使用鼠类TTR启动子和增强子序列的相同密码子改变的多核苷酸的AAV基因治疗载体的使用，AAV基因治疗载体中提高措施的这组合的使用使体外生物效能增加17倍(图14中比较vX5/NG5/CS120与vSC04)。如WO2017/083762(其内容特此以引用的方式并入本文中)的表4中所报告，相对于使用野生型编码序列编码Refacto因子VIII多核苷酸的同等基因治疗载体，vCS04载体在体内提供大超过70倍的FVIII生物效能。因此，预期相对于野生型Refacto编码序列的使用，vX5/NG5/CS120基因治疗载体将提供1000倍至1250倍的FVIII生物效能增加。

在一些实施方式中，通过将X5突变和NG5糖基化肽两者工程化至由密码子改变的因子VIII多肽编码的因子VIII变体多肽中，在编码因子VIII变体多肽的多核苷酸序列上游使用人hTTR启动子和一个或多个肝特异性CRM8元件，以及移除位于AAV基因治疗载体的各种元件之间的外来核苷酸来实现这些优点中的一者或多者。有利地，使用提高措施的这种组合在体内和体外提高外源性表达的因子VIII的生物效能。举例而言，如实施例6中所述，相对于包含针对编码的野生型Refacto因子VIII具有使用鼠类TTR启动子和增强子序列的相同密码子改变的多核苷酸的AAV基因治疗载体的使用，AAV基因治疗载体中提高措施的这种组合的使用使体内生物效能增加14倍(图14中比较vX5/NG5/CS12与vSC04)。与体内结果一致，相对于包括针对编码的野生型Refacto因子VIII具有使用鼠类TTR启动子和增强子序列的相同密码子改变的多核苷酸的AAV基因治疗载体的使用，AAV基因治疗载体中提高措施的这种组合的使用使体外生物效能增加24倍(图14中比较vX5/NG5/CS12与vSC04)。如WO2017/083762(其内容特此以引用的方式并入本文中)的表4中所报告，相对于使用野生型编码序列编码Refacto因子VIII多核苷酸的同等基因治疗载体，vCS04载体在体内提供大超过70倍的FVIII生物效能。因此，预期相对于野生型Refacto编码序列的使用，vX5/NG5/CS120基因治疗载体将提供1000倍至1750倍的FVIII生物效能增加。

II.定义

除非另外指定，否则如本文所用，以下术语具有归于它们的含义。

如本文所用，术语“因子VIII”和“FVIII”可互换使用，并且是指例如如使用欧洲药典(European Pharmacopoeia)9.0的第2.7.4中所述的两步显色因子X活化测定所测量，具有因子VIII活性的任何蛋白质(例如活性FVIII，常常称为FVIIIa)或在特定条件下具有因子IXa辅因子活性的蛋白质的蛋白前体(例如前蛋白或前蛋白原)。在一个示例性实施方案中，因子VIII多肽是指具有与野生型因子VIII多肽的重链和轻链具有高序列同一性(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多)的序列的多肽。在一些实施方案中，因子VIII多肽的B-结构域缺失，截短，或替换为接头多肽，以减小编码因子VIII多肽的多核苷酸的尺寸。

野生型因子VIII多肽的非限制性实例包括人前因子VIII原(例如GenBank登录号AAA52485、CAA25619、AAA58466、AAA52484、AAA52420、AAV85964、BAF82636、BAG36452、CAI41660、CAI41666、CAI41672、CAI43241、CAO03404、EAW72645、AAH22513、AAH64380、AAH98389、AAI11968、AAI11970或AAB61261)、对应前因子VIII及其天然变体；猪科前因子VIII原(例如UniProt登录号F1RZ36或K7GSZ5)、对应前因子VIII及其天然变体；小鼠前因子VIII原(例如GenBank登录号AAA37385、CAM15581、CAM26492或EDL29229)、对应前因子VIII及其天然变体；大鼠前因子VIII原(例如GenBank登录号AAQ21580)、对应前因子VIII及其天然变体；大鼠前因子VIII原；以及其他哺乳动物因子VIII同源物(例如猴、猿、仓鼠、豚鼠等)。

如本文所用，因子VIII多肽包含天然变体和具有因子IX辅因子活性的人工构建体。如本公开中所用，因子VIII涵盖保留一些基础因子IX辅因子活性(例如对应野生型活性)的至少5％、10％、25％、50％、75％或更多)的任何天然变体、替代序列、同种型或突变蛋白。

因子VIII变体特别包括在“因子VIII”的定义内，有时还称“变体FVIII”。与人野生型FVIII相比，变体FVIII蛋白具有至少一个氨基酸修饰。在人群体中发现的因子VIII氨基酸变体(相对于FVIII-FL-AA(SEQ ID NO:19))的实例包括不限于S19R、R22T、Y24C、Y25C、L26P/R、E30V、W33G、Y35C/H、G41C、R48C/K、K67E/N、L69P、E72K、D75E/V/Y、P83R、G89D/V、G92A/V、A97P、E98K、V99D、D101G/H/V、V104D、K108T、M110V、A111T/V、H113R/Y、L117F/R、G121S、E129V、G130R、E132D、Y133C、D135G/Y、T137A/I、S138R、E141K、D145H、V147D、Y155H、V159A、N163K、G164D/V、P165S、C172W、S176P、S179P、V181E/M、K185T、D186G/N/Y、S189L、L191F、G193R、L195P、C198G、S202N/R、F214V、L217H、A219D/T、V220G、D222V、E223K、G224W、T252I、V253F、N254I、G255V、L261P、P262L、G263S、G266F、C267Y、W274C、H275L、G278R、G280D、E284K、V285G、E291G/K、T294I、F295L、V297A、N299I、R301C/H/L、A303E/P、I307S、S308L、F312S、T314A/I、A315V、G323E、L326P、L327P/V、C329F、I331V、M339T、E340K、V345A/L、C348R/S/Y、Y365C、R391C/H/P、S392L/P、A394S、W401G、I405F/S、E409G、W412G/R、K427I、L431F/S、R437P/W、I438F、G439D/S/V、Y442C、K444R、Y450D/N、T454I、F455C、G466E、P470L/R/T、G474E/R/V、E475K、G477V、D478N、T479R、F484C、A488G、R490G、Y492C/H、Y492H、I494T、P496R、G498R、R503H、G513S/V、I522Y、K529E、W532G、P540T、T541S、D544N、R546W、R550C/G/H、S553P、S554C/G、V556D、R560T、D561G/H/Y、I567T、P569R、S577F、V578A、D579A/H、N583S、Q584H/K/R、I585R/T、M586V、D588G/Y、L594Q、S596P、N601D/K、R602G、S603I/R、W604C、Y605H/S、N609I、R612C、N631K/S、M633I、S635N、N637D/I/S、Y639C、L644V、L650F、V653A/M、L659P、A663V、Q664P、F677L、M681I、V682F、Y683C/N、T686R、F698L、M699T/V、M701I、G705V、G710W、N713I、R717L/W、G720D/S、M721I/L、A723T、L725Q、V727F、E739K、Y742C、R795G、P947R、V1012L、E1057K、H1066Y、D1260E、K1289Q、Q1336K、N1460K、L1481P、A1610S、I1698T、Y1699C/F、E1701K、Q1705H、R1708C/H、T1714S、R1715G、A1720V、E1723K、D1727V、Y1728C、R1740G、K1751Q、F1762L、R1768H、G1769R、L1771P、L1775F/V、L1777P、G1779E/R、P1780L、I1782R、D1788H、M1791T、A1798P、S1799H、R1800C/G/H、P1801A、Y1802C、S1803Y、F1804S、L1808F、M1842I、P1844S、T1845P、E1848G、A1853T/V、S1858C、K1864E、D1865N/Y、H1867P/R、G1869D/V、G1872E、P1873R、L1875P、V1876L、C1877R/Y、L1882P、R1888I、E1894G、I1901F、E1904D/K、S1907C/R、W1908L、Y1909C、A1939T/V、N1941D/S、G1942A、M1945V、L1951F、R1960L/Q、L1963P、S1965I、M1966I/V、G1967D、S1968R、N1971T、H1973L、G1979V、H1980P/Y、F1982I、R1985Q、L1994P、Y1998C、G2000A、T2004R、M2007I、G2013R、W2015C、R2016P/W、E2018G、G2022D、G2028R、S2030N、V2035A、Y2036C、N2038S、2040Y、G2045E/V、I2051S、I2056N、A2058P、W2065R、P2067L、A2070V、S2082N、S2088F、D2093G/Y、H2101D、T2105N、Q2106E/P/R、G2107S、R2109C、I2117F/S、Q2119R、F2120C/L、Y2124C、R2135P、S2138Y、T2141N、M2143V、F2145C、N2148S、N2157D、P2162L、R2169C/H、P2172L/Q/R、T2173A/I、H2174D、R2178C/H/L、R2182C/H/P、M2183R/V、L2185S/W、S2192I、C2193G、P2196R、G2198V、E2200D、I2204T、I2209N、A2211P、A2220P、P2224L、R2228G/L/P/Q、L2229F、V2242M、W2248C/S、V2251A/E、M2257V、T2264A、Q2265R、F2279C/I、I2281T、D2286G、W2290L、G2304V、D2307A、P2319L/S、R2323C/G/H/L、R2326G/L/P/Q、Q2330P、W2332R、I2336F、R2339T、G2344C/D/S和C2345S/Y。因子VIII蛋白还包含含有翻译后修饰的多肽。

一般地，编码因子VIII的多核苷酸编码进行翻译后加工以形成活性因子VIII蛋白(例如FVIIIa)的非活性单链多肽(例如前蛋白原)。举例而言，参看图15，首先使野生型人因子VIII前蛋白原裂解以释放编码的信号肽(未示)，形成第一单链前蛋白(示为“人野生型FVIII”)。接着使前蛋白在B结构域与A3结构域之间裂解，以形成包含因子VIII重链(例如A1和A2结构域)和B-结构域的第一多肽，和包含因子VIII轻链(例如包含A3、C1和C3结构域)的第二多肽。进一步使第一多肽裂解以移除B-结构域，并且还分离A1和A2结构域，在成熟因子VIIIa蛋白中A1和A2结构域保持与因子VIII轻链缔合。关于因子VIII成熟过程的综述，参见Graw等人,Nat Rev Genet.,6(6):488-501(2005)，其内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文中。

如本文所用，术语“因子VIII重链”或简称“重链”是指因子VIII多肽的A1和A2结构域的聚集体。在一个示例性实施方案中，hFVIII-FL-AA(SEQ ID NO:39)的氨基酸20-759构成因子VIII重链。

如本文所用，术语“因子VIII轻链”或简称“轻链”是指因子VIII多肽的A3、C1和C2结构域的聚集体。在一个示例性实施方案中，hFVIII-FL-AA(SEQ ID NO:39)的氨基酸1668-2351构成因子VIII轻链。在一些实施方案中，因子VIII轻链不包含酸性a3肽，其在体内成熟期间释放。

一般地，因子VIII重链和轻链可表示为单一多肽链，例如与任选的B-结构域或B-结构域取代的接头一起。然而，在一些实施方案中，因子VIII重链和因子VIII轻链可表示为单独多肽链(例如共同表达)，并且重构以形成因子VIII蛋白(例如在体内或体外)。

如本文所用，术语“B-结构域取代的接头”和“因子VIII接头”可互换使用，并且是指野生型因子VIII B-结构域的截短型式(例如hFVIII-FL-AA(SEQ ID NO:39)的氨基酸760-1667))或经工程化以替代因子VIII多肽的B-结构域的肽。如本文所用，因子VIII接头位于根据一些实施方案的因子VIII变体多肽中因子VIII重链的C末端与因子VIII轻链的N末端之间。B-结构域取代的接头的非限制性实例公开于美国专利号4,868,112、5,112,950、5,171,844、5,543,502、5,595,886、5,610,278、5,789,203、5,972,885、6,048,720、6,060,447、6,114,148、6,228,620、6,316,226、6,346,513、6,458,563、6,924,365、7,041,635和7,943,374；美国专利申请公布号2013/024960、2015/0071883和2015/0158930；以及PCT公布号WO 2014/064277号和WO 2014/127215，其公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文中。

除非本文中另作说明，因子VIII氨基酸的编号是指在图16中呈SEQ ID NO:39呈现的全长野生型人因子VIII序列(hFVIII-FL-AA)中的对应氨基酸。因而，当提及本文公开的因子VIII变体蛋白中的氨基酸取代时，所述氨基酸编号是指全长野生型因子VIII序列中的类似(例如在结构上或功能上等效)和/或同源(例如在最初氨基酸序列中进化保守)氨基酸。举例而言，T2105N氨基酸取代是指在全长野生型人因子VIII序列(hFVIII-FL-AA；SEQID NO:39)的位置2105上的T至N取代、在由CS12编码的因子VIII变体蛋白(CS12-FL-AA；SEQID NO:2)的位置1218上的T至N取代。

如本文所述，因子VIII氨基酸编号系统取决于包含因子VIII信号肽(例如全长野生型人因子VIII序列的氨基酸1-19)。在包含信号肽的情况下，编号称为“包含信号肽”或“SPI”。在不包含信号肽的情况下，编号称为“不包含信号肽”或“SPE”。举例而言，F328S为SPI编号，在SPE编号中相同氨基酸为F309S。除非另外指示，否则所有氨基酸编号是指在图16中呈SEQ ID NO:39呈现的全长野生型人因子VIII序列(hFVIII-FL-AA)中的对应氨基酸。

如本文所述，与由天然编码的因子VIII构建体(例如使用野生型人密码子编码相同因子VIII构建体的多核苷酸)提供的因子VIII表达的水平相比，密码子改变的多核苷酸使体内转基因因子VIII的表达增加(例如当作为基因治疗载体的一部分施用时)。如本文所用，术语“表达增加”是指与施用天然编码的因子VIII构建体的动物的血液中转基因因子VIII活性的水平相比，施用编码因子VIII的密码子改变的多核苷酸的动物的血液中的转基因因子VIII活性的水平增加。可使用本领域中已知的任何因子VIII活性，例如欧洲药典9.0的第2.7.4章中所述的两步显色因子X活化测定测量活性水平。用于测定因子VIII活性的示例性测定是Technochrome FVIII测定(Technoclone,Vienna,Austria)。

在一些实施方案中，生物利用率增加是指与施用天然编码的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的转基因因子VIII多肽的水平相比，施用密码子改变的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的转基因因子VIII多肽大至少25％。在一些实施方案中，生物利用率增加是指与施用包含相同或不同的密码子改变的因子VIII多核苷酸的不同基因治疗载体的动物的血液中的转基因因子VIII多肽的水平相比，施用包含密码子改变的因子VIII多核苷酸的改进基因治疗载体的动物的血液中的转基因因子VIII多肽大至少25％。在一些实施方案中，表达增加是指施用密码子改变的因子VIII多核苷酸的动物的血液中转基因因子VIII活性大至少50％、至少75％、至少100％、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍、至少175倍、至少200倍、至少225倍或至少250倍。

本文中“因子VIII活性”意指经由野生型因子IX中Arg194-Ile195肽键的水解，促进因子X多肽由因子IXa、例如因子IXa辅因子活性裂解的能力，因此使因子X活化成因子Xa。可使用本领域中已知的任何因子VIII活性测量活性水平；本文中概述合适的测定。用于测定因子VIII活性的示例性测定为欧洲药典9.0的第2.7.4章中所述的两步显色因子X活化测定。

如本文所用，术语“生物效能”是指体内受试者血液中或体外细胞培养上清液中因子VIII活性的量。在一些实施方案中，生物效能将指每单位体积的活性的量，诸如体内每毫升血液或体外每毫升细胞培养上清液的因子XIa辅因子活性单位。在一些实施方案中，生物效能将表示为相对于第一水平，例如天然编码的因子VIII蛋白或密码子优化的天然因子VIII(例如‘野生型’Refecto FVIII蛋白)的增加倍数。在一些实施方案中，如本文所用，外源性表达的因子VIII的生物效能是指由从基因治疗载体表达的重组因子VIII蛋白提供的因子VIII活性的量。即，相比于天然因子VIII活性的任何基线量的血液或细胞培养上清液中因子VIII活性的量。因此，通过增加外来因子VIII蛋白的表达水平和/或增加外来因子VIII蛋白的比活性，例如通过包含赋予更大比活性的氨基酸取代(诸如X5突变)中的一者或两者，可实现生物效能的增加。

在一些实施方案中，例如代替因子VIII表达和/或生物利用率增加或除此之外，通过施用因子VIII多核苷酸的动物的血液中因子VIII活性的增加来评估因子VIII多核苷酸组合物的治疗潜能。在一些实施方案中，如本文所用，因子VIII活性增加是指施用密码子改变的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的因子VIII活性相对于施用密码子改变的因子VIII多核苷酸之前动物的血液中的基线因子VIII活性的增加比施用天然编码的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的因子VIII活性相对于施用天然编码的因子VIII多核苷酸之前动物的血液中的基线因子VIII活性的增加大。在一些实施方案中，因子VIII活性增加是指施用密码子改变的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的因子VIII活性相对于施用密码子改变的因子VIII多核苷酸之前动物的血液中的因子VIII活性的基线水平的增加比施用天然编码的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的因子VIII活性水平相对于施用天然编码的因子VIII多核苷酸之前动物中的因子VIII活性的基线水平的增加大至少25％。在一些实施方案中，因子VIII活性增加是指施用包含密码子改变的因子VIII多核苷酸的改进基因治疗载体的动物的血液中的因子VIII活性相对于施用所述改进基因治疗载体之前动物的血液中的因子VIII活性的基线水平的增加比施用包含相同或不同的密码子改变的因子VIII多核苷酸的不同基因治疗载体的动物的血液中的因子VIII活性水平相对于施用所述不同基因治疗载体之前动物中的因子VIII活性的基线水平的增加大至少25％。在一些实施方案中，因子VIII活性增加是指施用密码子改变的因子VIII多核苷酸的动物的血液中的因子VIII活性相对于施用密码子改变的因子VIII多核苷酸之前动物的血液中的因子VIII活性的基线水平的增加比施用天然编码的因子VIII多核苷酸或包含相同或不同的密码子改变的因子VIII多核苷酸的不同基因治疗载体的动物的血液中的因子VIII活性水平相对于施用天然编码的因子VIII多核苷酸或包含相同或不同的密码子改变的因子VIII多核苷酸的不同基因治疗载体之前动物的血液中的因子VIII活性的基线水平的增加大至少50％、至少75％、至少100％、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍、至少175倍、至少200倍、至少225倍或至少250倍。如本文所述，使用欧洲药典9.0第2.7.4章中所述的两步显色因子X活化测定测量活性。

如本文所述，与由天然编码的因子VIII构建体(例如使用野生型人密码子编码相同因子VIII构建体的多核苷酸)提供的载体产生水平相比，密码子改变的多核苷酸使载体产生增加。如本文所用，术语“病毒产生增加”是指与接种天然编码的因子VIII构建体的细胞培养物中的载体产率相比，接种密码子改变的编码因子VIII的多核苷酸的细胞培养物中的载体产率(例如每升培养物的效价)增加。可使用本领域中已知的任何载体效价测定测量载体产率。用于测定载体产率(例如AAV载体)的示例性测定为靶向AAV2反向末端重复序列的qPCR(Aurnhammer,Human Gene Therapy Methods:Part B 23:18-28(2012))。

在一些实施方案中，病毒产生增加是指密码子改变的载体产率比相同类型培养物中天然编码的因子VIII构建体的产率大至少25％。在一些实施方案中，病毒产生增加是指包含密码子改变的因子VIII多核苷酸的改进载体比包含相同或不同的密码子改变的因子VIII多核苷酸的不同载体的产率大至少25％。在一些实施方案中，载体产生增加是指密码子改变的载体产率大至少50％、至少75％、至少100％、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。

如本文所用，术语“血友病”是指广义上，特征在于血液凝固或凝血减少的一组疾病病况。血友病可指A型、B型或C型血友病或所有三种疾病类型的复合疾病。A型血友病(A型血友病)由因子VIII(FVIII)活性减少或丧失引起，并且在血友病亚型中最突出。B型血友病(B型血友病)由因子IX(FIX)凝血功能丧失或减少引起。C型血友病(C型血友病)是因子XI(FXI)凝血活性丧失或减少的结果。A型血友病和B型血友病是X连锁疾病，而C型血友病是常染色体疾病。用于血友病的常规治疗包括诸如FVIII、FIX(包括)和FXI的凝血因子以及FEIBA-VH、去胺加压素(desmopressin)和血浆输注的预防性与根据需求施用。

如本文所用，术语“FVIII基因治疗”包括向患者提供编码因子VIII的核酸以减轻、减少与血友病相关的一种或多种症状(例如临床因素)或预防其复发的任何治疗方法。所述术语涵盖施用包含编码因子VIII分子，包括因子VIII的任何经修饰形式(例如因子VIII变体)的核酸的任何化合物、药物、程序或方案，以维持或改善患有血友病的个体的健康。本领域的技术人员将了解，FVIII疗法的过程或FVIII治疗剂的剂量可例如基于根据本发明获得的结果变化。

如本文所用，术语“因子VIII基因治疗”或“FVIII基因治疗”包括向患者提供编码因子VIII多肽的核酸以减轻、减少与因子VIII缺乏症(例如A型血友病)相关的一种或多种症状(例如临床因素)或预防其复发的任何治疗方法。所述术语涵盖施用包含编码因子VIII分子，包括因子VIII的任何经修饰形式(例如具有X5突变、B-结构域缺失和/或插入B-结构域接头多肽中的糖基化肽的因子VIII变体)的核酸的任何化合物、药物、程序或方案，以维持或改善患有因子VIII缺乏症(例如A型血友病)的个体的健康。本领域的技术人员将了解，FVIII基因治疗的过程或FVIII基因治疗的剂量可例如基于根据本发明获得的结果变化。

如本文所用，术语“绕道疗法”包括向患者提供非因子VIII止血剂、化合物或凝血因子以减轻、减少与血友病相关的一种或多种症状(例如临床因素)或预防其复发的任何治疗方法。非因子VIII化合物和凝血因子包括但不限于因子VIII抑制剂绕道活性(FEIBA)、重组活化因子VII(FVIIa)、凝血酶原复合物浓缩物和活化凝血酶原复合物浓缩物。这些非因子VIII化合物和凝血因子可为重组的或源于血浆。本领域的技术人员将了解，绕道疗法的过程或绕道疗法的剂量可例如基于根据本发明获得的结果变化。

如本文所用，包括编码因子VIII分子的核酸和常规A型血友病治疗剂的施用的“组合疗法”包括向患者提供编码因子VIII分子的核酸与因子VIII分子和/或非因子VIII止血剂(例如绕道治疗剂)以减轻、减少与血友病相关的一种或多种症状(例如临床因素)或预防其复发的任何治疗方法。所述术语涵盖施用包括编码因子VIII分子，包括因子VIII的任何经修饰形式的核酸的任何化合物、药物、程序或方案，其可用于维持或改善患有血友病的个体的健康病且包括本文所述的任一治疗剂。

术语“治疗有效量或剂量”或“治疗充足量或剂量”或“有效或充足量或剂量”是指产生施用其所要实现的治疗作用的剂量。举例而言，可用于治疗血友病的药物的治疗有效量可以是能够预防或减轻与血友病相关的一种或多种症状的量。

在一些实施方案中，治疗学上有效治疗引起受试者中出血事件的频率和/或严重度下降。

在一些实施方案中，治疗学上有效治疗引起患者血流中的因子VIII活性相比于治疗之前的活性增加。

如本文所用，术语“基因”是指编码多肽链的DNA分子的区段(例如编码区)。在一些实施方案中，基因由紧靠编码区域之前、之后和/或插入编码区的与产生多肽链相关的区域(例如诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化序列、5’未翻译区、3’未翻译区或内含子的调控元件)定位。

如本文所用，术语“调控元件”是指诸如启动子、增强子、终止子、聚腺苷酸化序列、内含子等提供编码序列在细胞中的表达的核苷酸序列。

如本文所用，术语“启动子元件”是指帮助控制编码序列的表达的核苷酸序列。一般地，启动子元件位于基因的翻译起始位点的5’。然而，在某些实施方案中，启动子元件可位于内含子序列内或编码序列的3’。在一些实施方案中，可用于基因治疗载体的启动子源自于靶蛋白(例如因子VIII启动子)的天然基因。在一些实施方案中，可用于基因治疗载体的启动子对在靶生物体的特定细胞或组织中表达具有特异性(例如肝特异性启动子)。在其他实施方案中，多个充分表征的启动子元件中的一者用于本文所述的基因治疗载体。充分表征的启动子元件的非限制性实例包括CMV早期启动子、β-肌动蛋白启动子和甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子。在一些实施方案中，启动子为组成型启动子，其驱动靶蛋白的基本上恒定表达。在其他实施方案中，启动子为诱导型启动子，其驱动靶蛋白响应于特定刺激物(例如暴露于特定治疗或剂)的表达。关于设计用于AAV介导的基因治疗的启动子的综述，参见Gray等人(Human Gene Therapy 22:1143-53(2011))，其内容出于所有目的以引用的方式整体明确并入本文中。

如本文所用，“CRM8元件”是指源自于SERPINA1基因(NCBI登录号NM_000295.4)的顺式作用的调控模块，其以肝特异性方式增强可操作地连接的基因、例如编码因子VIII多肽的序列的表达，与SEQ ID NO:5具有高度序列同一性。在一些实施方案中，CRM8元件与SEQID NO:5同一。如本文所用，CRM8元件是指调控元件的单一拷贝，在一些实施方案中，其包括于因子VIII多核苷酸内的一个或多个拷贝、例如1个、2个、3个或更多个拷贝中。关于CRM元件、诸如CRM8的进一步信息，参见Chuah MK等人,Mol Ther.,22(9):1605-13(2014)，其以引用的方式并入本文中。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一参考核苷酸序列(例如基因)与第二核苷酸序列(例如调控控制元件)之间的关系，所述关系允许第二核苷酸序列影响一种或多种与第一参考核苷酸序列相关的性质(例如转录速率)。在本发明的上下文中，当调控元件位于基因治疗载体内以使得其对因子VIII转基因的转录发挥作用(例如促进性或组织选择性作用)时，调控控制元件可操作地连接于因子VIII转基因。

如本文所用，术语“载体”是指用于将核酸(例如编码因子VIII基因治疗构建体)转移至宿主细胞中的任何媒介物。在一些实施方案中，载体包括复制子，复制子用于复制媒介物以及靶核酸。可用于基因治疗的非限制性实例包括质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体和病毒，其充当体内自主复制单元。在一些实施方案中，载体为用于引入靶核酸(例如编码因子VIII变体的密码子改变的多核苷酸)的病毒媒介物。本领域中已知可用于基因治疗的许多经修饰的真核病毒。举例而言，腺相关病毒(AAV)尤其非常适用于人基因治疗中，因为人是所述病毒的天然宿主，已知所述天然病毒不引起任何疾病，并且所述病毒引发轻度免疫应答。

如本文所用，术语“因子VIII病毒载体”是指包含编码因子VIII多肽的因子VIII多核苷酸的重组病毒，其在引入合适动物宿主(例如人)中时足够表达因子VIII多肽。编码因子VIII多肽的密码子改变的因子VIII多核苷酸插入病毒基因组中的重组病毒特别包括在因子VIII病毒载体的定义内。病毒的天然基因组替代为编码因子VIII多肽的因子VIII多核苷酸的重组病毒也特别包括在因子VIII病毒载体的定义内。包含编码具有X5突变、B-结构域缺失和/或插入B-结构域接头多肽中的糖基化肽的因子VIII变体的因子VIII多核苷酸的重组病毒包括在因子VIII病毒载体的定义内。

如本文所用，术语“因子VIII病毒颗粒”是指包封编码因子VIII多肽的因子VIII多核苷酸的病毒颗粒，其在引入合适动物宿主(例如人)中时对表达因子VIII多肽具有特异性。包封已插入编码因子VIII多肽的密码子改变的因子VIII多核苷酸的基因组的重组病毒颗粒特别包括在因子VIII病毒颗粒的定义内。包封编码因子VIII多肽的因子VIII多核苷酸替换病毒的天然基因组的重组病毒颗粒也特别包括在因子VIII病毒颗粒的定义内。包封编码具有X5突变、B-结构域缺失和/或插入B-结构域接头多肽中的糖基化肽的因子VIII变体的因子VIII多核苷酸的重组病毒颗粒包括在因子VIII病毒颗粒的定义内。

本文中“AAV”或“腺相关病毒”意指病毒的细小病毒科(Parvoviridae genus)内的依赖病毒(Dependoparvovirus)。如本文所用，AAV可指源自于已插入因子VIII多核苷酸的天然存在的“野生型”AAV基因组的病毒、源自于使用由天然存在的AAV cap基因编码的衣壳蛋白包装至衣壳中的重组因子VIII多核苷酸的重组病毒或源自于使用由非天然衣壳cap基因编码的衣壳蛋白包装至衣壳中的重组因子VIII多核苷酸的重组病毒。AAV定义内包括包封因子VIII多核苷酸的AAV类型1(AAV1)、AAV类型2(AAV2)、AAV类型3(AAV3)、AAV类型4(AAV4)、AAV类型5(AAV5)、AAV类型6(AAV6)、AAV类型7(AAV7)、AAV类型8(AAV8)和AAV类型9(AAV9)病毒和由一种或多种包封因子VIII多核苷酸的变体AAV衣壳蛋白形成的病毒。

本文中“AAV8”、“AAV-8”或“AAV血清8型”意指由包封因子VIII多核苷酸的AAV8衣壳病毒蛋白形成的病毒。

如本文所用，术语“CpG”是指沿着DNA的单一链的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸，其中“p”表示两者之间的磷酸酯键联。

如本文所用，术语“CpG岛”是指具有统计学增加的密度的CpG二核苷酸的多核苷酸内的区域。如本文所用，如果在200碱基对窗口上，多核苷酸(例如编码密码子改变的因子VIII蛋白的多核苷酸)的区域如下，则为CpG岛：(i)所述区域具有超过50％的GC含量；和(ii)如以下关系所定义，每一预期CpG二核苷酸所观察到的CpG二核苷酸的比率为至少0.6：

关于鉴别CpG岛的方法的额外信息，参见Gardiner-Garden M.等人,J Mol Biol.,196(2):261-82(1987)，其内容出于所有目的明确地以引用的方式整体并入本文中。

如本文所用，术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物以及其互补物。所述术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键联的核酸，其为合成、天然存在和非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸，包括由遗传密码编码的氨基酸,以及随后经修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、y-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。天然存在的氨基酸可包括例如D-氨基酸和L-氨基酸。在本文中氨基酸可通过其通常已知的三字母符号提及，或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号提及。同样地，核苷酸可通过其通常公认的单字母代码提及。

本文中“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或化学连接于蛋白质的部分的改变。举例而言，修饰可为改变的碳水化合物或附接于蛋白质的PEG结构。本文中“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另作说明，否则氨基酸修饰始终为针对DNA进行编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20种氨基酸。

本文中“氨基酸取代”或“取代”意指亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸经不同氨基酸替代。特别地，在一些实施方案中，取代为在所述特定位置处非天然存在，在生物体内或任何生物体中非天然存在的氨基酸。举例而言，取代G151K是指变体多肽，其中位置151处的甘氨酸替换为赖氨酸。为清楚起见，经工程化以改变核酸编码序列而非改变起始氨基酸(例如CGG(编码精氨酸)换成CGA(仍然编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质并非“氨基酸取代”；即，尽管建立编码相同蛋白质的新基因，但如果所述蛋白质在其开始的特定位置处具有相同氨基酸，则其不为氨基酸取代。因此，相对于表达产物而非相对于实际基因治疗构建体，在每个所述序列中暗含编码相同多肽的核酸的每种变型。

如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指氨基酸序列添加在亲本多肽序列中的特定位置处。举例而言，-233E或233E表示在位置233之后和在位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和在位置234之前插入AlaAspGlu。

如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指移除亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸序列。举例而言，E233-或E233#、E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示在位置233开始的序列GluAspAla缺失。在两个或更多个核酸或肽序列的情况下术语“同一”或“同一性百分比”是指如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，利用以下描述的默认参数，或通过手动比对和目测检查所测量，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即当针对在比较窗口或指定区域上的最大对应而进行比较和比对时，在指定区域上约60％同一性、优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)。

如本领域中已知，许多不同程序可用于鉴定蛋白质(或如以下论述，核酸)是否与已知序列具有序列同一性或相似性。序列同一性/或相似性使用本领域中已知的标准技术测定，所述标准技术包括但不限于：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)的局部序列同一性算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)的序列同一性比对算法；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444(1988)的相似性搜索算法；这些算法的计算机实施方式(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,WI)；Devereux等人,Nucl.AcidRes.,12:387-395(1984)描述的最佳拟合序列程序，优选使用默认设置或通过检查。优选地，同一性百分比通过FastDB基于以下参数计算：错配罚分1；空位罚分1；空位尺寸罚分0.33；和接合罚分30，“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis”,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,第127-149页(1988),Alan R.Liss公司，均以引用的方式并入。

有用算法的实例为PILEUP。PILEUP使用渐进成对比对从一组相关序列建立多重序列比对。其还可绘出展示用于产生比对的群集关系的树。PILEUP使用Feng和Doolittle,J.Mol.Evol.35:351-360(1987)的渐进比对方法的简化；所述方法类似于Higgins和SharpCABIOS5:151-153(1989)所述的方法，两者以引用的方式并入。有用PILEUP参数包括3.00的默认空位权重、0.10的默认空位长度权重和加权末端空位。

有用算法的另一实例为以下中描述的BLAST算法：Altschul等人,J.Mol.Biol.215,403-410,(1990)；Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；和Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5787(1993)，两者以引用的方式并入。一种尤其有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序，其获自Altschul等人.,Methodsin Enzymology,266:460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html]。WU-BLAST-2使用若干搜索参数，大部分参数设定成默认值。可调参数设定成以下值：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数为动态值，并且通过程序本身建立，取决于序列的组成和目标序列正搜索的特定数据库的组成；然而，可调节所述值以增加灵敏度。

一种额外有用算法为空位BLAST，如Altschul等人,Nucl.Acids Res.,25:3389-3402所报告，以引用的方式并入。空位BLAST使用BLOSUM-62取代分数；阈值T参数设定为9；触发无空位延伸的双命中法；k的空位长度加上10+k的代价；Xu设定成16，并且对于数据库搜索阶段，Xg设定成40，并且对于算法输出阶段，设定成67。空位比对由对应于约22位的分数触发。

氨基酸序列同一性％值通过匹配同一残基数目除以比对区域中“较长”序列的残基总数来确定。“较长”序列为在比对区域中具有最有效残基的序列(忽略通过WU-Blast-2引入以最大化比对分数的空位)。以类似方式，关于所鉴定多肽的编码序列的“核酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与细胞周期蛋白的编码序列中的核苷酸残基同一的核苷酸残基的百分比。优选方法利用设定成默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其中重叠跨度和重叠分数分别设定为1和0.125。

比对可包括待比对的序列中引入空位。此外，对于含有比由图1的序列(SEQ IDNO:1)编码的蛋白质更多或更少氨基酸的序列，应了解在一个实施方案中，序列同一性百分比将基于相对于氨基酸或核苷酸总数的同一氨基酸或核苷酸的数目确定。因此，举例而言，如以下所论述，在一个实施方案中，比图1中所示序列(SEQ ID NO:1)短的序列的序列同一性将使用较短序列中的核苷酸数目确定。在同一性百分比计算中，未分配序列变异的各种表达形式、诸如插入、缺失、取代等以相对权重。

在一个实施方案中，仅同一性为正分数(+1)，并且包括空位的序列变体的所有形式均分配值“0”，这排除如下所述用于序列相似性计算的加权尺度或参数的必要。序列同一性百分比可例如通过将匹配同一残基数目除以比对区域中“较短”序列的残基总数且乘以100来计算。“较长”序列为在比对区域中具有最有效残基的序列。

术语“等位基因变体”是指在特定基因座处基因的多态形式，以及源自于基因的mRNA转录产物的cDNA和由其编码的多肽。术语“优选哺乳动物密码子”是指来自在哺乳动物细胞中表达的蛋白质中最常使用的编码氨基酸的密码子组的密码子子集，如选自以下列表：Gly(GGC、GGG)；Glu(GAG)；Asp(GAC)；Val(GTG、GTC)；Ala(GCC、GCT)；Ser(AGC、TCC)；Lys(AAG)；Asn(AAC)；Met(ATG)；Ile(ATC)；Thr(ACC)；Trp(TGG)；Cys(TGC)；Tyr(TAT、TAC)；Leu(CTG)；Phe(TTC)；Arg(CGC、AGG、AGA)；Gln(CAG)；His(CAC)；和Pro(CCC)。

如本文所用，术语密码子改变是指编码多肽(例如因子VIII变体蛋白)的多核苷酸序列，其中编码多肽的天然多核苷酸的至少一个密码子已改变以改善多核苷酸序列的性质。在一些实施方案中，改善的性质有助于增加编码多肽的mRNA的转录，增加mRNA的稳定性(例如改善mRNA半衰期)，增加多肽翻译，和/或增加载体内多核苷酸的包装。可用于实现改善的性质的改变的非限制性实例包括改变特定氨基酸的密码子的使用率和/或分布；调整整体和/或局部GC含量；移除富含AT的序列；移除重复序列元件；调整整体和/或局部CpG二核苷酸含量；移除隐藏调控元件(例如TATA框和CCAAT框元件)；移除内含子/外显子剪接位点；改善调控序列(例如引入Kozak共有序列(Kozak consensus sequence))；和移除转录mRNA中能够形成二级结构(例如茎环)的序列元件。

如本文中所论述，存在各种命名法来提及本文中的公开内容的组分。“CS-编号”(例如“CS12”、“CS04”等)是指编码FVIII多肽的密码子改变的多核苷酸和/或编码多肽，包括变体。举例而言，CS12-FL是指全长的密码子改变的CS12多核苷酸序列或由CS12多核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文中氨基酸序列有时称为“CS12-FL-AA”且核酸序列有时称为“CS12-FL-NA”)。类似地，“CS12-LC”是指编码FVIII多肽的轻链的密码子改变的核酸序列(“CS12-LC-NA”)或由CS12多核苷酸序列编码的FVIII轻链的氨基酸序列(本文中有时还称为“CS12-LC-AA”)。同样地，CS12-HC、CS12-HC-AA和CS12-HC-NA对FVIII重链而言系相同的。如本领域的技术人员所了解，对于诸如CS04的仅密码子改变的构建体(例如其与Refacto相比不含有额外氨基酸取代)，氨基酸序列将同一，因为氨基酸序列未通过密码子优化改变。因此，本发明的序列构建体包括但不限于CS12-FL-NA、CS12-FL-AA、CS12-LC-NA、CS12-LC-AA、CS12-HC-AA和CS12-HC-NA。

这种命名法还适用于糖基化肽，如图8所示，以使得“NG1-AA”是指氨基酸序列且NG1-NA是指核酸序列。

本公开还包括额外新因子VIII变体，如下所述，利用适当命名法。

如本文所用，术语“肝特异性表达”是指与其他组织中相比，肝组织中特定基因(例如密码子改变的转基因因子VIII基因)的优先或主要体内表达。在一些实施方案中，肝特异性表达意指特定基因全部表达的至少50％发生在受试者的肝组织内。在其他实施方案中，肝特异性表达意指特定基因全部表达的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％发生在受试者的肝组织内。因此，肝特异性调控元件为驱动基因在肝组织中的肝特异性表达的调控元件。

如本文所用，术语“少于”X和“少于”X％是指从0至X的范围，不包括值X，例如0％至X％，不包括X％。如本文所用，所述术语与以0或0％开始至(但不包括)X或X％的范围可互换使用。

如本文所用，术语“至多X”或“至多X％”是指从0至X的范围，包括值X，例如0％至X％，包括X％。如本文所用，所述术语与以0或0％开始至且包括X或X％的范围可互换使用。

如本文所用，术语“超过X”或“超过X％”是指从X至上限的范围，不包括值X，例如X％至100％，不包括X％。如本文所用，所述术语与以X或X％(但不包括X或X％)开始至上限(在百分比的情况下为100％)的范围可互换使用。

如本文所用，术语“至少X”或“至少X％”是指从X至上限的范围，包括值X，例如X％至100％，包括X％。如本文所用，所述术语与以X或X％开始(且包括X或X％)至上限(在百分比的情况下为100％)的范围可互换使用。

如本文所用，术语“介于‘X’与‘Y’之间”、“”介于‘X’％与‘Y’％之间、“‘X’至‘Y’”和“‘X’％至‘Y’％”是指X至Y的范围，包括值X和Y，例如X％至Y％，包括X％和Y％。如本文所用，所述术语与以X或X％开始至且包括Y或Y％的范围可互换使用。

III.密码子改变的因子VIII多核苷酸

在一些实施方案中，本公开提供编码因子VIII变体的密码子改变的多核苷酸。这些密码子改变的多核苷酸在基于AAV的基因治疗构建体中施用时显著提高因子VIII生物效能(例如活性)。与常规密码子优化的构建体相比，密码子改变的多核苷酸还显示提高的AAV-病毒体包装。

野生型因子VIII与19氨基酸的信号肽(SEQ ID NO:39的氨基酸1-19)一起编码，在因子VIII活化前所述信号肽从编码多肽裂解。如本领域的技术人员所了解，在不影响在通过细胞加工移除信号肽之后留下的成熟多肽的序列下，因子VIII信号肽可突变，被来自其他基因或来自其他生物体的因子VIII基因的信号肽替代，或完全移除。

因此，在一些实施方案中，本文提供的密码子改变的多核苷酸(例如核酸组合物)具有编码因子VIII重链和轻链的与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)的部分具有高度序列同一性的核苷酸序列，和短的14氨基酸的B-结构域取代的接头(例如含有弗林蛋白酶裂解位点以促进体内活性FVIIIa蛋白成熟的“SQ”接头)，其还包含五个“X5”突变中的一个或多个(例如相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P突变中的一个、两个、三个、四恶或全部五个(SPI编号；(SPE编号分别为I86V/A108S/G132K/M147T/L152P)))和/或插入B-结构域取代接头(例如SQ接头)中的短糖基化肽(例如NG5；SEQ ID NO:15)。

具体地，X5突变组是基于如下事实：当在HEK293细胞中表达时在B-结构域缺失基因治疗构建体中猪科氨基酸82-176取代对应人氨基酸增加因子VIII活性(W.Xiao,communication)。单个猪科氨基酸回复突变成人BDD-FVIII构建体鉴别出A1结构域内促进此现象的五个氨基酸：I105V、A127S、G151K、M166T和L171P(SPI)。这些突变的组合引入人构建体中提高较大猪科取代的活性(W.Xiao,communication)。因此，在一些实施方案中，编码的因子VIII多肽包含选自I105V、A127S、G151K、M166T和L171P的一个或多个氨基酸取代，其中整个5氨基酸组在许多实施方案中特别有用。

CS12密码子改变的多核苷酸

在一些实施方案中，本文提供的核酸组合物包含密码子改变的因子VIII多核苷酸，所述密码子改变的因子VIII多核苷酸具有与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有高度序列同一性的核苷酸序列且编码具有人因子VIII重链和轻链的因子VIII多肽，和短的14氨基酸的B-结构域取代的接头(“SQ”接头)，所述接头含有弗林蛋白酶裂解位点以促进体内活性FVIIIa蛋白成熟，其中因子VIII多肽的重链包括五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V、A127S、G151K、M166T和L171P(SPI))，和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQID NO:15)。

在一些实施方案中，因子VIII多核苷酸具有与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少96％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少97％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少98％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99.5％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少99.9％同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)同一。

在一些实施方案中，由密码子改变的多核苷酸编码的因子VIII变体具有与CS12-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有高度序列同一性的氨基酸序列，其包括五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，编码的因子VIII变体的氨基酸序列与CS12-FL-AA(SEQ IDNO:2)具有至少97％同一性，其包括五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，编码的因子VIII变体的氨基酸序列与CS12-FL-AA(SEQ IDNO:2)具有至少98％同一性，其包括五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，编码的因子VIII变体的氨基酸序列与CS12-FL-AA(SEQ IDNO:2)具有至少99％同一性，其包括五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，编码的因子VIII变体的氨基酸序列与CS12-FL-AA(SEQ IDNO:2)具有至少99.5％同一性，其包括五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，编码的因子VIII变体的氨基酸序列与CS12-FL-AA(SEQ IDNO:2)具有至少99.9％同一性，其包括五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，编码的因子VIII变体的氨基酸序列与CS12-FL-AA(SEQ IDNO:2)同一。

因子VIII B-结构域取代的接头

如上所述，在本文所述的因子VIII变体中FVIII重链与轻链之间的键联(例如野生型因子VIII中的B-结构域)改变。从野生型因子VIII构建体移除B-结构域似乎不影响活化酶(例如FVIIIa)的活性，推测是因为在活化期间B-结构域移除。由于受AAV包装容纳的尺寸约束，B-结构域缺失、截短和或接头取代的变体将提高FVIII基因治疗构建体的功效。最常用的B-结构域取代的接头为SQ FVIII的接头，其仅仅保留B结构域的14个氨基酸作为接头序列。猪科VIII的另一变体(美国专利号6,458,563中所述的“OBI-1”)在CHO细胞中良好表达，并且具有24个氨基酸的略微更长的接头。在一些实施方案中，由本文所述的密码子改变的多核苷酸编码的因子VIII构建体包括SQ型B-结构域接头序列。在其他实施方案中，由本文所述的密码子改变的多核苷酸编码的因子VIII构建体包括OBI-1型B-结构域接头序列。

虽然因子VIII B-结构域并非活性所必需，但B-结构域含有若干例如通过N-或O-连接的糖基化进行翻译后修饰的残基。野生型因子VIII B-结构域的计算机分析(Prediction of N-glycosylation sites in human proteins,R.Gupta,E.Jung和S.Brunak,在准备中(2004))预测这些位点中的至少四个位点在体内糖基化。认为这些在B-结构域内的修饰有助于翻译后调控和/或因子VIII在体内的半衰期。因此，在一些实施方案中，本文所述的编码的因子VIII构建体的多肽接头包括一个或多个糖基化序列以允许在体内糖基化。在一些实施方案中，多肽接头包括至少一个共有糖基化序列(例如N-或O-连接的糖基化共有序列)。在一些实施方案中，多肽接头包括至少两个共有糖基化序列。在一些实施方案中，多肽接头包括至少三个共有糖基化序列。在一些实施方案中，多肽接头包括至少四个共有糖基化序列。在一些实施方案中，多肽接头包括至少五个共有糖基化序列。在一些实施方案中，多肽接头包括至少6个、7个、8个、9个、10个或更多个共有糖基化序列。

在一些实施方案中，多肽接头含有至少一个N-连接的糖基化序列N-X-S/T，其中X为除P、S或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，多肽接头含有至少两个N-连接的糖基化序列N-X-S/T，其中X为除P、S或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，多肽接头含有至少三个N-连接的糖基化序列N-X-S/T，其中X为除P、S或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，多肽接头含有至少四个N-连接的糖基化序列N-X-S/T，其中X为除P、S或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，多肽接头含有至少五个N-连接的糖基化序列N-X-S/T，其中X为除P、S或T以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，多肽接头含有至少6个、7个、8个、9个、10个或更多个N-连接的糖基化序列N-X-S/T，其中X为除P、S或T以外的任何氨基酸。

在一些实施方案中，本文所述的编码的因子VIII多肽包含SQ型B-结构域接头，所述接头包含野生型人因子VIII B-结构域的氨基酸760-762/1657-1667(FVIII-FL-AA；SEQID NO:39)(Sandberg等人Thromb.Haemost.85:93(2001)，其内容特此以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，SQ型B-结构域接头相对于对应野生型序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，SQ型B-结构域接头相对于对应野生型序列具有两个氨基酸取代。

在一些实施方案中，糖基化肽插入SQ型B-结构域接头中。在一些实施方案中，糖基化肽选自图8中所示的那些肽(以出现次序，分别为SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33和35)。在一些实施方案中，糖基化肽由图8中所示的相应多核苷酸编码(以出现次序，分别为SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34和36。在一个特定实施方案中，NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)插入本文所述的因子VIII多肽的SQ型B-结构域接头中。在一个特定实施方案中，NG5糖基化肽通过具有SEQ ID NO:16的核酸序列的多核苷酸编码。

在一些实施方案中，含有糖基化肽的SQ型B-结构域接头由图17中所示的相应多核苷酸编码(以出现次序，分别为SEQ ID NO:40-53。在一个特定实施方案中，含有糖基化肽的SQ型B-结构域由具有SEQ ID NO:43的核酸序列的多核苷酸编码。

在一些实施方案中，多肽接头(例如SQ型B-结构域接头)包括与如图8A-8B所示，以出现次序分别为SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33和35中的任一者具有高度序列同一性的糖基化肽。在一些实施方案中，糖基化肽相对于如图8A-8B所示，以出现次序分别为SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33和35中的任一者具有至多两个氨基酸取代，。在一些实施方案中，糖基化肽相对于如图8A-8B所示，以出现次序分别为SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33和35中的任一者具有至多一个氨基酸取代。在一些实施方案中，糖基化肽具有选自如图8A-8B所示，以出现次序分别为SEQ IDNO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33和35中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，糖基化肽由与选自如图8A-8B所示，以出现次序分别为SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34和36的对应核苷酸序列具有高度序列同一性的多核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，糖基化肽相对于SEQ ID NO:15具有至多两个氨基酸取代且由与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，糖基化肽相对于SEQ ID NO:15具有至多两个氨基酸取代且由与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，糖基化肽相对于SEQ ID NO:15具有至多两个氨基酸取代且由与SEQ ID NO:16具有至少98％同一性的多核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，糖基化肽相对于SEQ ID NO:15具有至多一个氨基酸取代且由与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，糖基化肽相对于SEQ ID NO:15具有至多一个氨基酸取代且由与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，糖基化肽相对于SEQ ID NO:15具有至多一个氨基酸取代且由与SEQ ID NO:16具有至少98％同一性的多核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，糖基化肽具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列且由与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，糖基化肽具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列且由与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，糖基化肽具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列且由与SEQ ID NO:16具有至少98％同一性的多核苷酸序列编码。

顺式调控元件

在一些实施方案中，如本文提供的编码因子VIII变体的核酸组合物还包含一个或多个顺式作用调控元件，例如启动子和/或增强子元件，其驱动体内的基因表达，可操作地连接于编码因子VIII变体的多核苷酸。在这种情况下，“顺式作用”意指调控元件存在于DNA的与其调控的基因相同的分子上。如本领域的技术人员所了解且下文所论述，适用于本发明的调控元件包括但不限于启动子、增强子元件、聚腺苷酸化信号单件和/或反向末端重复元件。

启动子

适用于本发明的启动子可操作地连接于编码区，一般直接连接(例如启动子与编码区之间不包含额外核苷酸)，但是在一些实施方案中，可使用间接键联，例如经由使用无功能接头，或在可使用在启动子“下游”但在编码区“上游”起作用的额外调控元件的情况下。然而，由于本发明载体的尺寸约束，这通常不是优选的。

增强子元件

在一些实施方案中，一个或多个增强子元件用于因子VIII变体构建体中。如本领域中已知，增强子元件通常以组织依赖性方式，例如主要在特定组织中驱动表达。一般而言，如下所述，增强子元件通常位于启动子元件“上游”。因为因子VIII主要在肝脏中合成，所以在一些实施方案中，本文所述的核酸组合物包含肝特异性调控元件，所述肝特异性调控元件基本上将编码的因子VIII变体的表达限制于肝细胞。

一般来说，肝特异性调控元件可源自于已知只在肝脏中表达的任何基因。WO2009/130208鉴定以肝特异性方式表达的若干基因，包括serpin肽酶抑制剂分化枝A成员1，也称α-抗胰蛋白酶(SERPINA1；GeneID 5265)；载脂蛋白C-I(APOC1；GeneID 341)、载脂蛋白C-IV(APOC4；GeneID 346)、载脂蛋白H(APOH；GeneID 350)；转甲状腺素蛋白(TTR；GeneID7276)、白蛋白(ALB；GeneID 213)、醛缩酶B(ALDOB；GeneID 229)、细胞色素P450家族2子家族E多肽1(CYP2E1；GeneID 1571)、血纤维蛋白原α链(FGA；GeneID 2243)、转铁蛋白(TF；GeneID 7018)、结合珠蛋白相关蛋白(HPR；GeneID3250)。在一些实施方案中，本文所述的核酸组合物包含源自于这些蛋白质中的一者或多者的基因座的肝特异性调控元件。此类元件的若干实例描述于WO 2009/130208中，其内容出于所有目的明确地以引用的方式整体并入本文中。

肝特异性调控元件的一个实例来自于转甲状腺素蛋白(TTR)基因，通常称为“TTRe”或“TTREnh”。Hsieh J.L.等人,Cancer Sci.,100(3):537-45(2009)，其内容出于所有目的明确地以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，如本文所述的编码因子VIII变体的核酸组合物包含人TTR启动子元件。在一个实施方案中，人TTR启动子具有与图4中所示的hTTR启动子(SEQ ID NO:6)具有高度序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，人TTR启动子具有与SEQ ID NO:6至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一的核酸序列。

肝特异性调控元件的另一实例来自于SERPINA1基因，如PCT公布号WO 2016/146757中所述，所述公布的内容出于所有目的明确地以引用的方式整体并入本文中。这种元件的一个实例是图4中所示的CRM8调控控制元件(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，源自SERPINA1的调控控制元件具有与CRM8(SEQ ID NO:5)至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核酸序列。

在一些实施方案中，如本文提供的编码因子VIII变体的核酸组合物包含一个或多个源自SERPINA1的调控控制元件，如图11中所示的构建体所例示。在一个实施方案中，因子VIII多核苷酸包含一个源自SERPINA1的调控控制元件(例如CRM8)。在另一实施方案中，因子VIII多核苷酸包括两个源自SERPINA1的调控控制元件(例如CRM8)。在其他实施方案中，因子VIII多核苷酸包括3个、4个、5个、6个或更多个源自SERPINA1的调控控制元件(例如CRM8)。

在一个实施方案中，如本文提供的编码因子VIII变体的核酸组合物包含一个或多个源自SERPINA1的调控控制元件(例如CRM8)和人TTR启动子元件，如图11中所例示。在一个实施方案中，如本文提供的编码因子VIII变体的核酸组合物包含可操作地连接于编码因子VIII变体的多核苷酸的两个CRM8元件和人TTR启动子元件。

在一些实施方案中，如本文提供的编码因子VIII变体的核酸组合物包含一个或多个位于人TTR启动子上游的CRM8元件。例如，在双链构建体中，相对于分子的转录取向，所述一个或多个CRM8元件位于TTR启动子的5’。这意指在(+)单链构建体中(例如在单链编码因子VIII变体的情况下)，一个或多个CRM8元件位于TTR启动子的5’。

如实施例6中所报告，因为本文所述的因子VIII变体构建体尺寸大，所以作为AAV基因治疗载体一部分的因子VIII多核苷酸中核苷酸数目的微小减少可显著增加载体的因子VIII生物效能。因此，在一些实施方案中，一个或多个CRM8元件直接附接于TTR启动子的5’端，例如在CRM8元件与TTR启动子之间未安置外来核苷酸。同样地，在一些实施方案中，TTR启动子直接附接于因子VIII变体多肽的编码序列的5’端，或附接于翻译起始序列(例如Kozak序列)，例如在TTR启动子与因子VIII变体基因之间未安置外来核苷酸。

聚腺苷酸化信号

在一些实施方案中，本文所述的构建体(例如编码因子VIII变体的核酸组合物)的调控元件是作为聚腺苷酸化信号的调控元件，例如如图11中的示例构建体中所示。聚腺苷酸化信号引导聚A尾在由因子VIII多核苷酸产生的mRNA转录产物的3’端上合成。因此，聚腺苷酸化信号位于因子VIII变体编码序列的3’。可用于本文所述的因子IX基因治疗构建体中的聚腺苷酸化信号的非限制性实例包括合成聚腺苷酸化信号、源自于猿猴病毒40(SV40)晚期基因的聚腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和最小兔β-球蛋白(mRBG)基因聚腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，如本文提供的编码因子VIII变体的核酸组合物包含合成聚腺苷酸化信号，如图11中所示的构建体所例示。在一个实施方案中，合成聚腺苷酸化信号具有与图4中所示的合成聚A信号(SEQ ID NO:8)至少90％、95％、97％或100％同一的核酸序列。

如实施例6中所报告，因为本文所述的因子VIII变体构建体尺寸大，所以作为AAV基因治疗载体一部分的因子VIII多核苷酸中核苷酸数目的微小减少可显著增加载体的因子VIII生物效能。因此，在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号直接附接于因子VIII变体多肽的编码序列的3’端，包括一个或多个位于编码序列末端的终止密码子。例如，在因子VIII变体基因与聚腺苷酸化序列之间未安置外来核苷酸。

反向末端重复序列

在一些实施方案中，如本文提供的编码因子VIII变体的核酸组合物还包含腺相关病毒(AAV)内部末端重复序列(ITR)，所述内部末端重复序列侧接因子VIII变体编码序列和相关调控元件(例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号等)。反向末端重复序列各自形成发夹，这有助于第二DNA链的非引发酶依赖性合成的自引发。ITR还帮助促进AAV病毒体内的包封以及AAV基因组整合至宿主细胞基因组中。

在一些实施方案中，如本文提供的编码因子VIII变体的核酸组合物包含与图4中所示的AAV2 5’ITR具有高度序列同一性(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)的5’ITR。在一些实施方案中，如本文提供的编码因子VIII变体的核酸组合物包含与图4中所示的AAV2 3’ITR具有高度序列同一性(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)的3’ITR。

如实施例6中所报告，因为本文所述的因子VIII变体构建体尺寸大，所以作为AAV基因治疗载体一部分的因子VIII多核苷酸中核苷酸数目的微小减少可显著增加载体的因子VIII生物效能。因此，在一些实施方案中，5’ITR直接附接于肝特异性元件(例如一个或多个CRM8元件)的5’端，以使得在5’ITR序列与肝特异性元件之间未安置外来核苷酸。类似地，在一些实施方案中，3’ITR直接附接于聚腺苷酸化信号的3’端，以使得在聚腺苷酸化信号与3’ITR序列之间未安置外来核苷酸。

IV.因子VIII表达载体

在一些实施方案中，本文所述的密码子改变的多核苷酸整合至表达载体中。表达载体的非限制性实例包括病毒载体(例如适合于基因治疗的载体)、质粒载体、噬菌体载体、粘粒、噬菌粒、人工染色体及其类似物。一般而言，存在两种适用于本发明中的表达载体基本类型：用于细胞培养中以产生因子VIII多肽的表达载体和用作基因治疗载体以施用患者，从而增加内源性因子VIII水平(无论蛋白质还是活性)的表达载体。

病毒载体的非限制性实例包括：逆转录病毒，例如莫罗尼鼠白血病毒(MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus)、鼠乳腺肿瘤病毒和劳氏肉瘤病毒(Roussarcoma virus)；腺病毒、腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr viruses)；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；和脊髓灰质炎病毒。

在许多实施方案中，本发明的密码子优化的多核苷酸用于基因治疗应用中，以使得施用患者产生因子VIII，如本文所概述。一般而言，基因治疗病毒载体优选为复制缺陷型的，因此基因治疗载体引入患者中不会引起病毒繁殖。

因此，在一些实施方案中，本文所述的密码子改变的多核苷酸整合至基因治疗载体中。在一些实施方案中，基因治疗载体为逆转录病毒，并且尤其为复制缺陷型逆转录病毒。在一些实施方案中，本文所述的密码子改变的多核苷酸整合至逆转录病毒表达载体中。先前已描述了这些系统，并且通常是本领域中熟知的(Mann等人,Cell,33:153-159,1983；Nicolas和Rubinstein,Vectors:A survey of molecular cloning vectors and theiruses,Rodriguez和Denhardt编辑,Stoneham:Butterworth,第494-513页,1988；Temin,GeneTransfer,Kucherlapati(编辑),New York:Plenum Press,第149-188页,1986)。在一个特定实施方案中，逆转录病毒载体为慢病毒载体(参见例如Naldini等人,Science,272(5259):263-267,1996；Zufferey等人,Nat Biotechnol,15(9):871-875,1997；Blomer等人,J Virol.,71(9):6641-6649,1997；美国专利号6,013,516和5,994,136)。本领域中已知用于产生复制缺陷型逆转录病毒的方案。综述参见Kriegler,M.,Gene Transfer andExpression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman公司,New York(1990)和Murry,E.J.,Methods in Molecular Biology,第7卷,Humana Press公司,Cliffton,N.J.(1991)。

多种载体可用于在细胞培养中从密码子改变的多肽表达因子VIII多肽，包括真核和原核表达载体。在某些实施方案中，考虑质粒载体用于在细胞培养中表达因子VIII多肽。一般而言，含有源自于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体结合这些宿主使用。载体可携带复制位点以及标记序列，所述标记序列能够在转化细胞中提供表型选择。质粒将包含编码因子VIII多肽的密码子改变的多核苷酸，所述密码子改变的多核苷酸可操作地连接于一个或多个控制序列，例如启动子。

用于原核表达的载体的非限制性实例包括诸如pRSET、pET、pBAD等质粒，其中用于原核表达载体中的启动子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用于真核表达的载体的实例包括：(i)对于在酵母中表达，诸如pAO、pPIC、pYES、pMET的载体，使用诸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等启动子；(ii)对于在昆虫细胞中表达，诸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等载体，使用诸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等启动子；和(iii)对于在哺乳动物细胞中表达，诸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等载体，和源自于诸如牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等病毒系统的载体，使用诸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白的启动子。

腺相关病毒(AAV)载体

在一个实施方案中，如本文所述的密码子改变的多核苷酸整合至基于腺相关病毒(AAV)的基因治疗载体中。先前已描述了AAV系统，并且通常是本领域中熟知的(Kelleher和Vos,Biotechniques,17(6):1110-17(1994)；Cotten等人,Proc Natl Acad Sci USA,89(13):6094-98(1992)；Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64(1994)；Muzyczka,Curr TopMicrobiol Immunol,158:97-129(1992)；和Asokan A等人,Mol.Ther.,20(4):699-708(2012)，各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文中)。关于rAAV载体的产生和使用的详情描述于例如美国专利号5,139,941和4,797,368，各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文中。

因此，在一些实施方案中，提供一种AAV基因治疗载体，所述载体包含如本文所述的密码子改变的多核苷酸(例如核酸组合物)，所述密码子改变的多核苷酸包含编码因子VIII重链和轻链的与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)的部分具有高度序列同一性的核苷酸序列，和短的14氨基酸的B-结构域取代的接头(例如含有弗林蛋白酶裂解位点以促进体内活性FVIIIa蛋白成熟的“SQ”接头)，并且其还包含五个X5突变中的一个或多个(例如相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V、A127S、G151K、M166T、L171P突变(SPI)中的一个、两个、三个、四个或全部五个)和/或插入B-结构域取代的接头(例如SQ接头)中的短糖基化肽(例如NG5；SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，AAV基因治疗载体包涵密码子改变的因子VIII多核苷酸，所述密码子改变的因子VIII多核苷酸具有与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有高度序列同一性的核苷酸序列且编码具有人因子VIII重链和轻链的因子VIII多肽，和短的14氨基酸的B-结构域取代的接头(例如“SQ”接头)，所述接头含有弗林蛋白酶裂解位点以促进体内活性FVIIIa蛋白成熟，其中因子VIII多肽的重链包含五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V、A127S、G151K、M166T和L171P(SPI))，和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，因子VIII多核苷酸具有与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，由AAV基因治疗载体的密码子改变的多核苷酸编码的因子VIII变体具有与CS12-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有高度序列同一性的氨基酸序列，其包含五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，编码的因子VIII变体的氨基酸序列与CS12-FL-AA(SEQ ID NO:2)具有至少97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性，其包含五个X5突变(相对于全长人野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))和插入SQ接头中的NG5糖基化肽(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，AAV基因治疗载体内编码因子VIII变体的多核苷酸可操作地连接于具有与图4中所示的hTTR启动子(SEQ ID NO:6)具有高度序列同一性的核酸序列的启动子元件。在一些实施方案中，启动子元件具有与SEQ ID NO:6至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一的核酸序列。

在一些实施方案中，AAV基因治疗载体内编码因子VIII变体的多核苷酸可操作地连接于具有与图4中所示的CRM8元件(SEQ ID NO:5)具有高度序列同一性的核酸序列的一个或多个肝特异性调控元件。在一些实施方案中，肝特异性调控元件具有与SEQ ID NO:5至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一的核酸序列。在一些实施方案中，如图11中所示，多核苷酸包含一个CRM8元件。在一些实施方案中，如图11中所示，多核苷酸包含两个CRM元件。

在一些实施方案中，AAV基因治疗载体内编码因子VIII变体的多核苷酸可操作地连接于一个CRM8元件和人TTR启动子元件，如图11中所例示。在一些实施方案中，AAV基因治疗载体内编码因子VIII变体的多核苷酸可操作地连接于两个CRM8元件和人TTR启动子元件，如图11中所例示。如实施例2中所述，与小鼠TTR启动子和增强子序列的使用相比，hTTR启动子和一个或两个肝特异性CRM8元件的使用分别使HepG2细胞中体内外源性因子VIII生物效能增加约2倍和4倍(图12中比较vCS115和vCS116与vCS04)。

如实施例6中所报告，因为本文所述的因子VIII变体构建体尺寸大，所以作为AAV基因治疗载体一部分的因子VIII多核苷酸中核苷酸数目的微小减少可显著增加载体的因子VIII生物效能。因此，在一些实施方案中，一个或多个CRM8元件直接附接于TTR启动子的5’端，例如在CRM8元件与TTR启动子之间未安置外来核苷酸。同样地，在一些实施方案中，TTR启动子直接附接于因子VIII变体多肽的编码序列的5’端，或附接于翻译起始序列(例如Kozak序列)，例如在TTR启动子与因子VIII变体基因之间未安置外来核苷酸。

在一些实施方案中，AAV基因治疗载体内编码因子VIII变体的多核苷酸可操作地连接于聚腺苷酸化信号，例如如图11中所的示例性构建体中所示。在一个实施方案中，合成聚腺苷酸化信号具有与图4中所示的合成聚A信号(SEQ ID NO:8)至少90％、95％、97％或100％同一的核酸序列。

如实施例6中所报告，因为本文所述的因子VIII变体构建体尺寸大，所以作为AAV基因治疗载体一部分的因子VIII多核苷酸中核苷酸数目的微小减少可显著增加载体的因子VIII生物效能。因此，在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号直接附接于因子VIII变体多肽的编码序列的3’端，包括一个或多个位于编码序列末端的终止密码子。例如，在因子VIII变体基因与聚腺苷酸化序列之间未安置外来核苷酸。

内部末端重复序列是基于AAV的重组载体所需的顺式调控元件。因此，用于本文所述的AAV基因治疗载体中的编码因子VIII变体的多核苷酸包含5’和3’ITR序列。在一些实施方案中，5’ITR与图4中所示的AAV2 5’ITR(SEQ ID NO:4)具有高度序列同一性(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)。在一些实施方案中，3’ITR与图4中所示的AAV2 3’ITR(SEQ ID NO:9)具有高度序列同一性(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)。

如实施例6中所报告，因为本文所述的因子VIII变体构建体尺寸大，所以作为AAV基因治疗载体一部分的因子VIII多核苷酸中核苷酸数目的微小减少可显著增加载体的因子VIII生物效能。因此，在一些实施方案中，5’ITR直接附接于肝特异性元件(例如一个或多个CRM8元件)的5’端，以使得在5’ITR序列与肝特异性元件之间未安置外来核苷酸。类似地，在一些实施方案中，3’ITR直接附接于聚腺苷酸化信号的3’端，以使得在聚腺苷酸化信号与3’ITR序列之间未安置外来核苷酸。

在一个具体实施方案中，如图11中所例示，本文提供的AAV基因治疗载体内所包含的多核苷酸在5’至3’取向上包含5’ITR序列(例如与SEQ ID NO:4具有高度序列同一性)、与SEQ ID NO:5具有高度序列同一性的一个或两个CRM元件、与SEQ ID NO:6具有高度序列同一性的hTTR启动子元件、与SEQ ID NO:7具有高度序列同一性的最小Kozak共有序列、与SEQID NO:1具有高度序列同一性的因子VIII变体多核苷酸、聚腺苷酸化序列(例如与SEQ IDNO:8具有高度序列同一性)和3’AAV ITR序列(例如与SEQ ID NO:9具有高度序列同一性)。在一些实施方案中，所述多核苷酸与图3中所示的CS12-CRM8.2-Vr载体(SEQ ID NO:3)具有高度序列同一性(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性)。

本文所述的AAV基因治疗载体与AAV衣壳蛋白一起使用，所述AAV衣壳蛋白包封如本文所述的编码因子VIII变体多肽的多核苷酸。即，通过使用病毒颗粒递送将产生因子VIII的病毒载体，所述病毒颗粒包含包封病毒载体的衣壳蛋白的“壳”。

AAV载体的血清型通常由所用衣壳蛋白定义。已表征若干AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。一般而言，任何AAV血清型都可用于本文所述的因子VIII基因治疗构建体。然而，血清型具有不同向性，例如其优先感染不同组织。在一个实施方案中，因为因子VIII主要在肝脏中产生，所以所公开的基因治疗构建体的AAV血清型是基于肝脏向性选择，在至少血清型AAV7、AAV8和AAV9中发现。因此，在一个实施方案中，因子VIII基因治疗构建体是AAV7血清型载体。在另一实施方案中，因子VIII基因治疗构建体是AAV8血清型载体。在又一个实施方案中，因子VIII基因治疗构建体是AAV9血清型载体。

在一些实施方案中，还提供合并密码子改变的因子VIII基因治疗基因组的质粒多核苷酸。例如当引入能够重组产生AAV的哺乳动物细胞(例如具有编码AAV rep和cap基因以及用于产生AAV的辅助基因(例如腺病毒基因)的核酸的细胞)时，质粒可用于产生最终AAV颗粒(例如携带编码变体因子VIII多肽的多核苷酸的AAV病毒体)。在一些实施方案中，质粒包含允许质粒在宿主细胞(例如原核宿主细胞，诸如细菌，或真核宿主细胞，诸如酵母)中复制(例如按比例增加质粒)的调控元件。

举例而言，根据本发明的一个实施方案，携带密码子改变的因子VIII基因治疗基因组的示例性质粒的序列示于图5(CS12-CRM8.2-Vrp；SEQ ID NO:10)。CS12-CRM8.2-Vrp质粒包含CS12-CRM8.2-Vr因子VIII基因治疗基因组(图3中示为SEQ ID NO:3)和质粒主链(图18中示为SEQ ID NO:54)。CS12-CRM8.2-Vr因子VIII基因治疗基因组的遗传元件示于图4中，如上所述。CS12-CRM8.2-Vrp质粒的质粒主链包含pMB1复制子(图19中示为SEQ ID NO:55；Bolívar F.,Life Sci.,25(10):807-17(1979))，其促进质粒在细菌宿主细胞中的复制；和Bla(ApR)氨苄青霉素抗性基因(图19中示为SEQ ID NO:56；Sutcliffe,P.N.A.S.U.S.A,75(8):3737-41(1978))，其促进通过质粒转化的细菌宿主细胞的选择。CS12-CRM8.2-Vrp质粒中各元件的位置在以下表1中示出。

表1.CS12-CRM8.2-Vrp质粒中存在的元件

在一个实施方案中，合并因子VIII变体基因治疗基因组的质粒与图5中所示的CS12-CRM8.2-Vrp质粒(SEQ ID NO:10)具有高度序列同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸与图5中所示的CS12-CRM8.2-Vrp质粒(SEQ ID NO:10)具有高度序列同一性(例如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性)。在一些实施方案中，所述多肽包含因子VIII-BDD编码序列，例如与本文公开的因子VIII-BDD编码序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性且与图5中所示的CS12-CRM8.2-Vrp质粒的剩余部分具有高度序列同一性，例如与SEQ ID NO:10的核苷酸1-528和4924-7794至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸为包含表1中所示的一些或全部元件的质粒。在一些实施方案中，表1中所示的一个或多个元件被可比较的元件替代。

AAV载体的产生

本文所述的密码子改变的因子VIII多核苷酸和病毒载体根据用于核酸扩增和载体产生的常规方法产生。已开发若干平台用于大规模产生重组AAV载体。第一平台是基于含有所需病毒基因组的序列的质粒引入含有编码AAV rep和cap基因以及病毒复制辅助基因的多核苷酸的哺乳动物细胞中。综述参见Kotin R.M.,Hum.Mol.Genet.,20(R1):R2-6(2011)；Penaud-Budloo,M.等人,Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8):166-80(2018)；和Aponte-Ubillus JJ等人,Appl Microbiol Biotechnol.,102(3):1045-54(2018)，其内容出于所有目的明确地以引用的方式整体并入本文中。第二平台是基于例如通过将哺乳动物细胞用野生型腺病毒和具有所需病毒基因组的序列的重组腺病毒共同感染来构建所需病毒基因组整合至哺乳动物细胞基因组中的稳定哺乳动物细胞系。综述参见Penaud-Budloo,M.等人,Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8):166-80(2018)，其内容出于所有目的明确地以引用的方式整体并入本文中。第三平台是基于用具有所需病毒基因组的序列的第一重组HSV和编码AAV rep和cap基因的第二重组HSV共同感染哺乳动物细胞。综述参见Penaud-Budloo,M.等人,Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8):166-80(2018)；和Aponte-UbillusJJ等人,Appl Microbiol Biotechnol.,102(3):1045-54(2018)，其内容出于所有目的明确地以引用的方式整体并入本文中。第四平台是基于用具有所需病毒基因组的序列的第一重组杆状病毒和编码AAV rep和cap基因的第二重组杆状病毒共同感染昆虫细胞。综述参见Penaud-Budloo,M.等人,Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8):166-80(2018)；和Aponte-Ubillus JJ等人,Appl Microbiol Biotechnol.,102(3):1045-54(2018)，其内容出于所有目的明确地以引用的方式整体并入本文中。第五平台是基于含有所需病毒基因组的序列的质粒引入含有编码AAV rep和cap基因以及病毒复制辅助基因的多核苷酸的酵母细胞中。综述参见Aponte-Ubillus JJ等人,Appl Microbiol Biotechnol.,102(3):1045-54(2018)，其内容出于所有目的明确地以引用的方式整体并入本文中。

V.治疗A型血友病的方法

在一些实施方案中，根据已知的施用方法，向A型血友病患者施用本文所述的核酸组合物(例如编码因子VIII变体的密码子改变的多核苷酸)和基因治疗载体(例如含有编码因子VIII变体的密码子改变的多核苷酸的AAV颗粒)，以治疗A型血友病。用于施用基因治疗载体的方法为本领域中所熟知。这些包括不限于静脉内施用、肌肉内注射、间质注射和肝脏内施用(例如肝动脉或静脉内)。例如参见Chuah MK等人,Hum Gene Ther.,23(6):557-65(2012)；Chuah MK等人,J Thromb Haemost.,10(8):1566-69(2012)；Chuah MK等人,JThromb Haemost.11增刊1:99-110(2013)；VandenDriessche等人,Hum Gene Ther.23(1):4-6(2012)；High KA,Blood,120(23):4482-87(2012)；Matrai等人,Mol Ther.,18(3):477-90(2010)；和Matrai等人,Curr Opin Hematol.,17(5):387-92(2010)，其各自的内容特此以引用的方式并入本文中供评述。

因此，本公开提供用于治疗因子VIII缺乏症(例如A型血友病)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的患者施用如本文所述的核酸组合物(例如密码子改变的因子VIII多核苷酸构建体和/或重组AAV载体)。在一些实施方案中，核酸组合物包含编码因子VIII变体多肽的密码子改变的多核苷酸，例如与CS12-FL-NA(SEQ ID NO:1)具有高度核酸序列同一性(例如至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)。如本文所述，在一些实施方案中，编码因子VIII变体多肽的密码子改变的多核苷酸可操作地连接于启动子(例如如本文所述的人TTR启动子)和一个或多个肝特异性调控元件(例如如本文所述的一个或两个CRM8元件)。

在一些实施方案中，核酸组合物是哺乳动物基因治疗载体的一部分。在一个具体实施方案中，哺乳动物基因治疗载体是病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。

在一个实施方案中，基因治疗载体是具有编码密码子改变的因子VIII变体编码序列的病毒载体的腺相关病毒(AAV)颗粒。一般而言，病毒载体包含在各末端的反向末端重复序列、一个或多个表达调控元件(例如启动子(例如如本文所述的人TTR启动子)和一个或多个肝特异性调控元件(例如如本文所述的一个或两个CRM8元件))、密码子改变的因子VIII编码序列和聚A信号序列。

评估治疗功效

A型血友病治疗的治疗功效可例如通过测量来自所治疗受试者的血液的因子VIII依赖性凝血潜能来评估。用于评估凝血潜能的量度包括不限于体外活化部分凝血活酶时间测定(APPT)、因子IX显色活性测定、凝血时间和因子VIII抗原水平(例如使用因子VIII特异性ELISA)。注意到治疗剂量无需在患者中产生野生型因子VIII水平；更确切些，出于本发明的目的，足够表达至以有意义或可测量的方式减少症状视为治疗性的。

根据美国国家血友病基金会(the National Hemophilia Foundation)，当血浆含有6％与49％之间的正常人血浆因子VIII活性时，受试者被分类为患有轻度A型血友病。患有轻度A型血友病的受试者通常仅在严重受伤、外伤或手术之后出血。多数情况下，不会诊断出轻度血友病，直至受伤、手术或拔牙引起长时间出血时。第一次发作可能直至成人期才出现。患有轻度血友病的女性常常经历月经过多、月经期出血过多，并且在产后可能大出血。

根据美国国家血友病基金会，当血浆含有1％与5％之间的正常人血浆因子VIII活性时，受试者被分类为患有中度A型血友病。患有重度A型血友病的受试者往往在受伤之后出血。无明显原因而发生的出血称为自发出血事件。

根据美国国家血友病基金会，当血浆含有少于1％的正常人血浆因子VIII活性时，受试者被分类为患有重度A型血友病。患有重度A型血友病的受试者在受伤后出血，并且可具有频繁的自发出血事件，常常流至其关节和肌肉中。

在一些实施方案中，正常人血浆定义为每毫升含有1IU因子VIII活性。因此，在一些实施方案中，来自分类为轻度A型血友病的受试者的血浆含有每毫升0.06与0.49IU之间的因子VIII活性。在一些实施方案中，来自分类为中度A型血友病的受试者的血浆含有每毫升0.01与0.05IU之间的因子VIII活性。在一些实施方案中，来自分类为重度A型血友病的受试者的血浆含有每毫升0.01与0.05IU之间的因子VIII活性。

在一些实施方案中，当疗法例如通过提高受试者血液中因子VIII活性的平均水平而减轻A型血友病的症状的严重程度时，其为治疗有效的。因此，在一些实施方案中，当A型血友病疗法提高受试者血液/血浆中的因子VIII活性的平均水平时，其为治疗有效的。在一些实施方案中，治疗有效的治疗使受试者血液/血浆中的因子VIII活性的平均水平提高至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。

在一些实施方案中，治疗有效的治疗提高受试者血液中的因子VIII活性的平均水平，使得受试者被分类为患有不太严重形式的A型血友病。举例而言，在一个实施方案中，最初分类为重度A型血友病的受试者在进行治疗有效的治疗之后重新分类为中度A型血友病或轻度A型血友病。在另一实施方案中，最初分类为中度A型血友病的受试者在进行治疗有效的治疗之后重新分类为轻度A型血友病。在另一实施方案中，最初分类为轻度A型血友病的受试者在进行治疗有效的治疗之后重新分类为未患A型血友病。

制剂

本文提供用于治疗A型血友病的组合物。此类组合物含有治疗有效量的如本文所述的核酸组合物，例如包含编码因子VIII的密码子改变的多核苷酸的AAV基因治疗载体。治疗有效量的密码子改变的VIII多核苷酸(例如包括密码子改变的因子VIII编码序列的AAV基因治疗载体)与合适药物载体或媒介物混合，用于例如全身施用。本领域的技术人员能够最终配制本文公开的密码子改变的因子VIII多核苷酸。

剂量

向有需要的患者施用本发明的核酸组合物。基因治疗治疗剂施用的量或剂量取决于诸如特定密码子改变的VIII多核苷酸构建体、使用的递送载体、疾病严重程度和受试者的整体特征的因素。精确剂量将取决于治疗目的，并且本领域的技术人员使用已知技术可确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1 3卷,1992)；Lloyd,TheArt,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,DosageCalculations(1999)；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。熟练医师能够确定治疗特定受试者的特定剂量和给药方案。

VI.实施例

实施例1-通过添加N-糖基化接头序列改进表达FVIII的单链AAV8载体构建体

为阐明BDD-FVIII的SQ序列内的额外N-糖基化位点是否增加FVIII蛋白表达，设计一组含有假定的N-连接的糖基化位点的短肽序列。先前，McIntosh等人(Blood 121(17):3335-44(2013))显示6个潜在位点的N-糖基化(“V3肽”)的概念增强小鼠血浆中的FVIII表达水平。令人关注地，所述“V3肽”的计算机预测鉴定6个位点中的两个可能在体内进行N-糖基化。

在密码子优化的BDD-FVIII“CS01”序列(参见WO 2017/083762，其内容特此以引用的方式并入本文中)背景下，通过应用程序NetNGlyc-数据库(Steentoft等人,H.EMBO J,32(10):1478-88,2013)，设计12个不同接头序列，在图8A-8B中示为NG1-NG21，目标是产生含有多个N-糖基化位点的短序列。NetNGly平台将分析人蛋白质序列的N-糖基化模式的九个神经网络组合。基于NetNGly数据库，分析所设计的肽转移N-糖基化作为翻译后修饰的可能性，如Steentoft等人,H.EMBO J,32(10):1478-88,(2013)(其内容特此以引用的方式并入本文中)中所述。在12种新颖替代肽中，将预测具有低免疫原性(如下文所解释)的四个有希望的NG接头插入称为“CS04”的密码子优化的BDD-FVIII序列(SEQ ID NO:10)的14个氨基酸尺寸的SQ序列(SFSQN-新颖肽-PPVLKRHQR)中。

通过转染人肝脏Huh-7细胞且用抗FVIII蛋白印迹分析来检测经修饰的BDD-FVIII，在实验上证实包括vNG4/CS04、vNG5/CS04和vNG16/CS04的三种载体的预测N-糖基化位点的翻译后修饰(图9)。通过凝胶电泳检测到FVIII的修饰型式的重链比仅仅含有SQ序列的BDD-FVIII尺寸大，从而表明存在新的N-糖基化位点。此外，如针对表达载体vNG5/CS04和高分泌的X5变体vX5/NG5/CS125示例性展示，人肝脏细胞系HepG2的AAV8感染证实N-糖基化(图10；将在实施例3和5中描述vX5/NG5/CS125)。

接头序列设计的焦点在于产生伴有低免疫原性风险的短肽序列(7-17个氨基酸残基)。为此，应用计算机免疫原性特征分析EpibaseTM(Lonza)(HLA结合)。EpibaseTM的表位预测法包括用于预测免疫原性的结构和统计层。结构部分基于Pepscope技术估计结合亲和力，如Desmet等人,Proteins.58(1):53-69(2005)(其内容特此以引用的方式并入本文中)中所述。统计部分从肽序列及其实验结合亲和力提取信息。基于关键表位计数，受影响的HLA II类同种异型(Krischmann等人,J Immunol.15；155(12):5655-62(1995)；Verreck等人,Int Immunol.8(3):397-404(1996)，其内容特此以引用的方式并入本文中)和DRB1(Laupeze等人,Hum Immunol.60(7):591-7(1999)，其内容特此以引用的方式并入本文中)风险分数用于估计蛋白质的免疫原性风险。基于这种评分系统，肽NG16的免疫原性风险中等，NG4和NG10的免疫原性风险低，并且NG5的免疫原性风险甚至比BDD-FVIII的未修饰的SQ序列更低(表2)。

表2.体内AAV治疗之后两周的FVIII活性

进一步，在宾夕法尼亚大学(the University of Pennsylvania)的HaigKazazian实验室中产生的外显子16FVIII敲除小鼠模型中分析载体vNG4/CS04、vNG5/CS04、vNG10/CS04和vNG16/CS04(表2)。在AAV8感染后两周，通过小鼠血浆样品的显色活性确定FVIII表达水平。FVIII表达水平比不含肽的vCS04构建体高1.4至2.4倍。整体而言，构建体vNG5/CS04展现最有利的特征，包括高FVIII表达水平(3.8IU/mL)、最低免疫原性风险和最短肽尺寸(7个氨基酸残基)。在另一FVIII小鼠模型(“品系E”模型)中进一步测试构建体vNG5/CS04，所述模型在免疫学上耐受人FVIII(Reipert等人,Haemophilia.16(增刊5):47-53(2010)和van Helden等人,Blood118(13):3698-707(2011)中描述，其内容特此以引用的方式明确并入本文中)。在这种独立小鼠模型中，证实vNG5/CS04的FVIII表达增加且经评估，比vCS04高3倍。

综上所述，开发出一种称为vNG5/CS04的改进的载体，其含有新的短N-糖基化肽序列，具有极低免疫原性风险且体内FVIII表达水平增强。

实施例2-通过启动子/增强子替代改进表达FVIII的单链AAV8载体构建体

称为vCS04的表达FVIII的基于AAV8的初始单链载体构建体的启动子盒含有源自于肝特异性鼠类转甲状腺素蛋白(TTR)基因的核心启动子和增强子序列(Yan等人,EMBO J,9:869-78(1990)，其内容特此以引用的方式并入本文中)，参见图11。这种肝特异性mTTR启动子/增强子盒经双重修饰，首先鼠类核心(基础)启动子序列被对应人序列完全替代。其次，鼠类增强子序列被近来描述的肝特异性顺式调控模块CRM8(Nair等人,Blood,123:3195-99(2014)和Chuah等人,Mol Ther,22:1605-13(2014)，其内容特此以引用的方式并入本文中)替代。将一个或两个CRM8元件插入人TTR核心(基础)启动子上游，分别产生载体构建体vCS115和vCS116(图11)。

通过体外和体内分析，在人肝脏来源的HepG2细胞系和在“品系E”小鼠中，以4.0E+12vg/kg的剂量，评估新颖启动子盒的强度。在体外，具有一个CRM8元件(vCS115)和两个CRM8元件(vCS116)的构建体分别产生比参考(vCS04)高2.2倍和3.7倍的生物效能单位(图12)。在体内，CRM8/hTTR启动子盒效能与mTTR启动子/增强子相当(图12)。

在三组构建体中进一步评估CRM8相关的对FVIII表达的加强作用，在所述构建体中包括mTTR启动子/增强子、1×CRM8/hTTR和2×CRM8/hTTR的所述启动子盒与BDD-FVIII的新颖修饰见下文，实施例3-5)组合。整体而言，通过直接比较以下各者，基于一个和两个CRM8元件的存在，体外数据揭示生物效能单位的增加：(1)vNG5/CS04与vNG5/CS117(高2.5倍)和vNG5/CS118(高4.0倍)、(2)vX5/CS24与vX5/CS101(1.8高倍)和vX5/CS105(高5.3倍)以及(3)vX5/NG5/CS125与vX5/NG5/CS119(高4.4倍)和vX5/NG5/CS120(高6.2倍)。未在体内观察到对FVIII水平的CRM8依赖性作用。然而，体内数据清楚显示在所述小鼠模型中新颖的1×CRM8/hTTR与2×CRM8/hTTR启动子盒与mTTR启动子/增强子相比效能同等优异。

实施例3-通过引入“NG5”变体改进表达FVIII的单链AAV8载体构建体

基于实施例1中所示的数据，选择构建体vNG5/CS04中的N-糖基化接头NG5与新颖的人肝特异性启动子1×CRM8/hTTR和2×CRM8/hTTR组合，产生构建体vNG5/CS117和vNG5/CS118(图11)。vNG5/CS04构建体含有mTTR启动子/增强子盒(图11)。vNG5/CS04的体内生物效能水平比vCS04高1.9倍，这归因于对NG5接头序列的积极作用(图12)。在体外，观察到含有CRM8元件的载体vNG5/CS117和vNG5/CS118的生物效能增加。在体内，vNG5/CS117和vNG5/CS118的表达水平类似于vNG5/CS04(图12)。

实施例4-通过引入“X5”变体改进表达FVIII的单链AAV8载体构建体

为进一步改进表达FVIII的载体，将X5变体(在WO 2017/083762中描述为突变‘m2’，其内容特此以引用的方式并入本文中)引入BDD-FVIII中。X5变体在重链的A1结构域内含有五个猪科FVIII氨基酸残基，这赋予人FVIII的有效分泌(Cao等人,2014,ASGCT摘要#460；所公开的变体的细节呈口头展示)。具体地，BDD-FVIII的X5变体与mTTR启动子/增强子组合，产生vX5/CS24，与一个或两个CRM8元件加hTTR启动子组合，产生构建体vX5/CS101和vX5/CS105(图11)。在体外在肝脏来源的HepG2细胞系中以及在体内在“品系E2”小鼠中，分析三种新颖构建体且与参考构建体vCS04相比，“品系E2”小鼠是一种转基因FVIII敲除小鼠品系，其表达最低量的人FVIII cDNA，从而免疫学上耐受人FVIII(van Helden PM等人,Blood 118(13):3698-707(2011)，其内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文中)。在体内，vX5/CS24、vX5/CS101和vX5/CS105使FVIII活性水平增强2.5-3.1倍(图12)。在体外，生物效能的增加介于4.0与21.2之间。体外测试系统揭示X5变体(构建体vX5/CS24)使生物效能增加4.0倍，并且含有X5和CRM8元件的一个或两个拷贝的构建体(分别为构建体vX5/CS101和vX5/CS105)进一步使生物效能增加7.3和21.2倍。

实施例5-通过引入“X5”和“NG5”变体改进表达FVIII的单链AAV8载体构建体

在另一组载体中，N-糖基化接头NG5(实施例3)和X5变体(实施例4)同时引入BDD-FVIII，并且另外与包括mTTR启动子/增强子、1×CRM8/hTTR和2×CRM8/hTTR的三种不同启动子组合，分别产生构建体vX5/NG5/CS125、vX5/NG5/CS119和vX5/NG5/CS120(图11)。与vCS04相比，vX5/NG5/CS125、vX5/NG5/CS119和vX5/NG5/CS120的体内和体外生物效能分别增加3.6-5.5和3.2-19.8倍。如针对各具有共同启动子的三个系列构建体所示，两个新颖修饰X5和NG5的引入揭示在体内表达进一步增加。举例而言，对于具有2×CRM8/hTTR启动子的系列(构建体vCS116、vNG5/CS118、vX5/CS105和vX5/NG5/CS120)，单独NG5的存在使FVIII表达水平从1.9升高至2.9IU/mL，单独X5的存在使FVIII表达水平从1.9升高至5.1IU/mL，并且X5与NG5两者的存在使FVIII表达水平从1.9升高至11.4IU/mL。

综上所述，确定携带新颖2×CRM8/hTTR启动子盒和另外具有两个修饰X5变体和NG5序列的密码子优化的BDD-FVIII“CS04”核苷酸序列的构建体vX5/NG5/CS120是具有最高体外和体内生物效能的构建体。

实施例6-单链AAV8载体构建体的核苷酸减少

为减小略微过大的载体构建体vX5/NG5/CS120的载体尺寸，使得包装更高效，使侧接ITR内的所有非功能DNA序列缺失。这减少总共71个核苷酸，从5191核苷酸尺寸减小至5120尺寸的表达盒。缺失包括在5’-ITR与CRM8序列之间的19个核苷酸、人TTR启动子与Kozak序列之间的9个核苷酸、BDD-FVIII编码序列与合成聚腺苷酸化位点之间的27个核苷酸和合成聚腺苷酸化位点与3’-ITR序列之间的16个核苷酸。称为vX5/NG5/CS12的尺寸减小的表达盒由具有两个CRM8元件和核心人TTR启动子序列的启动子、包含X5变体以及NG5序列的BDD-FVIII序列和合成聚腺苷酸化位点组成，并且侧接两个基于AAV2的反向末端重复序列。构建体vX5/NG5/CS12示意性展示于图11中。

通过琼脂糖凝胶电泳阐明AAV载体基因组制剂vCS04、vX5/NG5/CS120和vX5/NG5/CS12的载体基因组完整性。图13中所示的结果表明vCS04、vX5/NG5/CS120和vX5/NG5/CS12病毒载体具有类似尺寸的基因组，如大约5kb的不同条带所指示。尽管计算的载体尺寸接近5.2kb，但基因组是证实略大基因组恰当包装的均质条带(相对于4.7kb的AAV野生型基因组)。较短的vX5/NG5/CS12变体是优选的。

以5x10¹¹ vg/kg、1x10¹² vg/kg和4x10¹² vg/kg的载体剂量向FVIII F17敲入小鼠施用一组基于AAV8的病毒载体，包括vCS04、vX5/NG5/CS120和vX5/NG5/CS12，并且在第14天测定FVIII活性水平。如图14所示，vX5/NG5/CS12与vX5/NG5/CS120两者在1x10¹²vg/kg的载体剂量下产生大约4IU/mL的相当表达水平。与在1x10¹²vg/kg的剂量下具有0.3IU/mL的极低FVIII表达水平的参考构建体vCS04对比，改进载体vX5/NG5/CS12和vX5/NG5/CS120展示FVIII表达水平增加大约14倍(图14)。甚至在5x10¹¹ vg/kg的剂量下，载体vX5/NG5/CS12还可获得1.5IU/mL FVIII的表达水平。与体内数据一致，以同等感染复数(MOI)感染HepG2细胞，vX5/NG5/CS120和vX5/NG5/CS12的体外生物效能分别强力增加大约17倍和24倍(图14)。因此，因为所有载体是在相同浓度(感染复数)下施用，所以生物效能的差异应归于所用变体且与尺寸无关。