纯化血浆蛋白的方法
阅读说明：本技术 纯化血浆蛋白的方法 (Method for purifying plasma proteins ) 是由 M·哈尔 M·安德尔 M·贝格 S·克里斯蒂安松 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种纯化血浆蛋白的方法。更准确地说,本发明涉及使用磁珠从血浆部分,例如血浆的冷沉淀物或冷上清液,或者直接从重组血浆蛋白的细胞培养物中分离不同血浆蛋白的方法。(The present invention relates to a method for purifying plasma proteins. More precisely, the invention relates to a method for separating different plasma proteins from a plasma fraction, such as a cryoprecipitate or a cold supernatant of plasma, or directly from a cell culture of recombinant plasma proteins, using magnetic beads.)
技术领域
本发明涉及一种纯化血浆蛋白的方法。更准确地说，本发明涉及使用磁珠从血浆部分，例如血浆的冷沉淀物或冷上清液，或者直接从重组血浆蛋白的细胞培养物中分离不同血浆蛋白的方法。
背景技术
血液含有对于生命体功能必需的不同类型的细胞和分子，因此收集其用于治疗目的，例如用于输血。然而，可以从血液中分离和制备不同的部分，例如血红细胞或无细胞血浆，这使得能够更直接地治疗性治疗医学病况。血浆中的几种蛋白也可进一步分离并用于特定的治疗处理，例如白蛋白用于恢复血液体积，免疫球蛋白用于免疫缺陷，凝血因子用于凝血障碍。
血浆含有不同功能、不同大小、不同量等的蛋白，因此存在纯化不同血浆蛋白的不同的方法。纯化方法通常被设计成从一个单一的血浆起始库中获得几种目标蛋白。该方法通常包括沉淀或色谱法步骤或其组合。色谱法通常用于提高目标蛋白的纯度并降低有害副作用的风险。许多血浆蛋白显示非常强的活性，并且如果作为污染物存在，当给予患者时，它们甚至在非常低的水平下也可能引起不良反应。
将收集的人血浆冷冻储存，血浆蛋白纯化过程的初始步骤是解冻和合并血浆。当在低温(通常为1-6℃)下解冻时，一些血浆蛋白沉淀并可通过例如离心收集。收集的沉淀物被称为冷沉淀物，可以用作例如凝血因子VIII (FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的来源。血浆中大部分FVIII作为与大vWF多聚体的复合物存在，因此这两种蛋白通常是共同纯化的。除去冷沉淀物后的剩余液体通常称为冷贫化血浆或冷上清液，并且这可以用作例如白蛋白、免疫球蛋白G (IgG)、凝血因子IX (FIX)的来源。
许多血浆蛋白的纯化可能是具有挑战性的。这可能取决于少量具有不期望但强的活性的污染物的存在，或者蛋白有时丧失其活性或获得不期望的活性。例如，FVIII容易失去活性，并且用于纯化的已知方法在许多方面不令人满意。因此，需要改进的方法，其可以在蛋白保持其活性的条件下操作，以便以良好的产率获得血浆产物。
发明内容
本发明涉及用于通过在粗样品中分批吸附蛋白来纯化血浆蛋白的磁珠，其已经显示是可以保存敏感蛋白的温和技术。所述珠是提供有嵌入的磁性颗粒和血浆蛋白结合配体的色谱法珠类型。
在第一方面，本发明涉及一种从粗样品中纯化血浆蛋白的方法，包括将所需血浆蛋白结合到磁珠上的配体上并洗脱所述血浆蛋白，其中所述结合和洗脱以分批模式进行。该方法可以大规模进行以提供大量的所需血浆蛋白。
配体优选是阴离子交换配体，并且优选选自二乙基氨基乙基(DEAE)、季铵基乙基(QAE)或季铵(Q)，最优选阴离子交换配体是Q-配体。
或者，配体可以对FVIII具有亲和力，例如对FVIII的轻链具有亲和力。
优选地，粗样品是冷沉淀物，而一种或多种所需血浆蛋白是因子VIII (FVIII)和/或血管性血友病因子(vWF)。
粗样品也可以是冷上清液，而一种或多种所需血浆蛋白是白蛋白、IgG或因子IX(FIX)。或者，粗样品可以是全血浆。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据上述权利要求中的一项或多项的方法，其包括a)将包含至少一种血浆蛋白的血浆部分，例如冷上清液或溶解的冷沉淀物加入容器，例如袋或罐；b)通过将提供有阴离子配体，优选Q配体的磁珠倾倒或泵送到所述容器中来添加所述磁珠；c)在混合下孵育至少30分钟；d)将血浆蛋白结合到磁珠上；e)用磁场保持磁珠并洗去不需要的材料，任选地重复进行；f)以来自冷沉淀物的92-100%活性FVIII的产率或以来自冷上清液的至少85% F IX和小于1‰的FIXa/FIX比率的产率从所述磁珠洗脱血浆蛋白。
磁珠优选为提供有嵌入的磁性颗粒的多孔琼脂糖珠。本发明通过提供合适尺寸的磁珠和具有其附属设备的大容器(例如波浪型袋(Wave bags))能够进行大规模纯化。
具有阴离子交换(Q)或亲和(VIII Select)配体的磁性色谱法树脂原型用于从人回收血浆中纯化因子VIII (FVIII)、血管性血友病因子(vWF)或因子IX (FIX)。常规填充床色谱法作为用Q配体的测试进行参考，如下面实验部分所示。
尽管实验显示纯化血浆衍生的蛋白，但本发明也考虑直接从细胞培养物中纯化重组血浆蛋白，即在血浆蛋白结合到磁珠上的所选配体之前不进行进一步纯化。
具体实施方式
本发明提供了一种能够以高结合强度结合血浆蛋白并能够具有高结合能力的磁珠。这是用血浆蛋白结合磁珠实现的，该磁珠包含多孔基质和一个或多个嵌入在该基质中的磁性颗粒，其中该基质包含多孔聚合物，优选琼脂糖，以及与该多孔聚合物偶联的血浆蛋白结合配体。
一个优点是珠允许直接从粗材料选择性结合大量血浆蛋白。另一个优点是，所述珠对血浆蛋白具有有利的吸附等温线，得到高产率的回收血浆蛋白。
珠的尺寸可合适地使得将用于下文公开的方法中的多个珠具有8-300微米，例如20-200、20-100微米或20-80微米的体积加权中值直径(d50，V)。这些尺寸的珠易于用磁场保持，特别是与磁性纳米颗粒或微米尺寸的颗粒相比。然而，质量传递速率足够快，以使珠快速吸收血浆蛋白。这特别适用于中值直径为20-100微米和20-80微米区间的珠。一种或多种珠可以是球形或基本上球形，例如具有至少0.9的球度(与珠具有相同体积的球体的表面积除以珠的表面积)。
现在将结合下面的实验部分更详细地描述本发明。
进行因子VIII、因子IX、因子IXa (FVIII、FIX、FIXa)的活性或血管性血友病因子(vWF)的浓度的测定。
在下面的实验1和3中，比较填充在柱中的MagSepharose原型和非磁性树脂。
实验部分
磁珠原型的合成：
MagSepharose Q原型，LS-000672
用2M NaOH洗涤MagSepharose基础基质。加入缩水甘油基三甲基氯化铵(GMAC)，偶联反应在室温下进行过夜。将GMAC反应再重复两次。用蒸馏水洗涤树脂。反应方案如下所示。
VIII MagSepharose原型，LS-034256
用冷的1 mM HCl洗涤NHS活化的MagSepharose。加入VIII配体，偶联反应在24℃、pH 8.2下进行2小时15分钟。用0.1M乙酸/ 0.15M NaCl，pH 4.5，50 mM Tris/0.15M NaCl，pH 8.5和蒸馏水洗涤树脂。反应方案如下所示。
样品制备：将具有回收的血浆的塑料袋在冰水(温度约0-4℃)中缓慢解冻，以获得具有冷沉淀物的液体血浆。将解冻的血浆离心，收集沉淀中的冷沉淀物。倾倒出上清液(冷上清液)并将沉淀溶解在平衡缓冲液(溶解的冷沉淀物)中，初始血浆体积1/5。
分析：FVIII活性，vWF ELISA (浓度)，FIX和FIXa活性：使用商业试剂盒根据制造商的说明书分析FVIII、vWF、FIX和FIXa (活化的FIX)的存在。活性/浓度在下表中以mU/mL(m单位/mL)列出。使用来自Chromogenix的Coamatic FVIII试剂盒确定FVIII活性。vWF浓度使用来自Technoclone的Technozym vWF:Ag ELISA试剂盒确定。FIX和FIXa活性使用来自Rossix的商业试剂盒确定：Rox因子IX，Rox FIX-A，因子IXa校准剂，因子IXa对照。
实验1：使用Q-配体从溶解的冷沉淀物中纯化因子VIII和血管性血友病因子
A. 填充的色谱法柱
用填充的柱测试的色谱法条件：
柱：HiTrap Q HP 5 mL, HiTrap Capto Q ImpRes 5 mL。
柱体积(CV) 5 mL。
B.用磁珠的分批吸附
磁珠：MagSepharose Q原型树脂LS-000672，测试中5 mL树脂/管
MagSepharose Q测试是用5 mL树脂在50 mL带螺帽的塑料管中进行的。树脂和缓冲液/样品的孵育和混合通过摇动管手动进行，或在端对端旋转混合器中进行。然后将管置于Sepmag A 200 mL (Sepmag)中，其中磁珠被磁性吸引到管的侧面。用塑料巴斯德移液管除去澄清的液体。
表1：实验1的结果
定量下限(LOQ)对于FVIII是9 mU/mL，对于vWF是170 mU/mL。低于定量极限(LOQ)的值由＜LOQ表示。
如表1所示，在洗脱物部分中存在高产率的FVIII，并且使用MagSepharose Q原型树脂具有最高产率。
在洗涤步骤中部分除去vWF而没有任何FVIII损失。
实验1的结果令人惊讶地表明，使用具有Q-配体的磁珠获得FVIII的产率比使用常规Q-树脂高10-15%。
实验2：使用VIII Select配体从溶解的冷沉淀物中纯化因子VIII
还用偶联到MagSepharose珠的FVIII的亲和配体进行了测试。这种磁性原型树脂被称为MagSepharose VIII Select原型LS-034256。仅用MagSepharose VIII Select原型进行测试，没有与具有VIII Select树脂的填充的柱进行比较。条件与实验1中的条件相当，但使用不同的缓冲液。
表2：实验2的结果
定量下限(LOQ)对于FVIII是9 mU/mL，对于vWF是170 mU/mL。低于定量极限(LOQ)的值由＜LOQ表示。
*来自实验1的溶解在平衡缓冲液中的冷沉淀物的FVII活性值。用于在用MagSepharose VIII Select原型的测试中产率估计的值。
在洗脱物部分(洗脱物1-3和洗脱物4)中FVIII产率为51%。
vWF的产率低于LOQ，并且在亲和配体结合FVIII时预期低产率，并且不与FVIII复合的vWF不应共同纯化。
实验3：从冷上清液中纯化因子IX
A. 填充的色谱法柱
用填充的柱测试的色谱法条件：
柱：HiTrap Q FF 5 mL，HiTrap Capto Q 5 mL。柱体积(CV) 5 mL。
A.用磁珠的分批吸附
磁珠：MagSepharose Q原型树脂LS-000672，测试中5 mL树脂/管
MagSepharose Q测试是用5 mL树脂在50 mL带螺帽的塑料管中进行的。树脂和缓冲液/样品的孵育和混合通过摇动管手动进行，或在端对端旋转混合器中进行。然后将该管置于带有50 mL管的适配器的Sepmag A 200 mL (Sepmag)装置中，其中磁珠被磁性吸引到管的侧面。用塑料巴斯德移液管除去澄清的液体。
表3：实验3的结果
定量下限(LOQ)对于FIX为30 mU/mL，对于FIXa为0.2 mU/mL。低于定量极限(LOQ)的值由＜LOQ表示。
如表中所示，得到了产率良好的FIX，并且FIXa/FIX比率低。
在洗脱物部分中FIX活性的产率为80-85%。在MagSepharose Q原型树脂的洗脱物部分中FIXa/FIX的比例最低，表明FIX到FIXa的低活化。
总结
用磁珠的分批吸附被认为是温和的技术，这在纯化敏感血浆蛋白中是有利的。本发明人已经显示了使用具有合适配体的磁珠纯化溶解的冷沉淀物中的FVIII和vWF以及冷上清液中的FIX的产率和活性的优异结果。使用大体积的磁珠和仪器进行分离使得能够进行以前不可能进行大规模应用。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：具有突变型Fab结构域的多特异性结合蛋白