体内持续释放重组凝血因子ⅷ及其制备方法
阅读说明:本技术 体内持续释放重组凝血因子ⅷ及其制备方法 (In vivo sustained-release recombinant blood coagulation factor VIII and preparation method thereof ) 是由 康官烨 金泰润 柳在奂 金然汀 金用栽 于 2019-01-11 设计创作,主要内容包括:本发明提供了其中生物相容性聚合物与至少一个糖链的末端缀合的体内持续释放重组凝血因子VIII及其制备方法。根据本发明的体内持续释放重组凝血因子VIII具有通过比常规糖缀合技术更精细和更安全的方法修饰的蛋白质表面,并且具有免疫原性降低和体内持续性提高的优点。(The present invention provides an in vivo sustained release recombinant factor VIII in which a biocompatible polymer is conjugated to the end of at least one sugar chain, and a method for preparing the same. The in vivo sustained release recombinant factor VIII according to the present invention has a protein surface modified by a finer and safer process than the conventional glycoconjugate technology, and has advantages of reduced immunogenicity and improved in vivo persistence.)
技术领域
本发明提供了体内长效重组凝血因子VIII及其制备方法,所述体内长效重组凝血因子VIII具有这样的结构,其中生物相容性聚合物与至少一个糖链的末端连接。
背景技术
糖蛋白是指在表面上含有糖链的蛋白质,该糖链在蛋白质生产过程中在高尔基体中与蛋白质残基相连。在糖蛋白中,糖链的功能对蛋白质特性具有重要影响。例如,糖链可以改善蛋白质的水溶性,保护蛋白质免受蛋白酶的作用,降低蛋白质的免疫原性,决定蛋白质的细胞内转运的方向性和定位,或影响细胞间的相互作用(Function and 3D Structureof the N-Glycans on Glycoproteins,Int.J.Mol.Sci.2012,13,8398-8429)。
由于糖链的重要性,已经尝试通过糖工程来改善蛋白质特性。例如,对于***(EPO),向其引入两条额外的N糖链可以改善其在体内的半衰期(Glycoengineering:the effect of glycosylation on the properties of therapeutic proteins,J PharmSci.200594(8):1626-35)。另外,据报道,在癌细胞靶向抗体治疗的情况下,通过糖工程产生的缺少岩藻糖的抗体可以更好地诱导宿主的免疫应答并且具有更好的治疗效果(Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation,MAbs.20091(3):230-236)。这些使用糖工程的方法的优点在于可以使由副反应引起的副产物的产生最小化,并且与常规化学方法相比这样的方法是有效的。
同时,关于通过改变糖链来改善糖蛋白特性的方法,已经尝试应用代谢糖工程,从而以更复杂的方式实现糖链的改变;但是,其具体应用和商业用途还不充分。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供体内长效重组糖蛋白,其中生物相容性聚合物与引入到至少一个糖链的末端的唾液酸衍生物相连,优选提供凝血因子VIII,其中生物相容性聚合物与引入到至少一个糖链的末端的唾液酸衍生物相连。
本发明的另一个目的是提供用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法,其中应用代谢标记技术,使凝血因子VIII的至少一个糖链的末端的唾液酸被修饰成引入了叠氮基或炔基的唾液酸衍生物。
本发明的又一个目的是提供用于制备经修饰的体内长效重组凝血因子VIII的方法,其中通过将生物相容性聚合物到引入糖链末端的唾液酸衍生物来进行修饰。
问题解决方案
为了实现上述目的,在本发明的一个实施方案中,提供了一种体内长效重组凝血因子VIII,其包含与凝血因子VIII的至少一个糖链的末端的唾液酸衍生物连接的接头,其中所述接头由式1表示:
其中R1和R2各自独立地为C1-8烷基、C6-12芳基、C3-6环烷基、3至10元杂环烷基、氨基、(氨基)C1-6烷基、(氨基)C3-6环烷基、(氨基)C6-12芳基、(氨基)(3至10元杂环烷基)、或5至12元杂芳基(其中所述杂环烷基和杂芳基可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子,并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代;并且所述氨基可被选自H、卤素、CN、C1-6烷基、卤代C1-3烷基或C1-6烷氧羰基的至少一个取代基取代),或者R1和R2可彼此组合形成8至16元杂稠环(其中所述杂稠环可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子,并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代);并且
所述接头包含与R1、R2或当R1和R2彼此组合时形成的环中的至少一个连接的生物相容性聚合物。
另外,在本发明的另一个实施方案中,提供了用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法,其包括以下步骤:(1)将包含编码凝血因子VIII的核苷酸的表达载体引入宿主细胞;以及(2)在补充有具有与其连接的第一官能团的唾液酸代谢物衍生物的培养基中培养所述宿主细胞,以获得在其至少一个糖链的末端引入了唾液酸衍生物的凝血因子VIII,所述唾液酸衍生物具有与其连接的第一官能团。
另外,在本发明的另一个实施方案中,提供了用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法,其还包括以下步骤:(3)从所述培养基中除去所述唾液酸代谢物衍生物;(4)向所述培养基中添加具有与其连接的第二官能团和生物相容性聚合物的化合物,以允许进行点击反应;以及(5)收集在其至少一个糖链的末端连接有生物相容性聚合物的凝血因子VIII。
发明的有益效果
根据本发明的体内长效重组凝血因子VIII具有与存在于蛋白质表面上的糖链缀合的生物相容性聚合物(例如聚乙二醇),从而可以降低体内糖蛋白凝血因子VIII本身的免疫原性,并且可以改善其体内长效性能。另外,根据本发明的用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法通过使用重组DNA技术利用了糖蛋白表达中目的宿主细胞的正常糖代谢过程,从而在糖链和生物相容性聚合物之间的缀合中具有高效和准确的优点。因此,与使用糖缀合技术转化糖蛋白糖链的常规方法相比,可以以稳定且高效的方式提供修饰的经重组凝血因子VIII。
附图说明
图1示出了实施例1.1中将scFVIII G4 B3转染到宿主细胞中时使用的表达载体的图。
图2示出了实施例1.2中通过SDS PAGE分析scFVIII G4_B3的纯化过程而获得的结果。(泳道1:分子量标记,泳道2:细胞培养基浓缩物,泳道3:VIII选择洗脱液,泳道4:纯化的scFVIII G4 B3)。
图3示出了实施例2.1中的细胞培养过程及其每个循环的细节。
图4A和4B分别示出了表达具有Ac4ManNA1(N-(4-戊酰基)-甘露糖胺四酰化)的scFVIII G4 B3的细胞系以及表达不具有Ac4ManNA1的scFVIII G4 B3的细胞系的生长曲线和scFVIII G4 B3的表达水平。
图5示出了表达具有Ac4ManNAz的scFVIII G4 B3的细胞系以及表达不具有Ac4ManNAz(N-叠氮基乙酰甘露糖胺四酰化)的scFVIII G4 B3的细胞系的scFVIII G4 B3表达水平。
图6A示出通过用SDS PAGE分析scFVIII G4 B3 Az和纯化的scFVIII G4 B3 Az的糖PEG化反应产物获得的结果(泳道1:分子量标记,泳道2:scFVIII G4 B3 Az与20kDa DBCOPEG的反应产物,泳道3:scFVIII G4 B3 Az与30kDa DBCO PEG的反应产物,泳道4:scFVIIIG4 B3 Az与40kDa DBCO PEG的反应产物,泳道5:纯化的scFVIII G4 B3 Az)。
图6B示出通过用SDS PAGE分析scFVIII G4 B3 Az和纯化的scFVIII G4 B3 Az的糖PEG化反应产物获得的结果(泳道1:分子量标记,泳道2:纯化的scFVIII G4 B3 Az,泳道3:scFVIII G4 B3 Az与10kDa DBCO PEG的反应产物)。
图6C示出通过用SDS PAGE分析scFVIII G4 B3 Az的纯化形式和scFVIII G4 B3Az的糖PEG化反应产物获得的结果(泳道1:分子量标记,泳道2:纯化的scFVIII G4 B3 Az,泳道3:纯化的20kDa DBCO PEG缀合的scFVIII G4 B3 Az,第4道:分子量标记)。
图6D示出通过用SDS PAGE分析scFVIII G4 B3 Az的糖PEG化反应产物的纯化形式获得的结果(泳道1:分子量标记,泳道2:纯化的10kDa DBCO PEG缀合的scFVIII G4 B3Az)。
图7示出通过SDS PAGE中分析在Cu2+存在下将叠氮化物-PEG 40kDa添加至scFVIIIG4 B3 Al进行点击反应的情况下获得的产物而获得的结果。
图8示出了显示与非peg化的FVIII相比,静脉内施用糖PEG化FVIII后随时间推移血液中剩余的因子VIII的活性的图。
图9示出了显示与非peg化的FVIII相比,皮下施用糖PEG化FVIII后随时间推移血液中剩余的因子VIII的活性的图。
图10A示出了显示与非peg化的FVIII相比,皮下施用糖PEG化FVIII后随时间推移血液中剩余的因子VIII的活性的图。
图10B示出了显示与非peg化的FVIII相比,皮下施用糖PEG化FVIII后随时间推移血液中剩余的因子VIII的活性的图。
用于实施发明的最佳方式
在本发明的一方面,可以提供体内长效重组凝血因子VIII(因子VIII,FVIII),其包含与凝血因子VIII的至少一个糖链末端的唾液酸衍生物连接的接头,其中所述接头由式1表示:
其中R1和R2各自独立地为C1-8烷基、C6-12芳基、C3-6环烷基、3至10元杂环烷基、氨基、(氨基)C1-6烷基、(氨基)C3-6环烷基、(氨基)C6-12芳基、(氨基)(3至10元杂环烷基)、或5至12元杂芳基(其中所述杂环烷基和杂芳基可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子,并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代;并且所述氨基可被选自H、卤素、CN、C1-6烷基、卤代C1-3烷基或C1-6烷氧羰基的至少一个取代基取代),或者R1和R2可彼此组合形成8至16元杂稠环(其中所述杂稠环可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子,并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代);并且
所述接头包含与R1、R2或当R1和R2彼此组合时形成的环中的至少一个连接的生物相容性聚合物。
凝血因子VIII是其中糖链通过共价键与蛋白质残基连接的糖蛋白。已知修饰糖蛋白中蛋白质表面上的糖链可能影响蛋白质性质,例如改善蛋白质的水溶性,保护蛋白质免受蛋白酶的作用,以及决定蛋白质在细胞间相互作用中的方向性。
因此,本发明人利用代谢糖工程通过结构式1所示的接头将蛋白质糖链与生物相容性聚合物缀合,从而改善了凝血因子VIII的体内长效性能和稳定性,并且因此完成了本发明。
具体地,在本发明中,使用不需要催化剂(例如具有细胞毒性的铜)的叠氮化物-炔烃环化反应(点击反应)用生物相容性聚合物标记凝血因子VIII。与其他化学反应不同,该化学反应即使在体内也可以在前体上进行,这是因为先前已引入前体的反应基团是叠氮化物或炔烃,其使得化学反应得以发生而没有因体内存在的物质引起的任何干扰。
生物相容性聚合物可以是选自聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸(PSA)、聚唑啉和肝素前体(heparosan)的至少一种,优选聚乙二醇。
另外,聚乙二醇的重均分子量可以为5至40kDa、5至30kDa、或5至20kDa。分子量为40kDa或更低的小尺寸聚乙二醇的多重缀合可以降低在更高分子量的聚乙二醇缀合时发生的PEG毒性的可能性,进一步改善糖蛋白的半衰期,并改善在皮下施用时其生物利用。
另外,式1的结构可以是选自由式2至18及其异构体中的至少一种:
其中L可以是单键、卤素、C1-8烷基、C6-12芳基、-CO-、-R3CONR3-、-OCONR3-或-R3NCOR3-(其中R3可以各自独立地选自H、C1-4烷基和C6-12芳基),并且X是生物相容性聚合物。
特别的,该化合物可以是由式19至26表示的化合物中的任何一种,其中n是100至3,000的整数。
由A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2结构域构成的野生型因子VIII蛋白被表达为单链蛋白,并且然后在肝细胞中通过嘌呤成熟形成包含重链和轻链的280kDa的异二聚体。可以在本发明中修饰的因子VIII蛋白是可以由SEQ ID NO:1表示的正常因子VIII,并且优选是因子VIII的单链形式(scFVIII)。
另外,因子VIII蛋白包含以连续或非连续方式部分缺失的B结构域区域和部分缺失的α3结构域区域;并且包含以连续或非连续方式部分缺失的B结构域区域和部分缺失的α3结构域区域的因子VIII的单链形式可包含以下任一个:SEQ ID NO:2(从SEQ ID NO:1通过B结构域的氨基酸残基789-1653和α3结构域区域的缺失获得的形式)、SEQ ID NO:3(从SEQID NO:1通过B结构域的氨基酸残基833-1653和α3结构域区域的缺失获得的形式)、SEQ IDNO:4(从SEQ ID NO:1通过B结构域的氨基酸残基903-1653和α3结构域区域的缺失获得的形式)、SEQ ID NO:5(从SEQ ID NO:1通过B结构域的氨基酸残基966-1653和α3结构域区域的缺失获得的形式)、SEQ ID NO:6(从SEQ ID NO:1通过B结构域的氨基酸残基903-1653和1643-1653和α3结构域区域的缺失获得的形式)、SEQ ID NO:7(从SEQ ID NO:1通过B结构域的氨基酸残基966-1653和α3结构域区域的缺失获得的形式)、和SEQ ID NO:8(从SEQ IDNO:4通过氨基酸残基782处的异亮氨酸至半胱氨酸替换获得的形式)。
另外,因子VIII蛋白可包括多种经修饰的肽,即变体。可以在不改变因子VIII功能的范围内通过一个或更多个氨基酸的替换、缺失或添加来进行修饰。这些多种肽可以与SEQID NO:2至8的任一个氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高同一性。
另外,因子III蛋白中接头连接的糖链可包含在基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸残基42、239、582、757、784、828、900、963、1001、1005、1055、1066、1185、1255、1259、1282、1300、1412、1442、1810和2118的至少一个位置处。因此,包括单链因子VIII(scFVIII)在内的因子VIII蛋白可在表面上具有许多糖链,因此适用于通过应用根据本发明的代谢糖工程来修饰蛋白质表面。
另外,在本发明的另一方面,可以提供用于制备体内长效重组凝血因子VIII的方法,其包括以下步骤:(1)将包含编码凝血因子VIII的核苷酸的表达载体引入宿主细胞,以及(2)在补充有具有与其连接的第一官能团的唾液酸代谢物衍生物的培养基中培养宿主细胞。
在步骤(1)中,凝血因子VIII的序列可以是SEQ ID NO:2至8的氨基酸序列中的任何一个,并且核苷酸的核酸序列可以是SEQ ID NO:9至15的核苷酸序列中的任何一个。此外,核苷酸可以另外包含信号序列或前导序列。
如本文所用,术语“信号序列”是指编码指导融合蛋白分泌的信号肽的核酸。信号肽在宿主细胞中翻译,然后切割。具体地,本发明的信号序列是编码启动蛋白质通过内质网(ER)膜的运动的氨基酸序列的多核苷酸。可用于本发明的信号序列包括抗体轻链信号序列,例如抗体14.18(Gillies et al.,J.Immunol.Meth 1989.125:191-202),抗体重链信号序列,例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano et al.,Nature,1980.286:676-683),以及本领域已知的其他信号序列(例如Watson et al.,Nucleic Acid Research,1984.12:5145-5164)。
信号肽的特征是本领域周知的。信号肽通常包含16至30个氨基酸残基,并且可以包含更多或更少的氨基酸残基。典型的信号肽由三个区域组成,即碱性N末端区域、中央疏水区域和极性更大的C末端区域。
中央疏水区域包含4至12个疏水残基,其在未成熟多肽的运动过程中将信号序列固定在膜脂双层上。起始后,信号序列被细胞酶(通常称为信号肽酶)在ER内腔内切割。在此,信号序列可以是组织纤溶酶原激活物(tPa)的信号序列,单纯疱疹病毒糖蛋白D(HSVgD)的信号序列或生长激素的分泌信号序列。优选地,可以使用在包括哺乳动物等的高等真核细胞中使用的分泌信号序列。另外,对于本发明的分泌信号序列,可以使用野生型IL-7中包含的信号序列,或者可以用宿主细胞中具有高表达频率的密码子取代并使用。
另外,表达载体是可以被引入宿主细胞并且可以与宿主细胞的基因组重组并***宿主细胞的基因组的载体。载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒、RNA载体、病毒载体及其类似物。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。另外,质粒可以包含选择标记,例如抗生素抗性基因,并且可以在选择条件下培养包含质粒的宿主细胞。
另外,如本文所用,术语“宿主细胞”是指可将重组表达载体引入其中的原核或真核细胞。如本文所用,术语“转导”、“转化”和“转染”是指使用本领域已知的技术将核酸(例如载体)引入细胞中。通过用本发明的核苷酸序列转导或转染,合适的宿主细胞可用于表达和/或分泌因子VIII蛋白。可用于本发明的优选宿主细胞包括大肠杆菌、永生杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、HeLa细胞、人羊水衍生细胞(CapT细胞)、或COS细胞。例如,在本发明中用于表达因子VIII蛋白的最优选的宿主菌株是CHO-S,并且其基因和使用该菌株的方法是本领域已知的。
另外,在步骤(2)中,在培养宿主细胞时,补充具有与其连接的第一官能团的唾液酸代谢物衍生物,从而通过宿主细胞蛋白的唾液酸代谢途径将具有与其连接的第一官能团的唾液酸衍生物引入凝血因子VIII的糖链末端。即,在步骤(2)中,可以用连接有第一官能团的唾液酸衍生物修饰凝血因子VIII。
在此,第一官能团可以是叠氮基或炔基。此外,唾液酸代谢物衍生物可以包含乙酰基或烷基,例如乙基和丙基,以便有效地递送到细胞中。烷基与具有与其连接的第一官能团的唾液酸代谢物的羟基形成酯键,以促进其细胞渗透;并且在细胞渗透后,通过细胞内酯酶去烷基。因此,烷基不阻止补充的唾液酸代谢物取代糖链的一部分。
另外,在步骤(2)中,可以代替唾液酸代谢物(凝血因子VIII的唾液酸生物合成途径中的中间物质)的唾液酸代谢物衍生物可以是选自式27至32至少一种化合物,及其异构体:
同时,在步骤(2)中,当源自动物细胞的宿主细胞的细胞浓度为1.0×105或更高时,可以以0.1至300uM(微摩尔)的浓度补充唾液酸代谢物衍生物。由于本发明的方法利用了细胞的糖代谢过程,因此具有与其连接的第一官能团的唾液酸代谢物不仅可以替换靶凝血因子VIII的一部分,而且可以替换与宿主细胞中的所有糖蛋白相关的代谢产生的代谢物的一部分。因此,为了高效率地将第一官能团引入到凝血因子VIII中以进行糖链修饰,当宿主细胞具有高细胞浓度时,优选细胞浓度为1.0×105或更高时,优选补充唾液酸代谢物衍生物。
宿主细胞优选如下培养。在宿主细胞的生长阶段,进行其培养而无需补充唾液酸代谢物衍生物;在达到一定的细胞生长水平后,将细胞培养条件改变为降低细胞生长速率并维持细胞存活的条件;然后在补充有具有第一官能团的唾液酸代谢物衍生物的培养基中培养宿主细胞。在宿主细胞的生长降低时补充的唾液酸代谢物可以以比细胞生长时更高的速率引入靶蛋白的糖链上的唾液酸中。
在此,作为降低细胞生长速度的条件,一种方法使将温度调节至低温或限制培养基中营养成分。具体地,当将培养温度从细胞生长阶段的37℃改变至补充唾液酸代谢物衍生物时的29℃至35℃时,细胞生长可能会减慢,而靶蛋白(凝血因子VIII)的表达可以持续10天或更长时间。另外,可以降低细胞培养基中营养物(例如生物生长因子、维生素和必需氨基酸)的浓度。另外,在对因子VIII的糖链进行代谢标记的情况下,添加诸如丁酸等物质会影响细胞周期,从而阻止细胞生长并保持因子VIII的原样表达,从而提高了具有第一官能团的唾液酸衍生物引入因子VIII的糖链的比例。
另外,该方法还可包括以下步骤:(3)在从步骤(2)纯化糖链包含具有与其连接点第一官能团的唾液酸衍生物的凝血因子VIII之后,从培养基中除去唾液酸代谢物衍生物;(4)向所述培养基中添加具有与其连接的第二官能团和生物相容性聚合物的化合物,以允许进行点击反应;以及(5)收集在其至少一个糖链的末端连接有生物相容性聚合物的凝血因子VIII。
为了使凝血因子VIII中的唾液酸衍生物的第一官能团与第二官能团反应,必须除去在培养基中过量存在的唾液酸代谢物衍生物。
在此,第一官能团可以是叠氮基或炔基。另外,当第一官能团为叠氮基时,第二官能团为炔基或环炔基;并且当第一官能团是炔基时,第二官能团可以是叠氮基。
具体地,在步骤(4)中,可以使用点击反应对根据本发明的方法中步骤(2)的具有引入到靶蛋白的糖链的叠氮基或炔基的唾液酸衍生物进行生物相容性聚合物的缀合。例如,当在步骤(2)中使用具有与其连接的叠氮基的唾液酸代谢物衍生物时,在步骤(4)中可使用具有与其连接的炔基或环炔基和生物相容性聚合物的化合物;并且当在步骤(2)中使用具有与其连接的炔基的唾液酸代谢物衍生物时,在步骤(4)中可使用具有与其连接的叠氮基和生物相容性聚合物的化合物。
在步骤(4)中,具有与其连接的第二官能团和生物相容性聚合物的化合物优选为选自式33至49及其异构体的至少一种化合物,及其异构体:
其中L可以是单键、卤素、C1-8烷基、C6-12芳基、-CO-、-R3CONR3-、-OCONR3-或-R3NCOR3-(其中R3可以各自独立地选自H、C1-4烷基和C6-12芳基),并且X是生物相容性聚合物。
另外,在步骤(4)中收集的凝血因子VIII包含由式1表示的接头,其与至少一个糖链末端的唾液酸衍生物连接,并且其具体性质或实例如上文对于根据本发明的体内长效重组凝血因子VIII所述:
其中R1和R2各自独立地为C1-8烷基、C6-12芳基、C3-6环烷基、3至10元杂环烷基、氨基、(氨基)C1-6烷基、(氨基)C3-6环烷基、(氨基)C6-12芳基、(氨基)(3至10元杂环烷基)、或5至12元杂芳基(其中所述杂环烷基和杂芳基可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子,并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代;并且所述氨基可被选自H、卤素、CN、C1-6烷基、卤代C1-3烷基或C1-6烷氧羰基的至少一个取代基取代),或者R1和R2可彼此组合形成8至16元杂稠环(其中所述杂稠环可各自独立地包含选自N、S和O的至少一个杂原子,并且可各自独立地被选自卤素、C1-4烷基和CF3的至少一个取代基取代);并且
所述接头包含与R1、R2或当R1和R2彼此组合时形成的环中的至少一个连接的生物相容性聚合物。
具体实施方式
在下文中,将通过实施例更详细地描述本发明。然而,以下实施例仅用于说明本发明,并且本发明的范围不限于此。具体地,将针对scFVIII G4 B3来描述本发明的技术,scFVIII G4 B3是由本发明人在此专利申请之前提交的专利申请(PCT/KR2017/006633)中生产的多种scFVIII中的一种scFVIII。然而,在描述本发明的技术时选择一种cFVIII的原因不是因为所选择的scFVIII具有特定的优点,而是仅作为一个实施方案使将要呈现的技术描述更加清楚。
实施例1.重组单链(sc)因子VIII的制备
实施例1.1 表达scFVIII的细胞系的产生
使用本发明人提交的专利申请(PCT/KR2017/006633)中描述的表达编码scFVIIIG4 B3(SEQ ID NO:8的氨基酸序列)的DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:15的核苷酸序列)的载体(参见图1)来转化CHO-S细胞系。转化之后,将CHO-S细胞系在500mM或更高的甲氨蝶呤(MTX)存在下传代,并选择scFVIII G4 B3高表达细胞系(CHO-S G4 B3)。将所选细胞系CHO-S G4B3克隆在CD FortCHO细胞培养基中繁殖,然后保存在氮气罐中。
实施例1.2 scFVIII的培养和纯化
将选择的scFVIII G4 B3高表达细胞系CHO-S G4 B3加入CD FortCHO培养基,使细胞数为3×105/mL,然后进行细胞培养4天。细胞培养后,收集培养基并纯化表达的scFVIIIG4 B3。为了从培养基中纯化scFVIII,向表达scFVIII G4 B3的培养基中加入5M NaCl溶液,使NaCl的终浓度为1.0M,然后使培养基通过0.2μm膜过滤器以除去细小的悬浮物。然后,将滤液注入用FVIII选择平衡溶液(20mM组氨酸,5mM CaCl2,1M NaCl,0.02%pH7.0)平衡的FVIII选择树脂(GE Healthcare)中,以使scFVIII G4 B3附着于其上。然后,使用VIII选择平衡缓冲液除去杂质,并使用VIII选择洗脱缓冲液(20mM组氨酸,5mM CaCl2,0.9M精氨酸,45%丙二醇,0.02%pH 6.5)进行洗脱(使用亲和色谱)。接下来,将VIII选择洗脱液用离子交换色谱的平衡缓冲溶液(20mM组氨酸,5mM CaCl2、0.02%pH 7.0)稀释5倍或更多,然后注用离子交换色谱的平衡缓冲溶液平衡的SPSepharose快速流动离子交换色谱树脂(GE Healthcare)中。
之后,使用离子交换色谱的平衡溶液除去杂质,并用离子交换色谱洗脱液(20mM组氨酸,5mM CaCl2,0.02%400mM NaCl,pH6.5)洗脱纯scFVIII G4 B3。通过以下实施例1.3中所述的CS测定法定量纯化的scFVIII G4 B3的FVIII活性。在各纯化阶段进行以分析中间物质的SDS PAGE的结果如图2所示。
实施例1.3 scFVIII活性的测定
通过CS法测量纯化的scFVIII G4_B3的FVIII活性。为了通过生色法测量活性,将CHROMOGENIX出售的生色测定试剂盒用于终点法。使用由制造商提供的测试方法进行测试,其进行了如下修改以适合于该测试。具体地,使用1×稀释缓冲液将样品稀释至落入标准范围内(0.25至1IU/mL)。使用1×稀释缓冲液制备标准品(校准血浆),以具有0、0.25、0.5、1IU/mL的浓度。将由此制备的样品和标准品各10mL用790mL的1x稀释缓冲液稀释。然后,将每种稀释液50uL分配到96孔板中,并在37℃下静置5分钟。使用自动分配器将50uL的每种试剂样品分配到每个孔中,并使反应在37℃下进行2分钟。将50uL底物分配到每个孔中,然后在显影前在37℃下静置2分钟。向显影的样品中加入50uL的2%柠檬酸,以终止反应。在405nm的波长处测量吸光度以绘制线性校准曲线。然后,将样品的吸光度放入校准曲线以测量样品的活性,结果示于下表1中。纯化的scFVIII G4_B3的活性为约7,000IU/mg,与旨在治疗血友病的市售重组FVIII
类似。因此,确定了纯化的scFVIII G4_B3具有足以用作血友病治疗剂的活性水平。[表1]
样品物质
比活性(IU/mg)
scFVIII G4_B3
7,166
FVIII
6,000至7,000
实施例2.使用糖代谢标记法标记scFVIII
实施例2.1.用Ac4ManNAl标记scFVIII
将CHO-S scFVIII G4 B3细胞系悬浮于细胞培养基(CD FortiCHO)中至细胞浓度为0.3至3.0×106,然后在37℃和5%CO2的条件下以140rpm的搅拌进行细胞培养4天。当细胞浓度达到一定水平时,补充Ac4ManNAl(N-(4-戊酰基)-甘露糖胺-四酰化)至终浓度为100uM,然后在31℃和5%CO2的条件下以140rpm的搅拌进行细胞培养24小时。细胞培养完成后,将细胞培养基以1,000rpm离心以除去培养基,然后将收集的细胞悬浮于补充有终浓度为100uM的Ac4ManNA1的细胞培养基(CD FortiCHO)中,使得细胞浓度调节至约0.1至1.5×107的水平。然后在31℃和5%CO2的条件下以140rpm的搅拌进行细胞培养24小时。随后,使细胞培养周期进行三次或更多次(伪灌注周期),每个周期涉及其中在与上述相同的条件下进行培养的过程,同时每24小时将细胞培养基更换为补充有终浓度为100uM的Ac4ManNA1的新鲜细胞培养基。细胞培养过程在图3中示出。
为了确定向培养基中补充Ac4ManNA1对scFVIII G4 B3细胞生长和scFVIII G4 B3表达的影响,在最初的4天细胞生长期后,允许用未补充Ac4ManNA1的细胞培养基进行后续细胞培养周期,使得根据FVIII活性比较细胞生长和scFVIII G4 B3的表达。补充100uM的Ac4ManNA1对CHO-S scFVIII G4 B3细胞的生长和scFVIII G4 B3的表达没有明显影响。没有Ac4ManNAl的情况下的最初4天培养使细胞浓度达到约1.0×107细胞/mL,并且在补充100uM Ac4ManNAl之后进行的后续培养使细胞浓度达到1.7×107细胞/mL的水平。然后,细胞浓度维持在恒定水平。如图4A的生长曲线和图4B的表达水平图所示,确定了scFVIII G4B3以类似的水平表达,而不管100μM的Ac4ManNA1的补充。因此,可以看出,在用于培养的浓度范围内补充Ac4ManNA1对表达scFVIII G4 B3的细胞系的生长和scFVIII G4 B3的表达水平没有显著影响。
实施例2.2 用Ac4ManNAz标记scFVIII
在与实施例2.1相同的方法中以类似方式培养ScFVIII G4 B3细胞,其中补充100uM的Ac4ManNAz(N-叠氮基乙酰甘露糖胺-四酰化)而不是Ac4ManNA1。在每个传代周期中,在最初的3天培养后,用体积对应于实施例2.1中传代培养基体积的50%的传代培养基进行培养,以维持高细胞浓度。与Ac4ManNA1类似,补充100uM的Ac4ManNAz对细胞生长和scFVIII表达没有明显影响。关于细胞浓度,从培养移至31℃后的第4天开始,如实施例2.1中每天用相同体积的新鲜培养基更换培养基。scFVIII G4 B3细胞维持在1.5×107或更高的水平,直到培养结束;并且细胞活力维持在90%或更高,直到培养结束。如图5中所示,scFVIII G4 B3的表达水平与在实施例2.1中在补充Ac4ManNA1的同时培养scFVIII G4 B3细胞的情况下获得的表达水平相似。总之,发现补充用于培养的浓度补充Ac4ManNAz对scFVIII G4 B3细胞系的细胞生长或scFVIII G4 B3的表达没有显著影响。
实施例3.经修饰的scFVIII的制备
实施例3.1.用叠氮基或炔基基标记的scFVIII的纯化及其活性测定
以与上文实施例1.2中对于scFVIII G4 B3所述相同的方法,纯化使用Ac4ManNAz和Ac4ManNAl分别用叠氮基和炔基标记的scFVIII G4 B3Az(用标记Ac4ManNAz)和scFVIIIG4 B3A1(用Ac4ManNA1标记)。还以与上文实施例1.3中相同的方法进行纯化的scFVIII G4B3Az和scFVIII G4 B3Al的活性测量,并且结果如下表2中所示。CS活性测量表明,纯化的scFVIII G4 B3Az和scFVIII G4 B3A1的比活性与scFVIII G4 B3的类似,如表2中所示。从这些结果中发现,用Ac4ManNAz或Ac4ManNAl通过二醇代谢标记法标记scFVIII G4 B3对scFVIII G4的活性没有影响。
[表2]
实施例3.2.通过点击化学制备糖PEG化scFVIII
实施例3.2.1.利用Cu2+单击化学制备糖PEG化scFVIII
在交换至缀合缓冲液(20mM HEPES,150mM NaCl,5mM CaCl2,0.01%(w/v)
pH 7.5)之后,向实施例3.1中纯化的scFVIII G4B3Az中加入DBCO-PEG10kDa、DBCO-PEG20kDa、DBCO-PEG30kDa,使得DBCO-PEG(10kDa、20kDa、30kDa)与scFVIII G4 B3Az的每种摩尔比为100∶1。然后,使反应在4℃下进行48小时,从而产生糖PEG化scFVIII(DBCOPEG 10kDa-scFVIII G4 B3Az、DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3Az、DBCO-PEG30kDa-scFVIII G4 B3Az)。如图6A和6B所示,确定了大多数scFVIII G4 B3 Az(其糖已被Ac4ManNAz修饰的scFVIII)与DBCO PEG缀合。另外,确定了与用Ac4ManNAz修饰scFVIII的糖链中的多个唾液酸分子的事实一致,发生了多个缀合以形成聚合物缀合物的混合物。通过相同的方法纯化以上的DBCOPEG10kDa-、DBCOPEG20kDa-和DBCOPEG30kDa-scFVIII。具体地,将反应偶联物注入用平衡缓冲液(20mM HEPES,5mM CaCl2,0.02%(w/v))平衡的DEAE Sepharose快速流动离子交换树脂中用于附着,然后用洗涤缓冲液(20mM HEPES,5mM CaCl2,0.02%(w/v))除去未PEG化的scFVIII G4 B3Az。然后,用洗脱缓冲液(20mM HEPES,5mM CaCl2、500mM NaCl,0.02%(w/v))洗脱糖PEG化scFVIIIG4 B3Az。通过SDS PAGE检查糖PEG化反应产物和纯化的糖PEG化scFVIII,结果示于图6C。如上文实施例1.3中所述通过CS法测量洗脱的糖PEG化scFVIII(DBCOPEG10kDa-scFVIII、DBCOPEG20kDa-scFVIII、DBCOPEG30kDa-scFVIII)的活性。如表3所示,与糖PEG化之前的scFVIII G4_B3Az相比,其活性没有降低。结果,发现用Ac4ManNAz代谢标记和随后的糖PEG化不会降低scFVIII G4 B3Az的活性。[表3]
实施例3.2.2 使用Cu2+单击化学法产生糖PEG化单链FVIII
在交换至缀合缓冲液(20mM HEPES,150mM NaCl,5mM CaCl2,0.01%(w/v)
)中之后,向实施例3.1中纯化的scFVIII G4 B3 Al中加入叠氮化物-PEG40kDa(Nanocs,PG1-AZ-40k),使得叠氮化物-PEG40kDa与scFVIII G4 B3 Al的摩尔比为1∶100。为了引发scFVIII G4 B3Al和叠氮化物-PEG40kDa之间的缀合反应,添加了Gu2+和THPTA,使得Cu2+的终浓度为0.1mM,并且THPTA的终浓度为0.5mM;然后添加抗坏血酸盐,使抗坏血酸盐的终浓度为5mM。然后,使反应在室温下进行24小时。通过SDS PAGE检查缀合反应产物,并且结果示于图7中。大多数scFVIII G4 B3 A1被缀合。这意味着scFVIII G4 B3的大多数糖链都通过Ac4ManNAl被炔烃修饰。在24小时的缀合反应之后,如实施例1.3中所述通过CS法测量缀合反应产物的活性。确定了与缀合反应之前的scFVIII G4 B3 A1中的FVIII的活性相比,缀合物的活性损失了50%或更高。推测这些结果是由于通过Cu2+和抗坏血酸反应产生的自由基被添加到炔烃标记的scFVIII B3 G4A1和叠氮化物-PEG40kDa之间的缀合反应中,导致scFVIII G4 B3 Al蛋白的变性。实施例4.具有聚乙二醇标记的糖链的scFVIII的体内长效性能的评价
实施例4.1.通过静脉内施用之后的药代动力学
通过静脉内注射通过实施例3.1和实施例3.2.1制备的聚乙二醇标记的scFVIII(糖PEG化scFVIII)来向血友病小鼠施用。然后,测量其药代动力学。通过13周龄雌性血友病小鼠(B6;129S4-F8tm1Kaz/J(FVIII敲除))的尾静脉静脉注射来施用DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az、DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az和阳性对照然后,测量血液中残留的FVIII的活性多至72小时。DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az、DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az和分别通过静脉内尾静脉注射以200IU/kg的剂量施用;并且在固定时间点(2分钟、6小时、16小时、30小时、40小时、48小时、64小时、72小时)从每只小鼠的眶后静脉窦收集血液。向收集的血液中加入抗凝剂(3.2%柠檬酸钠),使抗凝剂的终浓度为10%(v/v)。然后,进行离心以获得血浆。通过如实施例1.3中所述的CS测量方法进行施用的物质的定量和血浆中残留的FVIII的活性的定量。在各时间点从每个样品组中的小鼠收集的血浆中残留的FVIII的活性示出在图8中。另外,基于血浆中残留的FVIII活性的测量值,使用WinNonlin软件通过非隔室分析(NCA)方法从中推导PK参数,并且结果示于表4。从最初的2分钟到72小时,基于小鼠的平均FVIII活性计算DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az和DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az各自的半衰期。与
相比,半衰期分别提高了2.8倍(对于DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az)和3.2倍(对于DBCOPEG30kDa-scFVIII G4B3 Az)。与相比,曲线下面积(AUCINF)也分别增加了3.7倍(对于DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az)和5.1倍(对于DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az)。因此,确定了在通过静脉内施用的情况下,与现有的FVIII相比,根据本发明制备的经修饰的因子VIII蛋白在体内保留了长的时间,并且相应地表现出长效作用。[表4]
实施例4.2.1 通过皮下注射施用后的药代动力学
进行药代动力学测试,其中通过皮下注射通过实施例3.1和实施例3.2产生的糖PEG化scFVIII来向血友病小鼠施用。通过皮下注射作为糖PEG化scFVIII的DBCOPEG10kDa-scFVIII G4 B3 Az和阳性对照
来向13周龄的性血友病小鼠(B6;129S4-F8tm1Kaz/J(FVIII敲除))施用。然后,测量血液中残留的FVIII的活性多至48小时。基于FVIII活性(基于FVIII的国际滴度标准的滴度),通过以380IU/kg的剂量皮下注射每种样品来向小鼠施用;并且在固定的时间点(1小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时)从每只小鼠的眶后静脉窦收集血液。向收集的血液中加入抗凝剂(3.2%柠檬酸钠),使抗凝剂的终浓度为10%(v/v)。然后,进行离心以获得血浆,并将血浆冷冻保存直至测量FVIII活性。在各时间点从每个样品组中的小鼠收集的血浆中残留的FVIII的活性示出在图9中。基于血浆中残留的FVIII活性的测量值,使用WinNonlin软件通过非房室分析(NCA)方法从中推导PK参数,并且结果示于表5(在皮下施用DBCOPEG10kDa-scFVIII G4 B3 Az的情况下获得的药代动力学参数)。每只小鼠中DBCOPEG10kDa-scFVIII G4 B3 Az的终末半衰期对应于14至24小时的水平,并且与实施例4.1中的半衰期相比,该水平增加了1.8至3.2倍。与在小鼠中皮下施用的情况下现有FVIII的生物利用度小于1%的事实(2015年美国血液学会年会(ASH),重组FVIIIFc-VWF-XTEN在A型血友病小鼠中皮下施用后显示出显著的生物利用度)一致,在皮下施用的情况下在血液中未观察到的水平。然而,在长至48小时的时间内观察到DBCOPEG10kDa-scFVIII G4 B3 Az,其水平足够高以引起血友病小鼠中出血的止血反应。这意味着糖PEG化scFVIII的DBCOPEG10kDa-scFVIII G4 B3 Az在皮下环境中是稳定的,甚至在进入血液后也稳定,从而显示出比现有FVIII更高的生物利用度。结果发现,与现有的FVIII不同,可以将作为糖PEG化scFVIII的DBCOPEG10kDa-scFVIII G4 B3 Az开发为皮下制剂。[表5]
T<sub>1/2</sub>(hr)
T<sub>max</sub>(hr)
C<sub>max</sub>(IU/mL)
AUC<sub>last</sub>(hr*IU/mL)
AUC<sub>INF_obs</sub>(hr*IU/mL)
19.2
18.7
0.618
18.1
21.7
实施例4.2.2 通过皮下注射施用后的药代动力学
通过静脉内注射通过实施例3.1和实施例3.2.1产生的糖PEG化scFVIII来向血友病小鼠施用。然后,测量其药代动力学。分别通过皮下注射作为糖PEG化scFVIII的DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az和DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az向13周龄的雌性血友病小鼠(B6;129S4-F8tm1Kaz/J(FVIII敲除))施用。然后,在各个时间点测量血液中残留的FVIII的活性。基于FVIII活性,通过以180IU/kg的剂量皮下注射DBCOPEG20kDa-scFVIIIG4 B3 Az和DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az来向小鼠施用;并且在固定的时间点(1小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、72小时)从每只小鼠的眶后静脉窦收集血液。向收集的血液中加入抗凝剂(3.2%柠檬酸钠),使抗凝剂的终浓度为10%(v/v)。然后,进行离心以获得血浆,并将血浆冷冻保存直至测量FVIII活性。通过如实施例1.3中所述的CS测量方法进行施用物质和血浆中残留的FVIII的活性的定量。为了计算皮下施用后获得的生物利用度,在实施例4.1中,将以200IU/kg的剂量静脉内施用DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az和DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az所获得的AUC用皮下施用剂量180IU/kg进行校准,从而计算生物利用度。通过该校准计算的生物利用度表示如下:(AUCsc/AUCiv)×(doseiv/dosesc)(AUCsc:皮下施用后获得的AUC;AUCiv:静脉内施用后获得的AUC;doseiv:静脉内施用剂量;dosesc:皮下施用剂量)。对于FVIII和FVIII的PEG缀合物,血液中的体内降低率仅取决于该物质的浓度,这使得可以通过校准初始浓度来预测静脉内施用后获得的血液浓度(JThromb Haemost 2017 15(6):1106-1114 Population pharmacokinetics ofrecombinant coagulation factor VIII-SingleChain in patients with severehemophilia A;ISTH 2017 pharmacokinetics of N8-GP(turoctocog alfa pegol)dosedsubcutaneously to non-human primates and prediction of human PK profile)。在各时间点从皮下施用样品的小鼠组收集的血浆中残留FVIII的活性示出在图10中。基于每个小鼠组血浆中FVIII活性的平均值,使用WinNonlin软件通过非房室分析(NCA)方法从中推导出PK参数,并且结果示于表6中。DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az和DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az的终末半衰期分别为14.6小时和16.9小时。皮下施用后获得的
的曲线下面积(AUC)小于1%,而在皮下注射的情况下,DBCOPEG20kDa-scFVIIIG4 B3 Az和DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az的生物利用度分别为35%和43%。即,发现根据本发明的糖PEG化scFVIII具有明显高于现有FVIII的生物利用度,从而表明作为糖PEG化scFVIII的DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az和DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az与现有的FVIII不同,其可以开发为皮下制剂。因此,推断通过本发明的方法生产的DBCOPEG20kDa-scFVIII G4 B3 Az和DBCOPEG30kDa-scFVIII G4 B3 Az由于以下原因而使得在皮下施用时具有高生物利用度:在皮下环境中,其比与现有FVIIII更稳定,并且被更完全保护免于蛋白水解酶,因此具有有效的抗性,从而提高了其生物利用度。
[表6]
*(AUCsc/AUCiv)×(doseiv/dosesc)
从这些结果中,确认了通过本发明的方法用聚乙二醇聚合物修饰的scFVIII在体内(即在血液和皮下组织)可以保留比作为现有FVIII的
更长的时间,因此药物的治疗功效可以维持更长的时间。如上所述,已经参考本发明的实施方案描述了本发明。但是,本领域技术人员将理解,在不脱离权利要求书中所描述的本发明的精神的前提下,可以通过对组成部件进行添加、变更、删除等来对本发明进行各种修改和改变,并且这样的修改或改变也包括在本发明的范围内。