一种樟油痤疮凝胶剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种樟油痤疮凝胶剂及其制备方法 (Camphor oil gel for treating acne and preparation method thereof ) 是由 张丹 刘明华 张红 李华 孙玉红 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种樟油痤疮凝胶剂及其制备方法,其制备方法包括以下步骤：将经过酶辅助-水蒸气蒸馏法提取的油樟挥发油以及经过冷凝回流提取的黄连和连翘提取液,加入水溶性基质、pH调节剂、保湿剂、防腐剂以及增凝剂,搅拌均匀,制得樟油痤疮凝胶剂。本发明采用酶辅助-水蒸气蒸馏法并结合特定的工艺参数,使得油樟中的主要品质成分浸出量大,浸出品质高。本发明的樟油痤疮凝胶剂,通过添加卡波姆、甘油和三乙醇胺,制得的凝胶剂透明、细腻,色泽一致,无团块,几乎没有气泡,易于涂布,且久置而不变色。凝胶剂无油腻感、能吸收组织渗透液、易途展和洗除、载药量大,在生活中运用比较广泛。(The invention discloses a camphor oil acne gel and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: adding water-soluble matrix, pH regulator, humectant, antiseptic and coagulant into the volatile oil extracted by enzyme-assisted steam distillation and the extractive solution of Coptidis rhizoma and fructus forsythiae extracted by condensing and refluxing, and stirring to obtain the final product. The method adopts an enzyme-assisted steam distillation method and combines specific process parameters, so that the main quality components in the cinnamomum camphora have large leaching amount and high leaching quality. The camphor oil acne gel is transparent and fine, has consistent color, no lumps and almost no bubbles, is easy to coat, and does not change color after being placed for a long time by adding carbomer, glycerol and triethanolamine. The gel has no greasy feeling, can absorb tissue penetrating fluid, is easy to spread and wash out, has large drug-loading capacity, and is widely applied in life.)
技术领域
本发明属于凝胶剂制备技术领域，具体涉及到一种樟油痤疮凝胶剂及其制备方法。
背景技术
油樟是樟科中的珍贵树种，树干及枝叶均含芳香油，挥发油的主要成分为桉叶油素、芳樟醇及樟脑等。樟油气味清新持久，是天然香料挥发油的一种，具有抗菌、杀虫、抗氧化、祛湿解毒、趋避蚊虫等作用，同时对多种药物具有良好的透皮渗透作用，用途广泛，主要用于医药和香料方面，在国外市场需求旺盛。
痤疮是一种常见于青春期男女的毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，临床表现不一，从生理性粉刺到炎症性丘疹、脓疱、结节、囊肿，严重者还易形成瘢痕、面部黑色素沉积。而痤疮主要发于面部，严重影响了病人的面部美观，由此给患者的心理造成很大的负担与阴影，进而影响患者的生活、学习和工作。目前痤疮的治疗方法大致分为西药治疗，中西药结合治疗，中药治疗三类。西药治疗丙酸杆菌所导致的皮肤疾病的外用药物多为抗生素类的化学制剂，这些药物虽具有一定的疗效，但是易产生耐药菌株并且副作用较大。中西药结合较单纯西药治疗降低了毒副作用，而因中医药治疗痤疮有更好的疗效，见效更快，副作用小，用法简单等优点广泛地被人们所接纳。
由于樟油的提取工艺常用水蒸气蒸馏法，存在芳香性化合物易被分解或水解、提取率低、提取过程时间长、热不稳定等缺点，并且目前并没有研究人员开发出科学合理、安全有效的樟油痤疮制剂，因此利用樟油提取物开发一种具有高度敏感抑菌效果的痤疮剂是目前研究的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种樟油痤疮凝胶剂及其制备方法，可以提取出质量和含量均较高的樟油挥发油，并且可以制备出对于金黄色葡萄球菌具有高度敏感抑菌作用的痤疮凝胶剂。
为达上述目的，本发明提供了一种樟油痤疮凝胶剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：利用酶辅助-水蒸气蒸馏法对油樟叶进行提取，得油樟挥发油；
S2：利用冷凝回流提取法分别对黄连和连翘进行提取，得黄连提取液和连翘提取液；
S3：将油樟挥发油、黄连提取液和连翘提取液混合，加入水溶性基质、pH调节剂、保湿剂、防腐剂以及增凝剂，搅拌均匀，制得樟油痤疮凝胶剂。
采用上述方案的有益效果是：本发明采用特定的酶辅助-水蒸气蒸馏法，提取时间短，提取成分稳定，提取率高，并且减少了芳香性化合物被分解或水解的几率，降低了主要成分的损失。通过酶辅助-水蒸气蒸馏法可以最大限度地破坏β-1,4糖苷键消溶细胞壁，由于细胞壁的损伤程度逐步提高，有效物质溶出阻力降低，因此可以得到最高地油樟挥发油得率。
进一步地，酶辅助-水蒸气蒸馏法包括以下步骤：将自然干燥后粉碎的油樟叶片加入酶进行预处理，再进行蒸馏提取得到挥发油，将挥发油冷却至室温后离心，取上清液脱水，制得油樟挥发油。
进一步地，酶预处理包括以下过程：将油樟叶片与蒸馏水以料液比为1:10-12g/mL的比例混合后，加入pH为5.0的酶溶液，于40-60℃的水浴条件下恒温搅拌40-60min；其中酶溶液与油樟叶片的比例关系为100U：1g。
采用上述方案的有益效果是：植物细胞内有效成分的溶出是一个循序渐进的过程，这一过程时间的长短随植物种类与环境条件不同而有所差异。有效成分想要达到最大溶出量，酶解反应必须持续一定的时间。但酶解时间过长可能会导致酶与溶出物发生了反应或有效成分溶出受到酶解产物的阻碍，而使溶出率降低。pH值可以更大程度地影响酶的活性，使酶可以最大限度的破环β-1,4糖苷键消溶细胞壁，也不会因为pH值过高而降低酶解作用。同时温度温度升高时酶促反应会加快消溶细胞壁进程，但是由于酶的本质是蛋白质大分子化合物，故温度超过酶解最适温度范围就会使酶逐步变性，酶的立体构象与活力位点发生改变使酶活力的下降或丧失，从而影响混合酶对油樟叶的酶解效果，不利于油樟挥发油的提取，因此最佳酶解温度为50℃。
进一步地，酶溶液为半纤维素酶溶质和纤维素外切酶溶质以质量比为1:1的比例混合后的溶液。
采用上述方案的有益效果是：混合酶的使用可以在保证挥发油得率的条件下同时影响挥发油的品质，因为单一酶地使用仅会对油樟叶片下表皮形态和结构造成一定程度地损伤，但是混合酶的处理可以彻底地破坏细胞壁，有利于提高油樟挥发油得率。
进一步地，蒸馏提取得到挥发油的过程为：将预处理后的原料加热至沸腾，保持100-140min；离心的转速为3500r/min，离心的时间为10-20min。
进一步地，冷凝回流的过程为将黄连和/或连翘以浓度为80％的乙醇作为提取溶剂，料液比为1:10-12g/mL的比例，提取100min，提取次数为1-3次。
进一步地，水溶性基质为卡波姆，pH调节剂为三乙醇胺，保湿剂为甘油，防腐剂为尼泊金，增凝剂为吐温80。
采用上述方案的有益效果是：水性凝胶剂具有易涂展和洗除，无油腻感，能吸收组织渗出液而不妨碍皮肤正常功能，载药量量大，黏度较小而有利于药物的释放，滞留时间长，使用方便等优点，使用卡波姆则同时具有无油腻感，涂用润滑舒适，释药快，特别适用于治疗脂溢性皮肤病等优点。
进一步地，具体包括先将卡波姆使用蒸馏水溶胀后，加入吐温80以及蒸馏水混合，再加入甘油后搅拌，并将三乙醇胺溶于蒸馏水后加入搅拌，最后将溶于浓度为95％的乙醇后的尼泊金加入搅拌，并加入药物提取液搅拌均匀，制得樟油痤疮凝胶剂。
进一步地，卡波姆、甘油以及三乙醇胺的质量比为1:5:0.5。
采用上述方案的有益效果是：在最佳基质配比条件下制得的凝胶剂透明、细腻、色泽一致，无团块，几乎没有气泡，易于涂布，且久置而不变色。凝胶剂无油腻感、能吸收组织渗透液、易途展和洗除、载药量大，在生活中运用比较广泛。
同时，根据樟油痤疮凝胶剂的制备方法制备得到的樟油痤疮凝胶剂。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、油樟中深度加工提炼的樟油主要含1,8-桉叶油素，被称为“中国桉叶油”，具有抗菌、杀虫、抗氧化、祛湿解毒、趋避蚊虫等作用，同时对多种药物具有良好的透皮渗透作用；
2、黄连清热燥湿、泻火解毒，其主要成分小檗碱，具有及其广泛的抗菌谱，对金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌均有较强的的抗菌作用；黄连素对总型流感病毒、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性细菌、真菌等均有抑制作用，可达到低浓度抑菌而高浓度杀菌的效果；黄连作为传统的抗菌消炎中药，小檗碱对急、慢性炎症有抑制作用，小檗碱可通过对蛋白酶的影响，从而起到抗菌作用；连翘清热解毒、消肿散结，其主要成分有连翘酯苷A、挥发油等，而连翘酯苷和β-蒎烯有显著的具有抗菌、抗氧化、抗炎作用，与小檗碱配合使用，相辅相成；
3、通过酶辅助-水蒸气蒸馏法并结合特定的工艺参数，使得油樟中的主要品质成分浸出量大，浸出品质高；
4、本发明采用的凝胶基质为卡波姆，具有无油腻感，涂用润滑舒适，释药快，特别适用于治疗脂溢性皮肤病等优点，与本发明采用的添加剂配合使用，可以促进凝胶剂的形成，利于药物的释放，增加凝胶的粘度，使给药系统更加稳定。
附图说明
图1为未经酶处理组提取挥发油的总离子流图；
图2为半纤维素酶预处理组提取挥发油的总离子流图；
图3为纤维素外切酶预处理组提取挥发油的总离子流图；
图4为纤维素内切酶预处理组提取挥发油的总离子流图；
图5为混合酶(纤维素外切酶:半纤维素酶＝1:1)预处理组提取挥发油的总离子流图；
图6为不同pH值条件下油樟挥发油的得率；
图7为樟油痤疮凝胶剂对痤疮丙酸杆菌的抑制作用，从左至右依次为添加了樟油痤疮凝胶剂和未添加樟油痤疮凝胶剂的痤疮丙酸杆菌；
图8为樟油痤疮凝胶剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用，从左至右依次为添加了樟油痤疮凝胶剂和未添加樟油痤疮凝胶剂的金黄色葡萄球菌。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
材料与设备
(1)材料
油樟叶片：采集自四川宜宾叙州区，由四川省宜宾县生产力发展中心提供；
纤维素内切酶、纤维素外切酶、半纤维素酶：济宁和信技术有限公司；
黄连/连翘：生产批号为17080101，泸州天植中药饮片有限公司；
(2)主要试剂
无水硫酸钠、氢氧化钠、冰醋酸、无水乙醇、梭甲基纤维素钠、酒石酸钾钠、结晶酚、醋酸钠、3,5-硝基水杨酸、葡萄糖标准品：天津恒兴化学试剂有限公司；
(3)主要仪器与设备-表1
电子控温水浴锅、电子控温加热套
天津泰斯特仪器有限公司
磁力搅拌器
杭州仪表电机有限公司
高速冷冻离心机
北京京君龙实验仪器有限公司
实施例1
本实施例提供了一种樟油痤疮凝胶剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取油樟挥发油
取自然干燥后粉碎的油樟叶片100g置于2000mL的蒸馏烧瓶中，按料液比1:10g/mL加入蒸馏水，于水中加入pH值为5.0混合酶溶液，混合酶溶液的加入量为100U，将蒸馏烧瓶于50℃恒温水浴中搅拌加热60min，再与冷凝装置连接后，加热至沸腾120min，将沸腾后获得的挥发油冷却至室温，经3500r/min离心10min，取上层加入无水硫酸钠脱水得油樟挥发油；
其中，混合酶为半纤维素酶：纤维素外切酶以1:1混合后的混合物；
(2)提取黄连和连翘的提取液
称取黄连1.0g以及连翘6.0g，置于500mL的圆底烧瓶中，以浓度为80％的乙醇为提取液，料液比为1：10g/mL的条件下，提取2次，每次各100min，即得黄连和连翘的提取液；
(3)凝胶剂的制备
按照质量比为1:5:0.5的比例称取卡波姆、甘油和三乙醇胺，将卡波姆用蒸馏水充分溶胀后加入增溶剂吐温-80，并用适量蒸馏水混合，加入甘油，再将经蒸馏水溶解后的三乙醇胺加入混合搅拌，然后将95％乙醇溶解后的防腐剂尼泊金加入搅拌，最后加入步骤(1)和步骤(2)提取得到的油樟挥发油、黄连和连翘的提取液，搅拌均匀，即可制得樟油痤疮凝胶剂。
实施例2
本实施例提供了一种樟油痤疮凝胶剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取油樟挥发油
取自然干燥后粉碎的油樟叶片100g置于2000mL的蒸馏烧瓶中，按料液比1:11g/mL加入蒸馏水，于水中加入100U的混合酶溶液(pH值为5.0)，将蒸馏烧瓶于60℃恒温水浴中搅拌加热50min，再与冷凝装置连接后，加热至沸腾120min，将沸腾后获得的挥发油冷却至室温，经3500r/min离心10min，取上层加入无水硫酸钠脱水得油樟挥发油；
其中，混合酶为半纤维素酶：纤维素外切酶以1:1混合后的混合物；
(2)提取黄连和连翘的提取液
称取黄连1.0g以及连翘6.0g，置于500mL的圆底烧瓶中，以浓度为80％的乙醇为提取液，料液比为1：10g/mL的条件下，提取3次，每次各100min，即得黄连和连翘的提取液；
(3)凝胶剂的制备
按照质量比为1:5:0.5的比例称取卡波姆、甘油和三乙醇胺，将卡波姆用蒸馏水充分溶胀后加入增溶剂吐温-80，并用适量蒸馏水混合，加入甘油，再将经蒸馏水溶解后的三乙醇胺加入混合搅拌，然后将95％乙醇溶解后的防腐剂尼泊金加入搅拌，最后加入步骤(1)和步骤(2)提取得到的油樟挥发油、黄连和连翘的提取液，搅拌均匀，即可制得樟油痤疮凝胶剂。
实施例3
本实施例提供了一种樟油痤疮凝胶剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取油樟挥发油
取自然干燥后粉碎的油樟叶片100g置于2000mL的蒸馏烧瓶中，按料液比1:10g/mL加入蒸馏水，于水中加入100U的混合酶溶液(pH值为5.0)，将蒸馏烧瓶于55℃恒温水浴中搅拌加热40min，再与冷凝装置连接后，加热至沸腾120min，将沸腾后获得的挥发油冷却至室温，经3500r/min离心10min，取上层加入无水硫酸钠脱水得油樟挥发油；
其中，混合酶为半纤维素酶：纤维素外切酶以1:1混合后的混合物；
(2)提取黄连和连翘的提取液
称取黄连1.0g以及连翘6.0g，置于500mL的圆底烧瓶中，以浓度为80％的乙醇为提取液，料液比为1：10g/mL的条件下，提取1次，提取时间为100min，即得黄连和连翘的提取液；
(3)凝胶剂的制备
按照质量比为1:5:0.5的比例称取卡波姆、甘油和三乙醇胺，将卡波姆用蒸馏水充分溶胀后加入增溶剂吐温-80，并用适量蒸馏水混合，加入甘油，再将经蒸馏水溶解后的三乙醇胺加入混合搅拌，然后将95％乙醇溶解后的防腐剂尼泊金加入搅拌，最后加入步骤(1)和步骤(2)提取得到的油樟挥发油、黄连和连翘的提取液，搅拌均匀，即可制得樟油痤疮凝胶剂。
对比例1
以实施例1为参照，设置对照组1-3，在其他工艺条件不变的情况下，将步骤(1)提取油樟挥发油的混合酶分别设置为未经酶处理、半纤维素酶处理、纤维素外切酶处理以及纤维素内切酶处理，提取到的油樟挥发油含量如表2所示。将提取出的挥发油进行GC-MS分析检测，并与常规水蒸气蒸馏提取的油樟挥发油进行比较，分析其差异。其中，安捷伦7000A三重四极杆串联气质联用仪气相条件：色谱柱为石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。程序升温条件：进样口温度280℃，柱温50℃保持2min，以3℃/min至180℃，保持2min，再以8℃/min升至240℃保持5min，共运行60min。载气为He，流速1.0mL/min，进样量1μL，分流比20:1。质谱条件：EI-MS，El离子源温度180℃，接口温度：260℃，扫描范围(m/z)50～620。
表2不同酶预处理组提取油樟挥发油量
由表2可知，酶辅助方法提取挥发油质量明显增加，并且通过混合酶处理后的挥发油的效果最好。成分分析结果如图1-5所示，每个色谱峰相对应的质谱图经Nist标准质谱库检索和人工解析，并通过查阅文献确定了31种挥发油的化学成分。在31种主要成分中，未经酶预处理组被鉴定出28种成分；经半纤维素酶预处理组被鉴定出23种成分；经纤维素外切酶预处理组被鉴定出24种成分；经纤维素内切酶预处理组被鉴定出24种成分；经混合酶预处理后组被鉴定出25种成分。五组挥发油成分中含量大于1％的主要成分分有:12种、10种、11种、10种、11种。采用峰面积归一法计算所含各成分的相对含量百分比，挥发油中大于1％的主要成分占其总含量的92.94％，95.48％，94.92％，95.22％和95.99％。五组挥发油成分中大于10％的主要成分，半纤维素预处理组为：β-桉叶油醇和a-松油醇，两种成分占挥发油总含量的62.91，其余四组为：β-桉叶油醇和乙酸松油酯，分别占各自总含量的57.36％，63.77％，64.45％，64.49％。酶预处理组比未经酶预处理组重要成分溶出量提高，其中混合酶预处理组效果最为显著，重要成分含量高于未经酶处理组7.13％，说明酶预处理对油樟挥发油的提取起到了重要作用。
对比例2
以实施例1为参照，设置对照组4-6，在其他工艺条件不变的情况下，将步骤(1)提取油樟挥发油的溶液pH值分别设置为3.0、4.0和6.0，检测挥发油得率，结果如图6所示。其中，挥发油得率的计算公式为：
油樟挥发油得率(％)＝油樟挥发油的质量/提取油樟挥发油所用油樟的质量×100％
由图6可知，当pH值为5时油樟挥发油得率最高；pH值小于5时，挥发油得率随之降低；pH值大于5时随pH值的增加油樟挥发油得率降低。这是由于混合酶的活性受到pH值的影响，pH＝5时混合酶可以最大限度的破环β-1,4糖苷键消溶细胞壁。由于细胞壁的损伤程度逐步提高，有效物质溶出阻力降低，故此时油樟挥发油得率最高。随着pH值的增加，化学环境不利于酶解作用，酶活性降低，从而使挥发油得率降低。因此，本发明选择的最佳pH值为5。
试验例1
樟油痤疮凝胶剂体外抗菌活性研究
将实施例1制备的得到的樟油痤疮凝胶剂对痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌进行灭菌实验，以比较菌圈直径大小测试樟油痤疮凝胶剂的抑制敏感程度。
实验过程包括以下内容：
1、实验材料
1.1实验试剂
柠檬酸钠、蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、氯化钠、琼脂、氢氧化钠、无水乙醇：天津市致远化学试剂有限公司。
1.2实验仪器
超净工作台：上海净化仪器有限公司；立式自动电热压力蒸气灭菌器：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；超声波清洗器：雷士超声波设备公司；恒温恒湿培养箱上海跃进医疗器械有限公司；打孔器：扬州市广宁器化玻有限公司；电热烘箱：北京雅士林试验设备有限公司；恒温震荡摇床：科路森科技有限公司。
1.3细菌
痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌：中国微生物菌种保藏中心。
2、实验方法
2.1细菌培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨l0g，氯化钠5g，琼脂粉20g，加入1L蒸馏水，加热煮沸，直到完全溶解，用1％氢氧化钠和50％柠檬酸钠调节其pH至7.4-7.6，121℃高压灭菌15min后备用。
2.2菌种活化
菌种保藏中心提供的菌种为冻干粉，复苏前应准备各适于该菌种生长的培养基和培养设备，所用的操作均应在无菌条件下进行。启用菌种前用75％的酒精棉消毒菌种管外壁，在酒精灯外焰上旋转灼烧，烧极热后，点凉的无菌蒸馏水，安瓶瓶裂开。用移液枪注入500μL的该菌种液体培养基并反复吹打，使安瓶瓶中冻干粉溶解，将菌液全部吸出，接种到固体培养基中，细菌放置在37℃的培养箱中，培养18-24小时。复苏后菌种传1-2代后使用。
2.3菌悬液的选择
操作皆在超净工作台中进行，从已活化的菌种培养基中用无菌接种环挑取少量菌接入相应菌种的无菌液体培养基中，使用恒温摇床培养细菌37℃下培养18-24h制成一定浓度的菌悬液。菌悬液稀释方法参照微生物学实验，试验菌液浓度选择为104cfu/mL。
2.4抑菌圈的测定
本实验选用滤纸片法测量对供试菌种抑菌圈直径的大小，并用其来判断抑菌活性强弱。操作方法为：用打孔器在定性滤纸上打出圆形滤纸片(直径＝6mm)，装入干燥洁净的培养皿中于121℃高压灭菌20min，备用。按照无菌操作方法，制备好对应菌种的相应平板待用。用无菌涂布棒将无菌移液枪吸取的200μL菌悬液在培养局涂布均匀微干后，夹取滴加5μL的樟油痤疮凝胶剂滤纸片贴于平板，每个平板贴三片呈正三角形放置，不加挥发油的无菌滤纸片作空白对照。每组三个平行对照，并放置于恒温恒湿培养箱中细菌在37℃下培养18-24h，取三个平行对照测量抑菌圈直径大小并计算其平均值。
3、实验结果分析
3.1对实验菌种的抑菌效果分析
樟油痤疮凝胶剂对痤疮丙酸杆菌抑菌圈直径在10-15mm之间，具有中度敏感抑菌作用。樟油痤疮凝胶剂对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径大小大于15mm，具有高度敏感抑菌作用。图7-8为油樟挥发油对15种菌的抑制圈形态及其对照。抑菌圈直径见表3。
表3樟油痤疮凝胶剂的抑菌圈直径
菌种
抑菌圈直径(mm)
痤疮丙酸杆菌
12.96±0.97
金黄色葡萄球菌
16.13±1.09
由表3和图7-8可知，对痤疮丙酸杆菌抑菌圈直径在10-15mm之间，具有中度敏感抑菌作用。樟油痤疮凝胶剂对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径大小大于15mm，具有高度敏感抑菌作用。
虽然对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
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