一种激活毛囊再生的干细胞制剂
阅读说明：本技术 一种激活毛囊再生的干细胞制剂 (Stem cell preparation for activating hair follicle regeneration ) 是由 张正亮 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种激活毛囊再生的干细胞制剂,涉及生物制剂技术领域,其原料包括：间充质干细胞外泌体、黄连提取物、洋甘菊提取物、丹参提取物、生理盐水。相较于单一的间充质干细胞外泌体的生物制剂,本发明的生物制剂能够有效促进毛囊发育再生,促进细胞增殖,再生出更多的毛发,且制剂中采用的间充质干细胞外泌体,性能稳定,降低免疫排斥。(The invention discloses a stem cell preparation for activating hair follicle regeneration, which relates to the technical field of biological preparations and comprises the following raw materials: mesenchymal stem cell exosome, coptis extract, chamomile extract, salvia miltiorrhiza extract and normal saline. Compared with a single biological preparation of the mesenchymal stem cell exosome, the biological preparation can effectively promote development and regeneration of hair follicles, promote cell proliferation and regenerate more hairs, and the mesenchymal stem cell exosome adopted in the preparation has stable performance and reduces immunological rejection.)
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，尤其涉及一种激活毛囊再生的干细胞制剂。
背景技术
随着社会压力不断增大和生活节奏的加快，环境的不断恶化，以及不良饮食的饮食习惯，伴随我们的非健康、亚健康也与日俱增，人们普遍表示自己的头发存在健康问题，脱发患者越来越多，且更加年轻化。脱发不仅影响生活质量，而且给患者心理带来较大的负面影响。
现有技术中针对脱发的治疗主要有药物疗法和毛囊移植，其中，药物疗法是采用米诺地尔、非那雄胺、度他雄胺等药物进行治疗，其效果有效，但只能防止头发脱落，且有一定的副作用；毛囊移植是通过手术的从患者毛囊富集的头发区域采集毛囊再移植到指定头皮部位，然而该方法采集的供体毛囊有限，无法大面积移植，且移植后的毛发一般很难长时间生长，一段时间后需要再次手术。
近年来，干细胞技术用于毛发毛囊再生中的应用得到广泛应用。然而，单一应用干细胞生物制剂的毛囊再生能力有限，还需进一步提高毛囊中细胞抵抗脱发的能力。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种激活毛囊再生的干细胞制剂，该制剂性能稳定，能够有效促进毛囊发育再生，促进细胞增殖，再生出更多的毛发。
本发明提出的一种激活毛囊再生的干细胞制剂，其原料包括：间充质干细胞外泌体、黄连提取物、洋甘菊提取物、丹参提取物、生理盐水。
优选地，干细胞制剂中，间充质干细胞外泌体为30-40μg/mL，黄连提取物为5-10μg/mL，洋甘菊提取物为3-6μg/mL，丹参提取物为2-4μg/mL。
优选地，所述间充质干细胞外泌体的制备如下：清洗脐带，去除动静脉，剪碎，加入含10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的α-MEM培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔3d更换新鲜培养液，待细胞融合达80-90％时，采用0.25％胰蛋白酶消化，进行传代培养；传代培养至P3或P4代时，培养48h后离心提取外泌体。
优选地，离心提取外泌体的具体操作如下：于4℃，采用500g转速离心5min，取上清液；再采用2000g转速离心10min，取上清液；再采用10000g转速离心20min，取上清液；最后采用100000g转速离心2h，取沉淀，即得。
优选地，黄连提取物是采用醇提法制备得到的，具体操作如下：将黄连粉碎，加入70-75％乙醇溶液，回流提取，即得。
优选地，洋甘菊提取物是采用水蒸气蒸馏法制备得到的，具体操作如下：将洋甘菊粉碎，加入去离子水超声分散，然后加热至沸腾并保持微沸，油水分离，将油层溶解到适量无水乙醇中，再减压浓缩去除乙醇，即得。
优选地，所述丹参提取物是采用醇提法制备得到的，具体操作如下：将丹参粉碎，加入75-80％乙醇溶液，回流提取，即得。
优选地，制备方法如下：将间充质干细胞外泌体重悬于生理盐水中，然后加入黄连提取物、洋甘菊提取物、丹参提取物，混合分散，即得。
有益效果：本发明提出了一种激活毛囊再生的干细胞制剂，是将间充质干细胞外泌体、黄连提取物、洋甘菊提取物、丹参提取物进行复配得到的。其中，黄连提取物与间充质干细胞外泌体相配合，能够提高BMP信号，提高毛囊的诱导能力，激活Wnt/β-catenin/通路，促进毛囊发育所需要的基板的形成和毛囊基部细胞分裂，再生出更多的毛发；并添加丹参提取物，其在细胞增殖阶段，促进TGF-β信号的表达，有效促进细胞增殖，诱发毛囊干细胞的激活和维持，诱导和调节毛发生长，几者相互配合，当毛囊进入生长周期时，促进毛囊中的表皮细胞增殖，促进毛囊结构的发育完善，并且能够抑制毛囊休止期时间，促进其进入下一个生长周期；此外，丹参活血，能够刺激头皮局部血液循环，改善头皮新陈代谢能力，使得营养物质能够很好的输送至头皮，促进细胞再生，激活毛囊，保证毛发正常生长；添加的洋甘菊提取物中含有的双环倍半萜类的物质，其与黄连配伍后，能够显著提高黄连中功效成分的生物利用度。相较于单一的间充质干细胞外泌体的生物制剂，本发明的生物制剂能够有效促进毛囊发育再生，再生出更多的毛发，且制剂中采用的间充质干细胞外泌体，性能稳定，降低免疫排斥。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种激活毛囊再生的干细胞制剂，其原料包括：间充质干细胞外泌体为35μg/mL，黄连提取物为7μg/mL，洋甘菊提取物为4.5μg/mL，丹参提取物为3μg/mL和生理盐水；
其中，黄连提取物是采用醇提法制备得到的，具体操作如下：将黄连粉碎，按照1：10的固液比加入75％乙醇溶液，回流提取两次，每次提取1.5h，合并两次提取得到的滤液，减压浓缩，干燥，即得；
洋甘菊提取物是采用水蒸气蒸馏法制备得到的，具体操作如下：将洋甘菊粉碎，加入适量的去离子水超声分散30min，继续加入去离子水调节固液比为1：15，加热至沸腾并保持微沸3h，停止加热，油水分离，将油层溶解到适量无水乙醇中，再减压浓缩去除乙醇，即得；
丹参提取物是采用醇提法制备得到的，具体操作如下：将丹参粉碎，按照1：10的固液比加入80％乙醇乳液，回流提取两次，每次提取1.5h，合并两次提取得到的滤液，减压浓缩，干燥，即得；
间充质干细胞外泌体的制备如下：清洗脐带，去除动静脉，剪碎，加入含10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的α-MEM培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔3d更换新鲜培养液，待细胞融合达90％时，采用0.25％胰蛋白酶消化，进行传代培养；传代培养至P3代时，培养48h后离心提取外泌体，具体操作如下：于4℃，采用500g转速离心5min，取上清液；再采用2000g转速离心10min，取上清液；再采用10000g转速离心20min，取上清液；最后采用100000g转速离心2h，取沉淀，即得。
上述激活毛囊再生的干细胞制剂的制备是先将间充质干细胞外泌体重悬于生理盐水中，然后加入黄连提取物、洋甘菊提取物、丹参提取物，混合分散，即得。
实施例2
与实施例1相比，区别仅在于：原料包括：间充质干细胞外泌体为30μg/mL，黄连提取物为10μg/mL，洋甘菊提取物为3μg/mL，丹参提取物为4μg/mL和生理盐水；其余原料制备及制备方法均相同。
实施例3
与实施例1相比，区别仅在于：原料包括：间充质干细胞外泌体为40μg/mL，黄连提取物为5μg/mL，洋甘菊提取物为6μg/mL，丹参提取物为2μg/mL和生理盐水；其余原料制备及制备方法均相同。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于：原料中不含有黄连提取物；其余原料组成、用量和制备方法均相同。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于：原料中不含有洋甘菊提取物；其余原料组成、用量和制备方法均相同。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于：原料中不含有丹参提取物；其余原料组成、用量和制备方法均相同。
对比例4
与实施例1相比，区别仅在于：原料仅包括：间充质干细胞外泌体和生理盐水；其余原料组成、用量和制备方法均相同。
小鼠毛发毛囊再生试验
1、斑秃模型建立：将咪喹莫特乳膏体0.05g均匀涂抹于C3H/HEJ小鼠的背部皮肤，面积约1.5×1.5cm，隔天一次，最长连续用药不超过10周，每次给药前均用生理盐水清洁局部，以去除前次残留药物；5周左右可在，给药部位可形成大于1×1cm大小斑秃面积，提示造模成功。
2、制剂注射：将斑秃造模成功的小鼠随机分为8组，其中7组分别注射实施例1-3和对比例1-4中制备的干细胞制剂，记作处理组1-7，还有1组注射生理盐水，记作空白组，每组4只，具体注射操作如下：注射前小鼠用戊巴比妥钠麻醉，然后用微量进样器在斑秃出注射干细胞制剂，注射量为每平方厘米斑秃皮肤注射1mL，注射刺入深度为2mm。
3、结果观察：注射后每日观察，并于3周后处死小鼠，在解剖显微镜下观察毛囊形成情况并统计平均毛发数目和长度。
4、试验结果：见表1。
经观察，相较于空白组，处理组1-7中毛囊数目增多。相较于处理组4-6，处理组1的毛发数目和毛发长度均得到提高，且处理组5-6也较处理组4要好，这可能是因为洋甘菊提取物、丹参提取物和黄连提取物配合，能够提高生物利用度，进一步提高功效。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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