基于hbt的甲基衍生物荧光探针及制备与应用
阅读说明：本技术 基于hbt的甲基衍生物荧光探针及制备与应用 (HBT-based methyl derivative fluorescent probe and preparation and application thereof ) 是由 王素华 余龙 李鑫 袁亚茹 孙明泰 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明通过对HBT分子苯环上的不同位置上引入甲基的研究提供一种荧光探针5-HBT及制备与其荧光检测的应用,从而实现了现场快速可视化检测水体中残留次氯酸钠。通过本发明研究证明了苯环上的一个甲基基团的位置,对某些荧光分子能产生巨大的影响,主要包括荧光的强度和荧光的稳定性,其中最明显的是5-HBT荧光大大减弱,所得到的5-HBT探针在固体状态下可以发射荧光,在制作纸质荧光传感器时有很大的优势,荧光效果明显,可以实现现场快速可视化检测次氯酸钠溶液。(The invention provides a fluorescent probe 5-HBT, preparation and application of fluorescence detection thereof through research of introducing methyl groups to different positions on a benzene ring of HBT molecules, thereby realizing rapid visual detection of residual sodium hypochlorite in a water body on site. The research of the invention proves that the position of a methyl group on a benzene ring can have great influence on some fluorescent molecules, mainly comprises the intensity of fluorescence and the stability of fluorescence, wherein the most obvious is that the fluorescence of the 5-HBT is greatly weakened, the obtained 5-HBT probe can emit fluorescence in a solid state, and the invention has great advantages in manufacturing a paper fluorescent sensor, has obvious fluorescence effect and can realize the rapid visual detection of sodium hypochlorite solution on site.)
技术领域
本发明属于有机化合物的制备及荧光分析技术领域，主要涉及基于2-(2-羟基苯)苯并噻唑(HBT)的甲基衍生物的荧光差异分析及对次氯酸钠的检测。
背景技术
次氯酸钠溶液氧化能力强，杀菌消毒作用优异，然而，过量的次氯酸钠对人类和动物的健康构成潜在威胁，会导致肾脏、肺损伤和癌症等疾病。因此对次氯酸钠的检测有着重要的意义。
苯环上的一个甲基的增加或缺失对分子的荧光性质通常没有显著影响。2-(2-羟基苯)苯并噻唑(HBT)因优异的荧光性能和激发态分子内质子转移机制，被广泛的应用于荧光分析检测中。
中国专利公开号CN107602504A公开了一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法与使用方法。本发明利用2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑构筑经典的ESIPT体系，并在5’-位直接引入叠氮部分，使其更具生物和光学稳定性。探针本身的ESIPT效应被叠氮基团抑制而无荧光发射，但当存在次氯酸的条件下，叠氮基团被次氯酸氧化，进而使其抑制作用消失，探针分子发射出强荧光。本发明提供的2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑-叠氮染料的“开-关”型次氯酸探针对次氯酸溶液具有良好的响应，能够实现对样品内微量次氯酸的灵敏定量检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
中国专利公开号CN105441065A公开了一种用于检测次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法与使用方法。本发明利用2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑构筑经典的ESIPT体系，并在5’-位直接引入偶氮苯基部分，使其更具生物和光学稳定性。当存在次氯酸根的条件下，偶氮苯基被氧化，进而使探针分子发出强荧光，本发明提供的2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑类染料的“开-关”型次氯酸根探针及其专用检测试剂盒对次氯酸根溶液具有良好的响应，并能够实现对细胞内次氯酸根的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
中国专利公开号CN110372632A公开了一种快速识别次氯酸根离子的荧光探针分子及其制备方法和应用。该荧光探针分子BS的结构式，其由2-苯并噻唑基-4-甲基苯酚与N,N-二甲基氨基硫代甲酰氯反应获得。本发明的荧光探针分子BS在加入含次氯酸根离子的测试样品中时，测试样品的荧光发生明显变化，且其在482nm的荧光光强与次氯酸根离子的浓度具有线性正相关；同时，探针分子BS对次氯酸根离子具有良好的选择性，测试过程操作简单，具有快速高效、灵敏度高的优势。
可见，在已发表的相关研究成果中，所研究的内容均是在HBT分子上引入新的识别基团，以此实现对环境中的次氯酸/次氯酸盐的检测，几无研究关于在HBT上增加一个甲基以及甲基的取代位置变换对次氯酸/次氯酸盐荧光检测所带来的影响。
发明内容
本发明发现在HBT及其衍生物分子苯环上的不同位置上引入甲基对分子荧光强度和荧光稳定性有很大的影响，并且发现分子在不同溶剂中也有很大的区别，实现了在特定溶剂中对次氯酸钠的荧光检测。这为有机分子荧光分析提供了新的思路。
本发明的目的在于通过对HBT分子苯环上的不同位置上引入甲基的研究提供一种荧光探针5-HBT及制备与其荧光检测的应用，从而实现了现场快速可视化检测水体中残留次氯酸钠。
本发明的基于HBT的甲基衍生物荧光探针，命名5-HBT，结构式如下：
本发明的基于HBT的甲基衍生物荧光探针的制备方法，其是将5-甲基水杨醛与2-氨基苯硫酚溶于乙醇，然后抽真空，通氮气，在氮气氛围下常温反应20-40分钟后，再加入盐酸和过氧化氢溶液，在氮气氛围下继续反应10-12小时后，在冰水浴下加入盐酸，除去未反应完全的2-氨基苯硫酚，再经后处理纯化即得。
上述制备方法中，所述后处理纯化是指加入饱和食盐水，乙酸乙酯萃取，旋蒸得到初步纯化的产品，再通过柱层析纯化进一步分离得到纯的样品。具体的，所述后处理可采用将反应溶液转移至大小合适的烧杯中，反应瓶中附着在瓶壁的样品可通过加入少许乙酸乙酯溶解然后转移至烧杯中，通过向烧杯中加入适量的饱和食盐水，然后用乙酸乙酯萃取三遍，再将萃取后的乙酸乙酯通过旋转蒸发仪蒸干，即可得到粗产品；为进一步纯化粗产品，可采用柱层析方法将初步纯化的产品进一步分离纯化，可采用一定比例的石油醚和乙酸乙酯做洗脱液，最终得到纯的产品，然后将样品通过旋转蒸发仪蒸干放入冰箱，取少量样品做高分辨质谱分析。
本发明的基于HBT的甲基衍生物荧光探针可在次氯酸盐检测中应用，该应用可采用下述方法步骤：将荧光探针溶于甲醇中，得到探针储备液，然后进行次氯酸盐检测。
上述应用中，优选的，将探针储备液溶于乙腈中，并加入氢氧化钠溶液，再进行次氯酸盐检测。由于探针在碱性条件下荧光强度增加，因此测试了NaOH加入量，而当加入20μL浓度为0.04M的NaOH溶液可使探针起始荧光强度达到最大。
作为一种优选的应用方案，可采用下述方法步骤：取0.01mmol的5-HBT溶于10mL的甲醇溶液中，得到样品浓度为1mM的储备液；再取20μL的5-HBT的储备液，溶于1.5mL乙腈，然后加入20μL浓度为0.04M的氢氧化钠溶液；随后加入次氯酸钠溶液，随后在紫外灯下，进行荧光图片拍摄。
本发明探究了不同甲基位置取代的HBT在不同有机溶剂的荧光性质，充分比较了不同甲基衍生物在不同溶剂中的区别，也即结构高度相似的甲基衍生物，在不同的溶剂中，表现出不同的结果。测试的溶剂包括水、甲醇、乙醇、异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜和丙酮。从荧光照片可以看出，3-HBT在甲醇溶剂中容易被次氯酸钠淬灭荧光，5-HBT在乙腈溶剂中容易被次氯酸钠淬灭荧光。而HBT和4-HBT在各类有机溶剂中荧光均不易被淬灭，6-HBT自身荧光比较微弱，因此不进一步研究。然后分别测试了3-HBT和5-HBT分别在甲醇和乙腈溶剂中对次氯酸钠的荧光响应效果，实验结果表明，3-HBT的甲醇溶液在加入次氯酸钠之后，需要孵化15分钟荧光才能被完全淬灭。但是在5-HBT的乙腈溶液中，只需1分钟，就能完全淬灭荧光，大大提升了检测效率。因此可使用5-HBT制作次氯酸钠试纸传感器并用于现场快速可视化检测水体中次氯酸钠。
本发明通过紫外吸收光谱可以看出，在加入次氯酸钠溶液之后，350-450nm附近的紫外吸收峰消失，材料无法被365nm光源激发，因此荧光被淬灭。
通过本发明研究证明了苯环上的一个甲基基团的位置，对某些荧光分子能产生巨大的影响，主要包括荧光的强度和荧光的稳定性，其中最明显的是5-HBT荧光大大减弱，所得到的5-HBT探针在固体状态下可以发射荧光，在制作纸质荧光传感器时有很大的优势，荧光效果明显，可以实现现场快速可视化半定量检测次氯酸钠溶液。
附图说明
图1是2-(2-羟基苯)苯并噻唑(HBT)高分辨质谱图。
图2是3-HBT的高分辨质谱图。
图3是4-HBT的高分辨质谱图。
图4是5-HBT的高分辨质谱图。
图5是6-HBT的高分辨质谱图。
图6是HBT在1.水、2.甲醇、3.乙醇、4.异丙醇、5.N,N-二甲基甲酰胺、6.乙腈、7.二甲基亚砜和8.丙酮中的图片。(a)在自然光下拍摄；(b)在365nm紫外灯下拍摄；(c)加入过量的次氯酸钠后在365nm紫外灯下拍摄。
图7是3-HBT在1.水、2.甲醇、3.乙醇、4.异丙醇、5.N,N-二甲基甲酰胺、6.乙腈、7.二甲基亚砜和8.丙酮中的图片。(a)在自然光下拍摄；(b)在365nm紫外灯下拍摄；(c)加入过量的次氯酸钠后在365nm紫外灯下拍摄。
图8是4-HBT在1.水、2.甲醇、3.乙醇、4.异丙醇、5.N,N-二甲基甲酰胺、6.乙腈、7.二甲基亚砜和8.丙酮中的图片。(a)在自然光下拍摄；(b)在365nm紫外灯下拍摄；(c)加入过量的次氯酸钠后在365nm紫外灯下拍摄。
图9是5-HBT在1.水、2.甲醇、3.乙醇、4.异丙醇、5.N,N-二甲基甲酰胺、6.乙腈、7.二甲基亚砜和8.丙酮中的图片。(a)在自然光下拍摄；(b)在365nm紫外灯下拍摄；(c)加入过量的次氯酸钠后在365nm紫外灯下拍摄。
图10是5-HBT在加入次氯酸钠前后的紫外吸收光谱图。
图11是半定量检测次氯酸钠的荧光检测图。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实施例1
将3mmol的水杨醛、3-甲基水杨醛、2-羟基-4-甲基苯甲醛、5-甲基水杨醛和2-羟基-6-甲基苯甲醛分别与3.2mmol的2-氨基苯硫酚加入到装有6mL乙醇溶剂的圆底烧瓶中。通过带有气球的玻璃三通阀门将烧瓶抽真空和通氮气，在常温下磁力搅拌30min。待反应30min后，迅速加入0.34mL的H2O2(30％，质量)和0.17mL的HCl(37％，质量)。继续在氮气氛围下反应12h。反应结束后，在冰水条件下继续加0.05mL的HCl(37％)，然后将溶液转移到100mL的烧杯中，加入30mL的饱和食盐水。用50mL的乙酸乙酯萃取3次，将样品通过旋转蒸发仪蒸干得到初步纯化的样品。然后通过柱层析方式分析纯化，所选用的洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝5:1，v/v。制备方程如下(参考Long Yu.A fluorescence probe for highlyselective and sensitive detection ofgaseous ozone based on excited-stateintramolecular proton transfermechanism.Sensors and Actuators B 266(2018)717–723中关于HBT的制备过程)：
将分析纯化后的样品，分别取少量固体溶解于甲醇溶剂中做高分辨质谱测试，确定产品的分子量。分别如图1-5所示。ESI–MS m/z,HBT,[M+H]+:228.04738；3-HBT,[M-H]-:240.04826；4-HBT,[M+H]+:242.06303；5-HBT,[M-H]-:240.04852；6-HBT,[M-H]-:240.04834。
实施例2
分别取0.01mmol的实施例1得到的HBT、3-HBT、4-HBT和5-HBT溶于10mL的甲醇溶液中，得到样品浓度为1mM的储备液。
取20μL的HBT、3-HBT、4-HBT和5-HBT的储备液，分别溶于装有1.5mL的水、甲醇、乙醇、异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜和丙酮溶剂的2mL离心管中，然后均加入20μL浓度为0.04M的氢氧化钠溶液。此时荧光强度达到最大，分别在自然光和365nm紫外灯下拍摄照片。随后加入过量的次氯酸钠溶液，再次在365nm紫外灯下拍摄照片。由图6-9发现，HBT、3-HBT、4-HBT和5-HBT的储备液在自然光下均为无色，紫外灯下均为明显的绿色或蓝绿色荧光，加入过量的次氯酸钠溶液后，紫外灯下检测发现，3-HBT在甲醇中荧光被次氯酸钠淬灭明显，HBT和4-HBT在各类有机溶剂中荧光均不易被淬灭，5-HBT在乙腈中荧光被次氯酸钠淬灭最显著。实验还发现，3-HBT的甲醇溶液在加入次氯酸钠之后，需要孵化15分钟荧光才能被完全淬灭。但是在5-HBT的乙腈溶液中，只需1分钟，就能完全淬灭荧光，5-HBT的乙腈溶液与次氯酸钠反应时间最短，淬灭效果最好。由此选定5-HBT为次氯酸钠荧光探针，并且测得5-HBT与次氯酸钠反应前后的紫外吸收图谱，如图10，在加入次氯酸钠溶液之后，350-450nm附近的紫外吸收峰消失，荧光被淬灭。由于5-HBT在固体状态即可以发射荧光，这也有利于试纸传感器的设计，更可便捷的用于现场快速可视化检测自来水和湖泊中残留次氯酸钠。
实施例3
取0.01mmol的5-HBT探针溶于10mL的甲醇溶液中，得到1mM的探针储备液。取20μL的探针储备液，加入到装有1.5mL乙腈的2mL离心管中，然后逐渐加入5,10,15,20和25μL浓度为0.04M的氢氧化钠溶液。当加入到20μL时，荧光强度就基本不再增加。因此溶剂环境以在相同条件下加入20μL的浓度为0.04M的NaOH溶液为佳。
实施例4
制作试纸：将聚四氟乙烯材料的纸片通过打孔器制成一张纸的圆纸片，然后浸入在浓度为1mM的5-HBT中，然后干燥得到检测次氯酸钠的荧光试纸。次氯酸钠母液浓度大约为1M，取1mL的次氯酸钠，稀释至10mL，此时浓度为0.1M。然后分别取5，25，50，75，100和200μL的次氯酸钠溶液定容至10mL。此时次氯酸钠的的浓度依次为3.7、18.5、37、55.5、74和148ppm。然后取10μL不同ppm的次氯酸钠溶液，滴加在试纸上面，在365nm的紫外灯下面拍照，获得半定量检测次氯酸钠的荧光检测图。如图11。图中，A组为对照组，各圆形试纸均显示绿色荧光；B组为测试组，滴加次氯酸钠溶液后，绿色荧光猝灭，随次氯酸钠溶液浓度升高，荧光猝灭越明显。
应当说明的是，本发明的上述所述之技术内容仅为使本领域技术人员能够获知本发明技术实质而进行的解释与阐明，故所述之技术内容并非用以限制本发明的实质保护范围。本发明的实质保护范围应以权利要求书所述之为准。本领域技术人员应当知晓，凡基于本发明的实质精神所作出的任何修改、等同替换和改进等，均应在本发明的实质保护范围之内。
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