具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下针对本申请实施例的2′，3′-双脱氧核苷-5′-O-(α-硫代)三磷酸的制备方法进行具体说明：

2′，3′-双脱氧核苷-5′-O-(α-硫代)三磷酸：

全称为2′,3′-Dideoxynucleoside-5’-O-(α-thio)Triphosphates，简称为ddNTP-α-S，其结构如下述式1所示。

其中，Base表示碱基，分别可以是A、C、G、T，并且A表示Adenine(腺嘌呤)、T表示Thymine(胸腺嘧啶)、C表示Cytosine(胞嘧啶)、G表示Guanine(鸟嘌呤)。

其他的示例中，上述化合物ddNTP-α-S也可以被制作为盐的形式，例如，锂盐，或者也可以是钾盐、钠盐、钾盐、铵盐等等。其中锂盐的结构式如下：

在本申请中，采用有机合成的方式制备上述目标物质。总体上而言，本申请示例中，以双脱氧核苷为原料，在磷酸三甲酯体系下，用三氯硫磷试剂，通过磷酰化得到以2′，3′-双脱氧核苷二氯(α-硫代)一磷酸为主的产物；再加入过量的焦磷酸三丁胺、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，反应生成含“三个磷酸”的化合物。得到的反应液经水解、层析分离和纯化，可得到纯度大于97％的目标物。

其中，根据ddNTP-α-S中的碱基的不同，双脱氧核苷也可以有不同的选择，因此，双脱氧核苷包括：

2′，3′-双脱氧腺苷，

2′，3′-双脱氧胞苷，

2′，3′-双脱氧鸟苷，

2′，3′-双脱氧胸苷，

其中的2′，3′-双脱氧核苷二氯(α-硫代)一磷酸的结构如下式2所示。

式2，其中Base表示碱基，且所述的碱基选自A、C、T和G。

本申请的合成路径可以简述如下：

本申请示例中，采用“一锅法”进行目标物的合成，即各种原料和中间产物，在整个制备过程中不分离。起始底物与其他原料反应后，形成的中间产物、未反应完全的部分原料等，不经过分离的情况下，继续加入后续步骤的原料、催化剂等继续进行反应，直至获得目标产物(式1化合物)。

由于采用的是一锅法制备目标产物，因此，目标产物存在于混合物体系中。为了将目标产物分离，可以选择对反应结束后的混合物进行纯化处理。本申请示例中，纯化处理主要通过柱层析的方式进行。纯化过程中，结合离子交换树脂，再结合流动相的成分选择也可以获得盐型的目标物。

在上述制备反应过程中，由于三氯硫磷的反应通常比较剧烈，因此，为了降低反应的激烈性，同时减少、甚至抑制副产物的产生，可以选择在相对更低的温度下进行反应，以获得2′，3′-双脱氧核苷二氯(α-硫代)一磷酸。其中的低温条件例如可以通过冰浴提供，且温度可以是0℃至10℃，进一步可以是0℃至5℃。此外，在示例中，反应体系中还可以使用磷酸三甲酯，其可以与三氯硫磷形成活性很好的磷酰化试剂，如式4所示。

当然，其中的磷酸三甲酯也可以选择其他烷基类型的磷酸三酯，例如磷酸三乙酯等。进一步地，为了促进反应的进行，还可以选择吡啶催化剂(缚酸)；示例中选择使用2,4,6-三甲基吡啶，例如还可以使用2-甲基吡啶、2，4-二甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶等。

经过上述反应过程形成式2所示的化合物，然后，其再与焦磷酸三丁胺(或称焦磷酸三丁胺)进行反应。焦磷酸三丁胺是由三正丁基胺和焦磷酸按照2:1的摩尔比形成的混合物，并且在使用时可以采用DMF预先溶解形成溶液。

为了使本领域技术人员更易于实施本申请的方案，以下就示例中的制备方法进行详述。

第一步骤

双脱氧核苷需要进行干燥(否则会影响后续纯化处理)，以脱除其中的水分。其中的干燥方案可以是减压蒸馏；例如，在旋转蒸发仪中，将有机溶剂乙腈悬浮于双脱氧核苷之上进行减压蒸馏脱水。

第二步骤

将经过脱水干燥的双脱氧核苷与磷酸三甲酯、2，4，6-三甲基吡啶混合，并在冰浴控温的条件下滴加三氯硫磷进行反应。反应过程中，通过HPLC进行监控。当双脱氧核苷原料无剩余时，进行下一步反应。

第三步骤

向第二步骤的液态反应体系中，加入液态三丁胺和预先溶解(可以采用DMF/N，N-二甲基甲酰胺)为液体的焦磷酸三丁胺。撤去冰浴待温度升高至如室温(可以是20℃至25℃)后进行HPLC监控反应，直至无中间体产生，进行下一步操作。

第四步骤

在步骤三完成之后，向反应体系中加入冰水进行水解，从而获得分散于反应体系中的ddNTP-α-S。当反应体系的pH值接近或偏中性时，选择用冰水水解可以淬灭反应且避免产生气体，提高反应的可控性，且不会引入杂质，便于纯化。如果反应体系的pH值偏低，那么可以采用三乙基碳酸氢铵进行水解淬灭反应；或者在用冰水进行水解淬灭反应之后，再用三乙基碳酸氢铵调节pH值；但是这容易导致二氧化碳气体的产生，且提高了反应控制难度。

考虑到反应体系中各种杂质的存在，可以选择通过下述步骤进行纯化。

第五步骤

由于采用冰水进行了水解，且考虑到核苷酸的水溶性，因此反应体系用水的不良溶剂—二氯甲烷—进行萃取，并收集上层的水相。因此，从收集的水相中进行分离、提纯可以获得纯度更高的ddNTP-α-S。示例中选择进行柱层析的方式进行分离纯化。

例如示例中选择使用在生物制药中的蛋白质、核酸及多肽的分离纯化使用较多的离子交换树脂。离子交换树脂是一类具有官能团(能够交换离子的活性基团，如磺酸基、羧基、胺基等等)、网状结构、不溶性的高分子化合物材料，并且通常是以球形的颗粒物形式存在或者是多孔结构。并且，离子交换树脂是通过液相和固相中离子交换而实现其功能，并且由于离子交换是可逆的，因此可以通过再生而重复使用。离子交换树脂通常包括强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂四类。一般地，酸性离子交换树脂被命名为阳；碱性离子交换树脂则被命名为阴。

本申请示例中的柱层析可以单次或多次进行，根据纯度要求进行适当的选择。另外，根据有待纯化的产品中的成分可以选择不同的层析柱进行多次分步骤纯化，从而进一步提高纯度。

例如，本申请的示例中首先选择使用强阴离子交换树脂进行柱层析(例如LX-650树脂)，去除部分杂质后，再使用HZ201强碱性离子交换树脂，以如氯化锂水溶液为流动相进行洗脱。

在上述洗脱过程中，收集的洗脱产品液(产品纯度可以达到85％)可以进一步进行柱层析纯化，以再提高其纯度。柱层析之前可以选择进行浓缩；例如选择水浴减压浓缩。然后，将前述的洗脱产品液通过C18硅胶柱进行柱层析。即使用具有18个碳的烷烃链键合到硅胶上的键合硅胶作为固定相，再使用乙腈以及水构成的液相为流动相进行洗脱。通过上述即可获得经过纯化且纯度达到诸如98％的产品。

即获得锂盐形式的ddNTP-α-S，并且其结构如下式5：

式5。其中，Base表示的是碱基。

其中的氯化锂也可以采用氯化钠替代，相应地，这可以获得钠盐形式的ddNTP-α-S。通过该方式制作所需盐型可以避免引入杂质及减少工序。相比于本申请示例所采用的方案，直接加入盐溶液(例如，高氯酸盐)的方案会导致非目标盐型产品的存在，从而导致纯度下降、收率降低。例如，直接将C18的下柱液与高氯酸锂溶液混合，会使得部分ddNTP-α-S以铵盐(非目标盐型)的形式存在，相应地，其锂盐(目标盐型)形式的产品会减少。

以下结合实施例对本申请作进一步的详细描述。

实施例1

一步法化学合成2′，3′-双脱氧腺苷-5′-O-(α-硫代三磷酸)。

1.在旋转蒸发仪上，通过减压蒸馏，将44g(折187mmol)双脱氧腺苷/2′，3′-双脱氧腺苷用乙腈干燥2遍，且乙腈的用量为440ml/遍。然后，加入880ml磷酸三甲酯，再加38.5g2,4,6-三甲基吡啶。冰浴控制温度至0℃，滴加63.4g PSCl₃。滴加完后，在整个反应过程中控制温度为0℃反应。反应2h后，每小时监控HPLC，无原料剩余，结束反应，反应液不处理，进入下一步。

2.向上述反应液内加入45g三丁胺、410g焦磷酸三丁胺(DMF预先溶解)，升温至20℃。计时反应，反应0.5h，HPLC监控，反应至无中间体，结束反应。反应液用4L冰水水解，并用5L二氯甲烷萃取一次，收集上层水相作为待层析液。

3.柱层析:

对上述待层析液按照下述方式进行柱层析。

装填0.88L的LX-650强阴离子树脂柱，层析液以3500～4000us/c的电导值上样并流穿于该树脂柱，再水洗并收集下柱液；收集液再利用HZ201氯型树脂柱层析，以0.1M～0.5M氯化锂水溶液进行梯度洗脱，收到纯度大于85％的产品液即下柱收集液。

4.C18制备柱纯化：

将下柱收集液于水浴28℃减压浓缩到100OD/ml，用C18制备柱进行制备纯化，流动相为乙腈水溶液(0～5％乙腈/水溶液)，分到纯度大于98％的产品液，合并后于水浴28℃减压浓缩。

5.收集浓缩液通过超滤、定容得到最终33ml的100mM产品液(折3.3mmol)。

对获得最终产品进行HPLC分析，如图1所示，其峰结构如下表1。

表1

质谱图参阅图2，³¹P-NMR图参阅图3。

实施例2

一步法化学合成2′，3′-双脱氧胞苷-5′-O-(α-硫代三磷酸)。

1.称59g(折279mmol)双脱氧胞苷，用乙腈进行减压蒸馏干燥2遍，且乙腈用量为590ml/遍。然后加入1180ml磷酸三甲酯，再加57.4g 2,4,6-三甲基吡啶。然后将体系降温至2℃，滴加94.5g PSCl₃。滴加完后，控制T_内：3℃反应。反应2h后，每小时监控HPLC，无原料剩余，结束反应，反应液不处理，进入下一步。

2.向反应液内加入67.2g三丁胺、610g焦磷酸三丁胺(DMF预先溶解)，升温至20～25℃。计时反应，反应0.5h，HPLC监控，反应至无中间体，结束反应。反应液用4L冰水水解，并用5L二氯甲烷萃取一次，收集上层水相作为待层析液。

3.柱层析：

对上述待层析液按照下述方式进行柱层析。

装填1.18L的LX-650强阴离子树脂柱，层析液以3500～4000us/c的电导值上样并流穿于该树脂柱，再水洗并收集下柱液；收集液再利用HZ201氯型树脂柱层析，以0.1M～0.5M氯化锂水溶液进行梯度洗脱，收到纯度大于85％的产品液即下柱收集液。

4.C18制备柱纯化：

将下柱收集液于水浴28℃减压浓缩到100OD/ml，用C18制备柱进行制备纯化，流动相为乙腈水溶液(0～5％乙腈/水溶液)，分到纯度大于98％的产品液，合并后于水浴28℃减压浓缩。

5.收集浓缩液通过超滤、定容得到最终40ml的100mM产品液(折4mmol)。

对获得最终产品进行HPLC分析，如图4所示，其峰结构如下表2。

表2

质谱图参阅图5，³¹P-NMR图参阅图6。

实施例3

一步法化学合成2′，3′-双脱氧鸟苷-5′-O-(α-硫代三磷酸)。

1.称40g(折159mmol)双脱氧鸟苷，通过减压蒸馏的方式用乙腈干燥2遍，且400ml/遍。然后加入800ml磷酸三甲酯，再加32g 2,4,6-三甲基吡啶。然后将体系降温至5℃，滴加54g PSCl3。滴加完后，控制T_内：6℃反应。反应2h后，每小时监控HPLC，无原料剩余，结束反应，反应液不处理，进入下一步。

2.向内加入38.4g三丁胺、348g焦磷酸三丁胺(DMF预先溶解)，升温至20～25℃。计时反应，反应0.5h，HPLC监控，反应至无中间体，结束反应。反应液用2L冰水水解，并用2L二氯甲烷萃取一次，收集上层水相作为待层析液。

3.柱层析：

对上述待层析液按照下述方式进行柱层析。

装填0.8L的LX-650强阴离子树脂柱，层析液以3500～4000us/c的电导值上样并流穿于该树脂柱，再水洗并收集下柱液；收集液再利用HZ201氯型树脂柱层析，以0.1M～0.5M氯化锂水溶液进行梯度洗脱，收到纯度大于85％的产品液即下柱收集液。

4.C18制备柱纯化：

将下柱收集液于水浴28℃减压浓缩到100OD/ml，用C18制备柱进行制备纯化，流动相为乙腈水溶液(0～5％乙腈水溶液)，分到纯度大于98％的产品液，合并后于水浴28℃减压浓缩。

5.收集浓缩液通过超滤、定容得到最终30ml的100mM产品液(折3mmol)。

对获得最终产品进行HPLC分析，如图7所示，其峰结构如下表3。

表3

质谱MS图参阅图8，³¹P-NMR图参阅图9。

实施例4

一步法化学合成2′，3′-双脱氧胸苷-5′-O-(α-硫代三磷酸)。

1.称32g(折141.6mmol)双脱氧胸苷，通过减压蒸馏的方式用乙腈干燥2遍，且320ml/遍。然后加入640ml磷酸三甲酯，再加29g2,4,6-三甲基吡啶。然后将体系降温至4℃，滴加48g PSCl3。滴加完后，控制T_内：7℃反应。反应2h后，每小时监控HPLC，至原料小于5％，结束反应，反应液不处理，进入下一步。

2.向内加入34g三丁胺、310g焦磷酸三丁胺(DMF预先溶解)，升温至20～25℃。计时反应，反应0.5h，HPLC监控，反应无中间体小于5％，结束反应。反应液用3L冰水水解，并用3L二氯甲烷萃取一次，收集上层水相作为待层析液。

3.柱层析：

对上述待层析液按照下述方式进行柱层析。

装填0.64L的LX-650强阴离子树脂柱，层析液以3500～4000us/c的电导值上样并流穿于该树脂柱，再水洗并收集下柱液；收集液再利用HZ201氯型树脂柱层析，以0.1M～0.5M氯化锂水溶液进行梯度洗脱，收到纯度大于85％的产品液即下柱收集液。

4.C18制备柱纯化：

将下柱收集液于水浴28℃减压浓缩到100OD/ml，用C18制备柱进行制备纯化，流动相为乙腈水溶液(0～5％乙腈水溶液)，分到纯度大于98％的产品液，合并后于水浴28℃减压浓缩。

5.收集浓缩液通过超滤、定容得到最终32ml的100mM产品液(折3.2mmol)。

对获得最终产品进行HPLC分析，如图10所示，其峰结构如下表4。

表4

质谱MS图参阅图11，³¹P-NMR图参阅图12。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。