具有双受体激动作用的多肽衍生物及其用途
阅读说明：本技术 具有双受体激动作用的多肽衍生物及其用途 (Polypeptide derivative with double-receptor agonism and application thereof ) 是由 韩英梅 刘巍 刘冰妮 孔维苓 赵娜夏 夏广萍 商倩 靳京 孔晓华 李玉荃 王松会 于 2021-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种多肽衍生物、其修饰衍生物或其盐,以及所述多肽衍生物、其修饰衍生物或其盐的用途。所述多肽衍生物、其修饰衍生物或其盐包含具有以下通式Ⅰ的序列的多肽：通式Ⅰ：HX～(2)QGTFTSDX～(10)SKYLX～(15)EX～(17)X～(18)AX～(20)X～(21)FX～(23)AWLEX～(28)X～(2)～(9)X～(30),其中,X～(2)、X～(10)、X～(15)、X～(17)、X～(18)、X～(20)、X～(21)、X～(23)、X～(28)、X～(29)、X～(30)的定义与权利要求书和说明书的定义一致。本发明的多肽衍生物是GC/GLP-1受体的双重激动剂,对能量代谢产生协同影响,能够有效降低血糖同时减轻体重、改善体脂水平,在糖尿病、肥胖等代谢性疾病的治疗领域具有潜在的应用价值。(The invention provides a polypeptide derivative, a modified derivative thereof or a salt thereof, and application of the polypeptide derivative, the modified derivative thereof or the salt thereof. The polypeptide derivative, modified derivative or salt thereof comprises a polypeptide having a sequence of the following general formula I: general formula I: HX 2 QGTFTSDX 10 SKYLX 15 EX 17 X 18 AX 20 X 21 FX 23 AWLEX 28 X 2 9 X 30 Which isIn, X 2 、X 10 、X 15 、X 17 、X 18 、X 20 、X 21 、X 23 、X 28 、X 29 、X 30 Are in accordance with the definitions of the claims and the description. The polypeptide derivative is a dual agonist of a GC/GLP-1 receptor, has synergistic effect on energy metabolism, can effectively reduce blood sugar, simultaneously reduce weight and improve body fat level, and has potential application value in the field of treatment of metabolic diseases such as diabetes, obesity and the like.)
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种具有胰高血糖素/胰高血糖素样肽-1双重受体激动作用的胰高血糖素衍生肽以及其用途。
背景技术
肥胖是引起多种疾病的风险因素，已成为全球性的公众健康问题。尤其是包括2型糖尿病(T2DM)的代谢综合征、心血管病、非酒精性脂肪肝等常见疾病，其发病率与病程进展与肥胖密切相关。多项大样本临床研究发现，与正常体重人群相比，心血管代谢多重疾病的发病率在BMI25.0–29.9kg/m2、30.0–34.9kg/m2和BMI>35.0kg/m2的超重、肥胖或严重肥胖人群分别高出2倍、5倍、15倍(Lancet 2,e277–e285，2017)。研究表明，80～90％的T2DM患者超重或肥胖，适度的减重(4～5kg)有利于预防和控制病情，包括减少患病率、控制血糖和致残(死)率(Curr.Med.Res.Opin.2011,27(7),1431-1438)。
饮食控制和锻炼是最理想的减轻体重手段，但一般收效不佳。肥胖的药物干预疗效有限或存在多种风险，包括严重的心血管影响和因中枢神经作用引起的精神症状等副作用。至目前为止，少有药物单独使用能够达到超过5-10％的体重减轻幅度。T2DM治疗药物中只有SGLT2抑制剂和GLP-1受体激动剂类对体重控制有良性效果。减肥手术效果显著，但手术风险较大，而且长期效应仍不确定。因此，用于控制体重的药物仍存在巨大的临床需求，兼具原发病症治疗作用并能够安全有效地控制体重的药物是理想的选择。
机体的血糖和能量调节信号系统是由多种因子维持精细的平衡，包括不同的多肽类激素。胰高血糖素原(pro-glucagon)是一种具有158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中被加工生成胰高血糖素(GC)、胰高血糖素样肽-1、2(GLP-1，2)及胃泌素等多种胰高血糖素原的衍生肽，这些激素参与葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空、肠道生长以及食物摄取等多种生理功能的调节。因此，基于胰高血糖素原的肠道激素的治疗已成为代谢病领域深受关注的研究方向。
GC是对应于胰高血糖素原的33至61位氨基酸组成的含29个氨基酸的衍生肽，在胰腺α细胞加工生成，在机体饥饿、寒冷等应激状态下作用于肝脏，通过糖分解和糖异生作用使血糖水平升至正常范围。除升血糖作用外，动物和人体试验结果表明GC还具有发热、增加饱腹感、脂解、脂肪氧化、生酮等作用，长期给药可以改善能量代谢，包括减轻体重，但这些对能量代谢的有益作用因其固有的升糖作用未能得以应用。
GLP-1是对应于胰高血糖素原的72至108位氨基酸组成的含37个氨基酸残基的衍生肽，在机体进餐响应中由肠道L细胞分泌，作用于胰腺β-细胞促进胰岛素分泌、同时拮抗GC受体抑制血糖升高。GLP-1受体激动剂被开发为糖尿病患者的高血糖治疗剂，降血糖的同时保护和增殖胰岛细胞，而且减缓胃排空和抑制食物摄入，可有效减轻体重。已经有7个GLP-1受体激动剂上市，包括短效的艾塞那肽、利拉鲁肽、利西拉来(1～2次/日)、以及长效的阿必鲁泰、杜拉鲁肽、Byuderon、以及索玛鲁肽(1次/周)。GLP-1受体激动剂类药物虽具有安全独特的降血糖作用，但用于减轻体重时，一般需要使用大剂量，而这些药物在大剂量下易产生胃肠道副作用，耐受性差，治疗窗较窄。因此，仍然需要更为耐受的，可有效控制血糖和减轻体重的治疗剂。
胃泌酸调节素(Oxintomodulin，OXM)是胰高血糖素原翻译后修饰加工过程中在肠道产生的激素，在进餐反应中从回肠L-细胞与GLP-1等激素同时分泌。OXM的急性影响包括对胃排空、胃和胰腺的外分泌以及摄食的抑制作用、静息能量消耗等，可产生减轻体重作用。OXM特异的受体至今尚未明确，但研究发现OXM是内源性GCGR/GLP-1R双重激动剂，而且对两个受体的活性效力弱于各受体的天然配体。在动物和人体试验中发现，外周给予OXM可减少摄食量和减轻体重，在肥胖对象中增加代谢率以及特别是与活动相关的能量消耗。尤其是在临床试验中大剂量外周给予OXM，减轻体重的同时恶心、呕吐等常见胃肠道副作用发生概率较低。因此，基于OXM或GLP-1/GCGR双重激动剂的治疗对肥胖症和肥胖型糖尿病显示了潜在的应用价值，但至目前为止，尚无有关药物上市。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种胰高血糖素多肽衍生物，所述多肽是基于GC天然序列设计的变体，其通过GC/GLP-1受体的双重激动作用对能量代谢产生协同影响，可有效降低血糖、减轻体重、改善体脂水平，可用于糖尿病、肥胖、代谢综合征以及非酒精性脂肪肝等疾病的治疗。
本发明的另一个目的是提供一种包含本发明的胰高血糖素多肽衍生物的药物组合物。
本发明的又一个目的是提供一种本发明的胰高血糖素多肽衍生物的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一方面，本发明提供一种多肽衍生物、其修饰衍生物或其盐，其包含具有以下通式Ⅰ的序列的多肽：
HX2QGTFTSDX10SKYLX15EX17X18AX20X21FX23AWLEX28X29X30
通式Ⅰ
其中：
X2为Ser、D-Ser或Aib；
X10为Tyr；
X15为Asp或Glu；
X17为Arg、Gln或Lys；
X18为Ala；
X20为侧链被修饰的Lys；
X21为Asp或Glu；
X23为Val或Ile；
X28为Ala、Gly或Ser；
X29为Gly或Glu；
X30为Gly或不存在；
C-末端羧基游离或酰胺化。
在一些优选的实施方案中，所述通式Ⅰ的序列中，
X17为Arg或Lys；
X28为Ala或Ser；
X29为Gly；
X30为Gly；
并且，C-末端羧基酰胺化。
在优选的实施方案中，通式Ⅰ的序列中，X2为Aib。
在优选的实施方案中，所述通式Ⅰ的序列选自：
SEQ.ID.NO.4HSQGTFTSDYSKYLDERAAK*EFIAWLEAGG
SEQ.ID.NO.5HdSQGTFTSDYSKYLEEKAAK*EFIAWLEAGG
SEQ.ID.NO.6HdSQGTFTSDYSKYLEERAAK*EFIAWLEAGG
SEQ.ID.NO.7HAibQGTFTSDYSKYLDERAAK*EFIAWLEAGG
SEQ.ID.NO.8HAibQGTFTSDYSKYLEERAAK*EFIAWLEAGG
SEQ.ID.NO.9HAibQGTFTSDYSKYLDERAAK*EFVAWLEAGG
SEQ.ID.NO.10HSQGTFTSDYSKYLDERAAK*EFIAWLESGG
SEQ.ID.NO.11HdSQGTFTSDYSKYLEERAAK*EFVAWLESGG
SEQ.ID.NO.12HAibQGTFTSDYSKYLDERAAK*EFIAWLESGG
SEQ.ID.NO.13HAibQGTFTSDYSKYLEERAAK*EFIAWLESGG
SEQ.ID.NO.14HAibQGTFTSDYSKYLEEKAAK*EFVAWLESGG
SEQ.ID.NO.15HAibQGTFTSDYSKYLDEKAAK*EFIAWLESGG
在SEQ.ID.NOs.4～15中，K*为侧链ε-氨基被修饰的Lys，C-末端羧基酰胺化。
在一些优选的实施方案中，所述通式Ⅰ的序列中，
X17为Arg或Lys；
X28为Gly；
X29为Gly；
X30不存在；
并且，C-末端羧基酰胺化。
在优选的实施方案中，所述通式Ⅰ的序列选自：
SEQ.ID.NO.16HSQGTFTSDYSKYLDERAAK*EFIAWLEGG
SEQ.ID.NO.17HdSQGTFTSDYSKYLEERAAK*EFVAWLEGG
SEQ.ID.NO.18HAibQGTFTSDYSKYLDERAAK*EFIAWLEGG
SEQ.ID.NO.19HAibQGTFTSDYSKYLEERAAK*EFIAWLEGG
SEQ.ID.NO.20HAibQGTFTSDYSKYLEEKAAK*EFVAWLEGG
SEQ.ID.NO.21HAibQGTFTSDYSKYLDEKAAK*EFIAWLEGG
在SEQ.ID.NOs.16～21中，K*为侧链ε-氨基被修饰的Lys，C-末端羧基酰胺化。
在一些优选的实施方案中，所述通式Ⅰ的序列中，
X17为Arg或Lys；
X28为Gly；
X29为Glu；
X30为Gly；
并且，C-末端羧基酰胺化。
在优选的实施方案中，所述通式I的序列选自：
SEQ.ID.NO.22HSQGTFTSDYSKYLDERAAK*EFIAWLEGEG
SEQ.ID.NO.23HdSQGTFTSDYSKYLEEKAAK*EFVAWLEGEG
SEQ.ID.NO.24HAibQGTFTSDYSKYLDERAAK*EFIAWLEGEG
SEQ.ID.NO.25HAibQGTFTSDYSKYLEERAAK*EFIAWLEGEG
SEQ.ID.NO.26HAibQGTFTSDYSKYLEEKAAK*EFVAWLEGEG
SEQ.ID.NO.27HAibQGTFTSDYSKYLDEKAAK*EFIAWLEGEG
在SEQ.ID.NOs.22～27中，K*为侧链ε-氨基被修饰的Lys，C-末端羧基酰胺化。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述侧链被修饰的Lys是指所述Lys的侧链ε-氨基通过亲水性连接片段偶联脂肪酰基而被修饰。
优选地，所述用于修饰Lys的侧链ε-氨基的亲水性连接片段选自由Glu、γGlu、Gly和Ado(8-氨基-3,6二氧辛酸)中的一种或多种组成的片段。所述亲水性连接片段优选为-γGlu-、-γGlu-γGlu-、-Glu-γGlu-、-γGlu-Gly-Gly-、-γGlu-Gly-γGlu-、-γGlu-Ado-Ado-、-Ado-Ado-γGlu-或-γGlu-Ado-Ado-γGlu-。
在本发明优选的实施方案中，所述脂肪酰基为C14-20的脂肪酰基，包括C14-20的单脂肪酰基或脂肪二酸单酰基；更优选C16-18脂肪酰基，最优选C16单脂肪酰基(棕榈酰基)。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其含有本发明所述的多肽衍生物、其修饰衍生物或其盐和任选的一种或多种药学上可接受的辅料。
优选地，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等。
优选地，所述水溶性填充剂包括但不限于甘露醇、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖；所述pH调节剂包括但不限于枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等有机或无机酸以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸氢铵盐等生理上可接受的无机碱或盐；所述稳定剂包括但不限于EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物如HPC、HPC-SL、HPC-L或HPMC、环糊精、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷；所述渗透压调节剂包括但不限于氯化钠或氯化钾。
优选地，本发明所述的药物组合物可以静脉、肌肉或皮下注射剂形式或口服、直肠、鼻腔给药。治疗剂量范围取决于治疗对象、给药方式、适应症以及其他因素等。
又一方面，本发明提供本发明所述的多肽衍生物、其修饰衍生物或其盐在制备用于治疗代谢性疾病的药物中的应用，优选地，所述代谢性疾病为糖尿病、肥胖、脂肪肝、高血脂症和/或代谢综合征；更优选地，所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。
胰高血糖素衍生肽的结构：内源性GLP-1是对应于胰高血糖素原的72至108位氨基酸组成的含37个氨基酸残基(7-36/37)的衍生肽,其氨基酸序列为HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(7-36)(SEQ ID NO.1),HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(7-37)，其C-端羧基游离或酰胺化。内源性GC是对应于胰高血糖素原的33至61位氨基酸组成的含29个氨基酸的衍生肽，氨基酸序列为：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO.2)，C-端羧基游离。天然GLP-1和GC的氨基酸序列有47％的同源性(Andreas Evers等，J.Med.Chem.2017,60,4293-4303)，二者的N-端序列高度保守，GLP-1对其受体具有高度选择性，而GC同时是GLP-1受体的弱激动剂。
胃泌酸调节素(Oxinthomodulin，OXM)是内源性GC/GLP-1R双重激动剂，其氨基酸序列是HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQ ID NO.3),包含GC的原序列(1-29)和对应于胰高血糖素原氨基酸序列82-89的插入肽-1(IP-1，30-37)。以OXM为先导序列的现有技术文件，如CN200980132562.9、CN201080027026.5、CN201680062196.4中是将GC原序列(1-29)的变体，以Exendin-4的C-末端10肽(GPSSGAPPPS缩写为Cex)序列延长C-端。而CN201680036771.3是选择将OXM序列的C-末端插入肽段(KRNRNNIA)以GGPSSG肽段替换的设计方案。这些已有的技术均采取了在保留GC全长序列(1-29)的基础上进行若干位点突变，再以不同肽段延长的设计思路。
基于GC序列设计双重激动剂时，为得到预期的效价平衡，现有公开资料中多采取对GC序列的16—23片段进行类似GLP-1相应序列的替换，或对16、17、18、20、23等个别位点的突变。而GC序列C-末端变化对GC/GLP-1受体的识别极为敏感，尤其是对GC受体的活性极为敏感。因此，现有技术方案中普遍选择保留C-末端27-29片段的原序列，仅有个别技术方案采取保守的突变措施，例如，将敏感氨基酸27Met替换为Leu，28Asn替换为Glu或Ala。多肽序列上的长链脂肪酰修饰一般是为了延长多肽的体内半衰期，但在应用于GC/GLP-1双重受体激动剂的设计时，适当位点上的修饰可以调节受体选择性和活性平衡。现有技术资料中采取的普遍措施为10Lys突变残基的ε-侧链上修饰棕榈酰基，得到效价平衡的强激动剂(EC50pM)。但本发明人发现，这些强激动剂在模型动物体内药效评价时长期给药后出现糖耐量异常现象，并不能达到预期的代谢调控目的。
综观本领域公开的技术资料可以发现，由于长链多肽的结构复杂性和与其受体结合机制的特殊性，适当活性强度和效价比平衡的双重激动剂的获得是需要通过不同技术措施的合理组合来实现的，对多肽结构的改变，如不同位点氨基酸残基的突变、修饰位点、基团的改变都可以导致活性和效价比平衡的变化，其结果一般是难以预料的。
本发明提供的技术方案中，多肽主链的设计针对GC序列的1-26肽段的个别位点进行合理突变的基础上再适当延长C末端，后采取侧链修饰措施，例如用20位脂肪酰修饰，得到了活性效价比平衡而且溶解性、稳定性均佳的GC/GLP-1双重受体激动剂。
在本发明的一些特定实施方案中，对GC(1-26)序列的位点16-20进行了合理替换，如，将16Ser替换为Glu，18Arg替换为Ala或Lys等有利于提高GLP-1受体选择性的突变。与公开的多数技术方案中对GC序列C-末端的保守替换方案不同，本发明优选技术方案中是以Glu替换27Met，再以Gly、Ala等电中性氨基酸替换位点28、29。一般认为，GC序列的C-末端羧基游离有利于保持活性。本发明实施方案中用Glu替换27Met保留了C-端的负电性而减少对活性的影响，进而将C-末端酰胺化提高了肽序列的稳定性。
一般地，对天然序列进行尽可能少的改变有利于保持同源性，但基于内源性胰高血糖素原序列的设计存在较多的成药性难题：N-端二肽易被体内的二肽激肽酶识别而被水解失活，导致血浆半衰期短(≤12min)；物理性质不稳定，即等电点(pI)7.6，呈中性，而且疏水，溶解性差，很容易在溶液中聚集沉淀；序列中有Met、Asp、Asn等易于氧化或消旋的氨基酸，导致化学性质不稳定。
在本发明优选实施方案中，所述多肽序列的2Ser通常被替换为Aib或D-Ser，以提高代谢稳定性，保证多肽活性的持续发挥。与此同时，在本发明优选的实施方案中，进一步对GC序列中的敏感氨基酸进行了替换，如15，21位的Asp替换为Glu。
经过上述调整后的多肽序列增加了序列C-端的负电荷数量，降低了pI值，有助于提高肽在生理条件下的溶解性并提高化学稳定性。
脂肪酰基团和连接子的结构以及修饰位点同时影响化合物的活性。在本发明的实施方案中，在肽序列20位Lys的侧链上通过亲水性连接臂修饰了脂肪酰基。在本发明的某些实施方案中，所述亲水性连接臂是-γ-Glu-、-γ-Glu-γ-Glu-或在另一些实施方案中是-Ado-Ado-γ-Glu-。所述脂肪酰基是C14-20的脂肪酰基，优选为C14-20的单脂肪酰基或脂肪二酸单酰基。在某些优选的实施方案中，所述脂肪酰基是C16或C18单脂肪酰基。
本发明提供具有GLP-1/胰高血糖素双重受体激动作用的肽，通过本发明前述的结构设计，所述肽具有以下活性特点：本发明提供的多肽与GLP-1R/GCGR各受体的天然配体相比至少具有0.1％的受体激动活性，如本发明实施例中以EC50(nM)表示的活性。本发明提供的化合物的EC50(nM)值包括但不限于内源性配体(GLP-1)的10-2～102倍，优选的活性强度相当于内源性配体(GLP-1)、比内源性配体(GLP-1)弱或强1-10倍，如2、3、6或10倍，或强10-100倍。对胰高血糖素受体(GCGR)的激动活性强度以EC50(nM)值表示，与内源性配体(GC)相当或相当于内源性配体的1～103倍。在优选的实施方案中，本发明的化合物对GLP-1受体的激动作用强于对胰高血糖素受体的激动作用，或对两个受体的激动作用强度相当。对GLP-1和胰高血糖素受体的相对活性强度可以用效价比(GLP-1REC50/GCGREC50)表示，即本发明提供的包含通式Ⅰ的序列的多肽对GLP-1/胰高血糖素受体的效价比包括但不限于10:1至1:100。在本发明优选实施方案中该比例在10:1-1:10范围，而更优选范围是5:1-1:10。
本发明提供的具有通式Ⅰ的序列的多肽衍生物的基本肽链可以通过本领域公知的方法制备得到：
1)通过常规固相或液相方法逐步或通过片段组装合成；
2)在宿主细胞中表达编码多肽的核酸构建体，并从宿主细胞培养物回收表达产物；
3)影响编码多肽的核酸构建体的无细胞体外表达，并回收表达产物；
或通过方法1)、2)或3)的任意组合来获得肽片段，随后连接这些片段以获得目标肽。
本发明提供的实施方案中优选地，使用Fmoc固相合成方法制备得到目标肽，该技术是本领域技术人员所熟知的。
取代基可以通过上述肽合成步骤逐步合成引入。使用适当保护基的取代基，如，Fmoc-8-氨基-3,6二氧杂辛酸，和Fmoc-γ-Glu-OtBu。脂肪链部分的引入，尤其是脂肪二酸单酰基，可以使用但不限于C18、C20烷酸单叔丁酯来实现。在每个偶联步骤后，未反应的中间物可以使用过量的乙酸酐和吡啶进行封闭。可修饰的Lys的ε-氨基可以使用Mtt或Dde保护。
纯化：缀合反应之后，可以通过本领域公知的合适方法将目标产物分离。适用的方法包括但不限于超滤法、透析法或色谱法等。本发明实施方案中优选采用制备型高效液相色谱法纯化。
受体活性测定：本发明的实施方案中通过GLP-1/GC受体介导的体外cAMP产生的影响评价了所述多肽对GLP-1/GC受体的作用。
对体重和血糖的调节作用：本发明的实施方案中采用糖负荷正常小鼠模型单次给药和高脂饮食肥胖型糖尿病小鼠(Dio)模型连续给药评价了本发明提供多肽的对血糖和体重的影响。
本发明的实验结果表明，通过本发明技术方案提供的化合物对GLP-1受体(GLP-1R)的活性与内源性GLP-1相当，对GC受体(GCGR)则保留了一定的活性，效价比在适当范围内。与单纯的GLP-1受体激动剂相比，通过本发明技术方案提供的化合物在有效降低血糖的同时更为显著地促进减重和防止增重，可以逆转或缓解肝脏脂肪性病变和胰岛素抵抗，对复杂的代谢综合征显示了预料不到的多重益处。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了化合物dgc016、dgc005、dgc020对DIO鼠体重的影响；
图2示出了化合物dgc005、dgc016、dgc020连续给药23天对DIO模型鼠肝脏病变的影响；其中，图2A示出了空白对照组的肝脏病理切片检查图，图2B示出了模型对照组的肝脏病理切片检查图，图2C示出了阳性对照药组的肝脏病理切片检查图，图2D示出了化合物dgc005组的肝脏病理切片检查图，图2E示出了化合物dgc016组的肝脏病理切片检查图，图2F示出了化合物dgc020组的肝脏病理切片检查图；
图3示出了化合物dgc003、dgc004、dgc010、dgc017连续给药13天对DIO模型鼠体重的影响。
图4示出了化合物dgc005、dgc016分剂量连续给药21天对DIO模型鼠体重的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本实施例仅为解释本发明，不意味以任何方式限制本发明内容。
氨基酸缩写的说明：
Gly:甘氨酸(G)
Ala:丙氨酸(A)
Val:缬氨酸(V)
Leu:亮氨酸(L)
Phe:苯丙氨酸(F)
Trp:色氨酸(W)
Ser:丝氨酸(S)
Thr:苏氨酸(T)
Glu:谷氨酸(E)
Gln:谷氨酰胺(Q)
Asp:天冬氨酸(D)
Asn:天冬酰胺(N)
Tyr:酪氨酸(Y)
Arg:精氨酸(R)
Lys:赖氨酸(K)
His:组氨酸(H)
Aib:α-氨基异丁酸
Ado:8-氨基-3,6-二氧杂辛酸
试剂缩写的说明
Boc:叔丁氧基羰基
Tert-Bu:叔丁基
DCM:二氯甲烷
DIC：二异丙基碳二亚胺
Fmoc:9-芴甲氧基羰基
HoBt:1-羟基苯并三唑
HBTU:2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲鎓六氟磷酸酯
HATU:O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基-脲鎓六氟磷酸酯
Mtt:4-甲基三苯甲基
NMP:N-甲基吡咯烷酮
DMF:二甲基甲酰胺
Pbf:2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃
Dde:1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基-丁基
Trt:三苯基甲基
EDT:乙二硫醇
TFA:三氟乙酸
TIS:三异丙基硅烷
FBS:胎牛血清
实施例1
本发明提供的多肽基本线性序列以及侧链修饰衍生肽按照以下通用方法制备：
1)合成：采用Fmoc策略，用PSI200型多肽合成仪，按照如下步骤逐步合成：
a)在活化剂系统存在下由树脂固相载体和Fmoc保护的C-端氨基酸偶联得到Fmoc-氨基酸-树脂；其中，合成C-端酰胺化多肽采用氨基树脂，如Rink Amide AM，Rink Amide，Rink MBHA等；Fmoc-氨基酸和树脂比(mol/mol)为3～5:1,偶联活化剂为HOBT/DIC或HOBT/HBTU/DIEA。
b)肽链的延长：通过固相合成法按照肽序列氨基酸顺序连接氨基酸，得到N-端和侧链保护的肽－树脂偶联物；带侧链氨基酸采取如下保护措施：色氨酸用Boc，谷氨酸用OtBu，赖氨酸用Boc，谷氨酰胺用Trt，酪氨酸用tBu，丝氨酸用Trt或tBu，天冬氨酸用OtBu，苏氨酸用tBu，半胱氨酸用Trt，精氨酸用Pbf保护，组氨酸的α-氨基用Boc保护，侧链用Trt或Boc保护，可修饰的赖氨酸的ε-氨基用Dde保护。使用的偶联活化剂为HOBT/DIC、HOBT/HBTU/DIEA和HOBT/HATU/DIEA，茚三酮法检测反应终点，脱保护剂为含20％哌啶的NMP(DMF)溶液。
c)赖氨酸的ε-氨基脱保护：
上述步骤中合成完成的全保护多肽-树脂以NMP-DCM(1：1V/V)洗涤3次，加入新鲜制备的2.0％水合肼的NMP溶液，在室温下搅拌12.0分钟，过滤，重复两次，用DCM和NMP各洗涤树脂三次。
d)赖氨酸侧链的修饰：
赖氨酸的ε-氨基脱保护完成后，按比例(树脂：连接基1:4-5(mol/mol))加入Fmoc-Ado或Fmoc-γ-Glu(tBu)以及HOBt/HBTU,DIEA，搅拌反应2.0-4.0小时，脱Fmoc保护，同法继续连接所需链长的连接臂和脂肪酰基。重复两次后反应仍未完全，加过量的乙酸酐/吡啶封闭，继续下一步反应。
e)多肽的裂解：全保护肽-树脂先用NMP洗涤，后用DCM洗涤3-6次去除NMP，加入TFA/EDT/TIS/H2O(92.5:2.5:2.5:2.5v/v)溶液，置室温氮气保护下搅拌90min，脱保护和脱树脂。抽滤得滤液，用过量冰乙醚沉淀粗多肽，离心，收集沉淀，再用少量乙醚洗涤沉淀，真空下干燥，得到多肽粗品。
2)纯化：将多肽粗品溶解于水或10-15％乙腈(10-50mg/ml)，采用制备型HPLC法，C8或C18色谱柱，乙腈－水－三氟乙酸系统分离纯化，浓缩，冻干，得多肽纯品(纯度≥97％)。
以上述方法制备，并经质谱确证得到以下表1中所示结构的多肽衍生物。
表1合成的化合物
注：所有化合物C-末端羧基酰胺化
实施例2对GLP-1/GC受体的作用
通过对GLP-1/GC受体介导的体外cAMP产生的影响评价所述多肽对GLP-1/GC受体的作用。
稳定表达GLP-1R、GCGR的HEK293细胞系，用于GLP-1R激动剂和GCGR激动剂的筛选。
受试样品配制：将化合物配制成100μM储存液，逐步稀释成1μM、100nM、10nM、1nM、10-1nM、10-2nM、10-3nM、H2O的工作浓度。
阳性对照品配制：
GLP-1：
贮存方法：0.1％BSA超纯水溶解的1mM储存液，-80℃密闭保存。
工作浓度：1μM、100nM、10nM、1nM、10-1nM、10-2nM、10-3nM和H2O(每孔都含有0.1％的BSA)。
胰高血糖素(GC)：
贮存方法：1mM DMSO溶液，-80℃密闭保存。
工作浓度：1μM、100nM、10nM、1nM、10-1nM、10-2nM、10-3nM和DMSO(每个孔都含有1％的DMSO)。
试剂与仪器：
主要试剂：DMEM培养基(GIBCO,Cat No:12800017)；
cAMP检测试剂盒(PerkinElmer,Cat No:TRF0264)。
主要仪器：Envision 2104多功能微孔板酶标仪(PerkinElmer)。
实验步骤：
1)将待测化合物用无血清培液(含0.1％BSA,0.5mM IBMX)配成工作浓度的2倍。
2)消化细胞，将细胞用无血清培液悬浮(含0.5mM IBMX)，并且进行计数，按照1000细胞/5μl/孔加入384孔板，然后加入5μl待测化合物，避光反应30min。
3)反应结束后，加入cAMP检测底物，室温避光反应60min。
4)反应结束后，在Envision2104多功能微孔板酶标仪检测，最终读取数值为OD665nm处与OD615nm处的比值。
5)用Origin软件计算50％有效浓度(EC50)。
表2多肽对GLP-1/GC受体的激动作用
表2显示的体外受体激动活性结果表明，具有本发明的氨基酸序列的多肽衍生物具有GLP-1/GC受体的双重激动活性，多肽衍生物的效价比在适当范围内。
实施例3实施例1化合物的降血糖作用
采用正常小鼠单次给药糖负荷试验评价了实施例1化合物的降血糖作用。
方法：昆明种小鼠(雄性，体重范围20-22g)，于屏障环境动物房内适应性饲养3天后分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组以及受试化合物组，每组5只，禁食6h。空白对照组和模型对照组给予生理盐水，受试化合物组和阳性对照组给药剂量为30nmol/kg，阳性对照药为索马鲁肽(semaglutide)。给药60min后模型对照组、阳性对照组以及受试化合物组分别以2.5g/kg(0.01mL·g-1体重)灌胃给予葡萄糖，空白对照组给予蒸馏水，测定糖负荷后第30min时的血糖值。结果见表3。
表3化合物对正常小鼠糖负荷的影响(n＝5，mmol/L)
分组
空腹血糖值
糖负荷后血糖值
血糖降低率(％)
空白对照组
4.08±0.83
4.48±0.83
-
模型对照组
3.43±0.66
17.00±2.96
-
阳性对照组
3.78±1.28
5.58±1.55<sup>**</sup>
67.18
dgc005
3.96±0.62
6.70±1.88<sup>**</sup>
60.59
dgc016
3.66±0.77
6.82±1.78<sup>**</sup>
59.88
dgc020
4.24±0.63
9.82±2.06<sup>**##</sup>
42.24
dgc003
4.20±0.97
8.82±1.63<sup>**#</sup>
48.12
dgc004
3.42±0.85
8.46±2.28<sup>**#</sup>
50.24
dgc013
3.92±0.51
9.26±1.76<sup>**##</sup>
45.53
dgc010
3.78±0.84
8.10±1.13<sup>**#</sup>
52.35
dgc017
3.72±0.37
10.36±1.87<sup>**##</sup>
39.06
dgc006
3.80±0.51
8.02±2.92<sup>**</sup>
52.82
dgc008
3.64±1.00
8.72±1.99<sup>**#</sup>
48.70
**：与模型对照组相比P＜0.01；
##：与阳性对照组相比P＜0.01；#：与阳性对照组相比P＜0.05
结果显示，与模型对照组相比，受试化合物在给药剂量下对正常小鼠糖负荷血糖升高有显著抑制作用(P＜0.01)，化合物dgc005、dgc016和dgc006的抑制作用与阳性对照药相当。
实施例4
化合物dgc005、dgc016、dgc020多次给药对肥胖模型鼠的治疗作用
试验方法：
C57BL/6J Gpt小鼠(购自江苏集萃药康生物科技有限公司)(6-8周龄)，用H10060高脂饲料(购自北京华阜康生物科技有限公司)饲养饮食诱导肥胖(DIO)，空白对照组(n＝5)采用标准饲料饲养，购入后饲养11周。首次给药前一天，模型组按照体重随机分组(体重范围39.5-49.5g)，分为5组，每组5只，分别为模型对照组、阳性对照组、受试化合物组(dgc005、dgc016、dgc020)每天皮下注射给药，空白对照组、模型对照组每天皮下注射生理盐水，共给药23天，阳性对照药和受试化合物给药剂量均为30nmol/kg，各组给药容积均为0.005mL/g体重。每次给药前称量体重，每隔2天称量72h进食量。末次给药前禁食16h，测定空腹血糖值，眼眶静脉丛采血测定甘油三酯、总胆固醇；摘取肝脏进行病理切片观察。
结果：
1、对体重的影响：见图1。给药第3天开始所有受试化合物体重降幅与阳性对照药相比区分明显，并持续降低。与给药第一天相比，受试化合物dgc005、dgc016、dgc020末次给药前未禁食体重降幅分别为27％、29.3％、25.0％，而阳性对照药降幅为20.9％。说明在给药剂量下受试化合物降体重作用优于阳性对照药。
2、多次给药对空腹血糖的影响：见表4。
表4连续给药23天后各样品对动物空腹血糖的影响(n＝5)
**：与模型对照组相比P＜0.01
#：与阳性对照组相比P＜0.05
△△：与空白对照组相比P＜0.01
表4结果显示，受试化合物连续给药23天，对空腹血糖改善作用与阳性对照药相当。
3、对摄食量的影响：结果见表5。受试样品组72h进食量相对于模型对照组存在不同程度的减少，第7天开始72h进食量呈逐渐增加趋势。
表5多次给药对动物72h进食量的影响(g/只，n＝5)
给药天数
空白对照组
模型对照组
阳性对照组
dgc005
dgc016
dgc020
4
11.30
5.60
3.50
2.50
3.30
3.50
7
9.30
6.00
5.80
3.80
4.80
4.50
10
10.40
8.20
5.40
4.20
6.10
5.70
13
9.20
7.80
5.50
4.60
5.70
5.50
4、对血脂的影响：结果见表6。化合物dgc005组显示一定的降低总胆固醇(TC)作用(与模型对照组相比P＜0.05，与阳性对照组相比P＜0.05，与空白对照组相比无统计学差异)，同时可显著降低甘油三酯(TG)(与模型对照组相比P＜0.01，与阳性对照组相比P＜0.05，与空白对照组相比P＜0.01)。化合物dgc016组显示了降低甘油三酯的作用(与模型对照组相比P＜0.01，与阳性对照组相比无统计学差异，与空白对照组相比P＜0.01)。
表6多次给药23天后受试化合物对动物血脂的影响(mmol/L，n＝5)
空白对照组
模型对照组
阳性对照组
dgc005
dgc016
dgc020
TC
3.11±0.24
3.95±0.52<sup>△</sup>
3.97±0.52<sup>△</sup>
3.07±0.50<sup>*#</sup>
3.32±0.73
3.62±0.84
TG
1.35±0.08
1.21±0.14
0.90±0.13<sup>**</sup>△△
0.58±0.10<sup>**#</sup>△△
0.75±0.10<sup>**</sup>△△
0.88±0.28△
**：与模型对照组相比P＜0.01；*：与模型对照组相比P＜0.05
#：与阳性对照组相比P＜0.05
△△：与空白对照组相比P＜0.01；△：与空白对照组相比P＜0.05
5、肝脏病理切片检查：
将各组C576L/6小鼠肝脏用12％甲醛溶液固定制成标本，组织经修块，梯度酒精脱水，石蜡包埋，HE染色，光镜下检查。
结果：
空白对照组：2只动物肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞形态清晰，汇管区及间质未见明显病理改变(见图2A)。
模型对照组：2只动物可见重度病变：弥漫性肝细胞空泡变性，部分血管周围单个核细胞浸润(2/2、重度)(见图2B)。
阳性对照药组：2只动物可见轻微至中度病变：少量至较多肝细胞空泡变性，其中1只动物部分血管周围单个核细胞浸润，另见局部透明型肝细胞灶(1/2、轻微，1/2、中度)(见图2C)。
化合物dgc005组：2只动物肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞形态清晰，汇管区及间质未见明显病理改变(见图2D)。
化合物dgc016组：2只动物肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞形态清晰，汇管区及间质未见明显病理改变(见图2E)。
化合物dgc020组：2只动物肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞形态清晰，汇管区及间质未见明显病理改变(见图2F)。
结论：
由镜下检查结果可见：与空白对照组比较，本试验模型对照组肝脏可见：不同程度的肝细胞空泡变性，部分血管周围单个核细胞浸润，呈重度病变，阳性对照药组肝脏亦可见上述病变，病变程度明显减轻，呈轻微至中度病变，表明对本模型肝脏病变有一定的治疗效果。本发明受试化合物组则肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞形态清晰，汇管区及间质未见明显病理改变，与空白对照组无差别，表明本发明受试化合物对本模型肝脏病变治疗效果明显。
实施例5
化合物dgc003、dgc004、dgc010、dgc017给药2周对DIO模型鼠体重的影响
方法：用H10060高脂饲料饲养饮食诱导肥胖(DIO)C57BL/6N小鼠，对照组(n＝5)采用标准饲料饲养。首次给药前一天，模型组按照体重随机分组(体重范围40.5-50.5g)，分为6组，每组5只，分别为模型对照组、阳性对照组、受试化合物组(dgc003、dgc004、dgc010、dgc017)每天皮下注射给药1次，空白对照组、模型对照组每天皮下注射生理盐水，共给药14天，阳性对照药和受试化合物给药剂量均为30nmol/kg，各组给药容积均为0.005mL/g体重。每次给药前称量体重，每隔2天称量72h进食量。
结果：见图3。连续给药2周，阳性对照药给药1-5天体重降幅明显，其后下降趋势平缓，受试化合物组5天之后与阳性对照药的降幅区分明显，并呈持续下降趋势，到末次给药dgc003、dgc004、dgc010、dgc017组降幅分别达到16.7％、19.9％、16.4％、15.9％，大于阳性对照药的12.9％。
实施例6
化合物dgc005、dgc016分剂量多次给药对DIO鼠体重、血糖的影响
方法：
C57BL/6N小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，40只，模型组(n＝35)用H10060高脂饲料饲养饮食诱导肥胖(DIO)，空白对照组(n＝5)采用标准饲料饲养，均饲养36周。首次给药当天，模型组按照体重随机分组(体重范围45-60g)，分为7组，每组5只，分别为模型对照组、阳性对照组(索马鲁肽，semaglutide)-10nmol/kg、阳性对照组-30nmol/kg、dgc005-10nmol/kg、dgc005-30nmol/kg、dgc016-10nmol/kg、dgc016-30nmol/kg，阳性对照组和受试化合物组每天皮下注射给药，空白对照组、模型对照组每天皮下注射生理盐水，共给药22天(各组给药容积均为0.005mL/g体重)。每次给药前称量体重，每隔2天称量72h进食量。于末次给药前禁食16h，给药后30min灌胃给予葡萄糖溶液(1g/kg，给药容积为0.01mL/g体重)进行糖耐量试验，于给糖后0.5h测定血糖值。
结果：
1)对体重的影响：结果见图4。与模型对照组相比，阳性对照组和受试化合物组从给药第二天开始出现持续的体重降低，受试化合物大剂量组从第3天开始，低剂量组从第4天开始与阳性对照药降低幅度区分明显，到给药第21天受试化合物各剂量组未禁食体重降幅均优于相应剂量的阳性对照组。结果如下表7所示。
表7各组动物给药第21天未禁食体重与第0天相比降低率(％，n＝5)
2)对血糖的影响：
末次给药前，受试化合物各剂量组均能明显降低动物给药前空腹血糖值，糖负荷后0.5h，受试化合物各剂量组对动物糖负荷血糖值升高有明显抑制作用(与模型对照组相比P＜0.01，与阳性对照组、空白对照组相比无统计学差异)，说明受试化合物长期给药仍具有与阳性对照药相当的降血糖作用。结果见表8。
表8末次给药(第22天)后各样品对动物糖负荷的影响(n＝5)
**：与模型对照组相比P＜0.01；*：与模型对照组相比P＜0.05
△△：与空白对照组相比P＜0.01；△：与空白对照组相比P＜0.05。
序列表
<110> 天津药物研究院有限公司
<120> 具有双受体激动作用的多肽衍生物及其用途
<130> DIC20110042R
<150> 2020103882080
<151> 2020-5-9
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> GLP-1
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> Glucagon
<400> 2
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> Oxintomodulin(Glucagon)
<400> 3
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn Ile Ala
35
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 4
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> 丝氨酸为D-Ser
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 5
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> 丝氨酸为D-Ser
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 6
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 7
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 8
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 9
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Val Ala Trp Leu Glu Ala Gly Gly
20 25 30
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 10
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> 丝氨酸为D-Ser
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 11
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Val Ala Trp Leu Glu Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 12
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 12
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 13
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 14
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Val Ala Trp Leu Glu Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 15
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 15
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 16
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 16
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Gly Gly
20 25
<210> 17
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> 丝氨酸为D-Ser
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 17
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Val Ala Trp Leu Glu Gly Gly
20 25
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 18
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Gly Gly
20 25
<210> 19
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 19
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Gly Gly
20 25
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 20
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Val Ala Trp Leu Glu Gly Gly
20 25
<210> 21
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 21
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Gly Gly
20 25
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 22
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Gly Glu Gly
20 25 30
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> 丝氨酸为D-Ser
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 23
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Val Ala Trp Leu Glu Gly Glu Gly
20 25 30
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 24
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Gly Glu Gly
20 25 30
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 25
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Gly Glu Gly
20 25 30
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 26
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Val Ala Trp Leu Glu Gly Glu Gly
20 25 30
<210> 27
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Aib
<220>
<221> BINDING
<222> (20)..(20)
<223> Lys侧链被修饰
<400> 27
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Glu Gly Glu Gly
20 25 30