聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法
阅读说明：本技术 聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法 (Use and method of polymer anion exchange filler in preparation of liraglutide ) 是由 张欣 彭小波 林巧 侯世兴 蔡俊杰 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及蛋白质工程领域,特别是涉及聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法,所述聚合物阴离子填料选自NanoQ-15L、Source 15Q或BestPoly 15Q；所述制备方法包括如下步骤：1)在层析柱上装填聚合物阴离子交换填料,并用修饰缓冲液Ⅰ置换层析柱；2)将利拉鲁肽中间体溶液加入层析柱；3)将修饰剂加入层析柱进行柱上修饰反应；4)修饰反应完成后洗脱收集利拉鲁肽。本发明实现了修饰反应和层析纯化在柱上同时进行,减少反应釜及管道设施的使用,降低有机试剂的使用量,减少危废的排放,明显提升生产回收率,降低了生产成本。同时本发明制备的利拉鲁肽为形状规则的蛋白结晶,在稳定性上具有优势。(The invention relates to the field of protein engineering, in particular to application and a method of a polymer anion exchange filler in preparation of liraglutide, wherein the polymer anion exchange filler is selected from NanoQ-15L, Source 15Q or BestPoly 15Q; the preparation method comprises the following steps: 1) filling a polymer anion exchange filler on the chromatographic column, and replacing the chromatographic column by using a modification buffer solution I; 2) adding the liraglutide intermediate solution into a chromatographic column; 3) adding a modifying agent into a chromatographic column to carry out on-column modification reaction; 4) and eluting and collecting the liraglutide after the modification reaction is completed. The invention realizes the simultaneous implementation of modification reaction and chromatographic purification on the column, reduces the use of reaction kettles and pipeline facilities, reduces the use amount of organic reagents, reduces the discharge of hazardous wastes, obviously improves the production recovery rate and reduces the production cost. Meanwhile, the liraglutide prepared by the method is a protein crystal with a regular shape, and has an advantage in stability.)
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，特别是涉及聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法。
背景技术
利拉鲁肽[Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1(7-37)]为一种GLP-1(胰高血糖素样肽-1)类似物，英文名Liraglutide，其序列为H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-g-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。利拉鲁肽由谷氨酸连接子将31个氨基酸主链Arg34-GLP-1(7-37)和十六碳棕榈酸脂肪酸连接而成，连接位点位于26位Lys侧链氨基，结构详见附图1。利拉鲁肽由诺和诺德公司开发，并于2010年1月获得FDA批准上市，于2011年10月获CFDA批准在中国上市用于治疗Ⅱ型糖尿病。利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，不仅作用时间长，而且充分保留了天然GLP-1的多项生理活性，可安全有效降糖并可能对多种心血管危害起保护作用。2014年12月获FDA批准，用于BMI大于等于27(超重)同时伴有至少一种与超重相关疾病(高血压，2型糖尿病，高血脂等)，或BMI大于等于30(肥胖)的成年人减轻体重。
目前利拉鲁肽的制备可以分为化学合成和生物半合成。化学合成主要是通过固相合成氨基酸链，如专利CN107960079A、CN104045706B、CN103304660A、CN106699871A等公开的合成方法。但是化学合成普遍存在环境不友好、收率较低、反应步骤复杂、总体成本较高等问题。
生物半合成利拉鲁肽系通过生物手段制备中间体Arg34-GLP-1(7-37)，通过化学修饰反应在中间体26位Lys侧链氨基上连接修饰剂，再通过层析等纯化手段获得利拉鲁肽。生物半合成法较化学合成法有成本低、环境污染小、收率高、反应条件温和等优点。但是，因为中间体上存在其他的修饰位点，导致中间体修饰工艺控制难度高、下游纯化工序复杂、整体的生产过程回收率较低。如专利CN104592381A、CN1951965A通过中间体(Arg34-GLP-1(7-37))修饰获得利拉鲁肽，其工艺路线均包括中间体的化学修饰和修饰后的层析纯化，修饰反应均在反应釜中进行，反应结束后转移至层析设备上进行利拉鲁肽纯化，存在设备设施成本高、工艺繁琐、利拉鲁肽生产回收率低的问题。制备的利拉鲁肽均为液体或不定型粉末，其稳定性差，不利于运输和储存。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途。
优选地，所述聚合物阴离子填料例如为NanoQ-15L、Source 15Q或BestPoly 15Q。
优选地，所述用途为在利拉鲁肽中间体与利拉鲁肽修饰剂反应制备利拉鲁肽中的用途。
本申请还提供一种利拉鲁肽的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
1)在层析柱上装填聚合物阴离子交换填料，并用修饰缓冲液Ⅰ置换层析柱；
2)将利拉鲁肽中间体溶液加入层析柱；
3)将利拉鲁肽修饰剂加入层析柱进行柱上修饰反应；
4)修饰反应完成后洗脱收集利拉鲁肽。
优选地，所述聚合物阴离子填料例如为NanoQ-15L、Source 15Q或BestPoly 15Q。
优选地，以修饰缓冲液Ⅰ的总体积为基准，所述修饰缓冲液Ⅰ包括10-50mM碳酸钠、0.1～1.0mM EDTA、50～70％(v/v)乙腈的水溶液。
优选地，所述利拉鲁肽中间体为Arg34-GLP-1(7-37)，结构如图2所示。
优选地，所述制备方法还包括将步骤(4)洗脱收集的利拉鲁肽进行结晶。
优选地，结晶的方法包括以下步骤：向步骤(4)洗脱收集的利拉鲁肽中加入结晶试剂结晶，从而获得利拉鲁肽晶体。
优选地，所述结晶试剂包括碱性氨基酸、酚类化合物和聚乙二醇。
优选地，以结晶体系的总体积为基准，所述碱性氨基酸的终浓度为0.1～1.0M，所述酚类化合物的终浓度为3～8g/L，所述聚乙二醇的终浓度为0.1-0.5g/L。
优选地，所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的一种或多种。所述酚类化合物为苯酚。所述聚乙二醇的分子量为1000以上；更优选地，所述聚乙二醇为PEG5000。
如上所述，本发明的聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途和方法，具有以下有益效果：
(1)相较传统工艺，本发明实现了修饰反应和层析纯化在柱上同时进行，减少反应釜及管道设施的使用，因此可以节约设备设施，和传统工艺相比，降低有机试剂的使用量，减少危废的排放，明显提升了利拉鲁肽的生产回收率，降低了生产成本。
(2)本发明将利拉鲁肽制备为形状规则的蛋白结晶，相较于等电点沉淀工艺制备的不定型粉末，结晶的利拉鲁肽在稳定性上具有优势。
附图说明
图1显示为本发明的利拉鲁肽结构示意图。
图2显示为本发明的Arg34-GLP-1(7-37)序列示意图。
图3显示为修饰反应示意图。
图4显示为实施例1制备的利拉鲁肽镜检图。
图5显示为实施例2制备的利拉鲁肽镜检图。
图6显示为实施例3制备的利拉鲁肽镜检图。
图7显示为实施例4制备的利拉鲁肽镜检图。
图8显示为实施例1、2、3和4制备的利拉鲁肽加速过程总杂变化趋势图。
图9显示为实施例1制备的利拉鲁肽动力学曲线。
图10显示为实施例2制备的利拉鲁肽动力学曲线。
图11显示为实施例3制备的利拉鲁肽动力学曲线。
图12显示为实施例4制备的利拉鲁肽动力学曲线。
具体实施方式
针对生物半合成利拉鲁肽制备存在的不足，本申请提供一种聚合物阴离子交换填料在制备利拉鲁肽中的用途。
所述聚合物阴离子填料为以高分子聚合物为基质，基质上键合阴离子交换基团的填料。
所述高分子聚合物选自聚丙烯酸酯、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯。所述高分子聚合物的聚合度范围为2～25。
所述阴离子交换基团选自-CH2-O-CHOHCH2-O-CHOH-CH2-N+(CH3)3、CH2N+(CH3)3、-O-CH2CHOHCH2N+(CH3)3、-O-CH2CH2-N+(C2H5)2H、-O-CH2CHOHCH2-N+(C2H5)2H。
所述聚合物阴离子填料例如为NanoQ-15L、Source 15Q或BestPoly 15Q。
在一种实施方式中，所述聚合物阴离子填料的孔径为15～30μm。
在一种实施方式中，所述用途为在利拉鲁肽中间体与利拉鲁肽修饰剂反应制备利拉鲁肽中的用途。
在一种实施方式中，所述利拉鲁肽中间体为Arg34-GLP-1(7-37)。
所述利拉鲁肽修饰剂为利拉鲁肽脂肪酸侧链。在一种实施方式中，所述利拉鲁肽修饰剂为棕榈酸-谷氨酸-OSU。
本申请还提供一种利拉鲁肽的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
1)在层析柱上装填聚合物阴离子交换填料，并用修饰缓冲液Ⅰ置换层析柱；
2)将利拉鲁肽中间体溶液加入层析柱；
3)将利拉鲁肽修饰剂加入层析柱进行柱上修饰反应；
4)修饰反应完成后洗脱收集利拉鲁肽。
在一种实施方式中，所述聚合物阴离子填料为以高分子聚合物为基质，基质上键合阴离子交换基团的填料。
所述高分子聚合物选自聚丙烯酸酯、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯，优选为聚苯乙烯-二乙烯基苯。
所述阴离子交换基团选自-CH2-O-CHOHCH2-O-CHOH-CH2-N+(CH3)3、CH2N+(CH3)3、-O-CH2CHOHCH2N+(CH3)3、-O-CH2CH2-N+(C2H5)2H、-O-CH2CHOHCH2-N+(C2H5)2H。
所述聚合物阴离子填料例如为NanoQ-15L、Source 15Q或BestPoly 15Q。
在一种实施方式中，所述聚合物阴离子填料的孔径为15～30μm。
在一种实施方式中，步骤1)为将层析柱装填为动态轴向压缩柱，并用修饰缓冲液Ⅰ置换层析柱。装填后，柱压控制范围为20～50Bar，层析柱高度为23～27cm。
在一种实施方式中，装填后用氢氧化钠溶液淋洗层析柱不少于4倍柱体积，再用修饰缓冲液Ⅰ置换层析柱。
在一种实施方式中，以修饰缓冲液Ⅰ的总体积为基准，所述修饰缓冲液Ⅰ包括10-50mM碳酸钠、0.1～1.0mM EDTA、50～70％(v/v)乙腈(ACN)的水溶液。
在一种实施方式中，所述修饰缓冲液Ⅰ中EDTA的终浓度可以选自以下任一：0.1～0.2mM、0.2～0.3mM、0.3～0.4mM、0.4～0.5mM、0.5～0.6mM、0.6～0.7mM、0.7～0.8mM或0.9～1.0mM。
在一种实施方式中，步骤1)中用修饰缓冲液Ⅰ置换层析柱具体为用修饰缓冲液Ⅰ淋洗层析柱不少于4倍柱体积。
在一种实施方式中，步骤2)中，所述利拉鲁肽中间体用修饰缓冲液Ⅱ溶解获得利拉鲁肽中间体溶液，所述修饰缓冲液Ⅱ为10-50mM的碳酸钠溶液。
在一种实施方式中，所述利拉鲁肽中间体溶液的浓度为5-20mg/ml。
在一种实施方式中，所述利拉鲁肽中间体溶液按照150～900cm/h的流速泵入层析柱。
在一种实施方式中，所述利拉鲁肽中间体为Arg34-GLP-1(7-37)(CAS No：204521-68-6，购自北京贝努基生物科技有限公司，货号Bennu-G2002)。Arg34-GLP-1(7-37)的结构是将GLP-1(7-37)的Lys34替换成Arg，其序列如图2所示。所述修饰反应指Arg34-GLP-1(7-37)的26位Lys侧链氨基与利拉鲁肽修饰剂在层析柱上反应，反应示意图见图3。
在一种实施方式中，步骤3)中，利拉鲁肽修饰剂用乙腈溶解后获得利拉鲁肽修饰剂的溶液再加入层析柱。
在一种实施方式中，利拉鲁肽修饰剂的溶液浓度为20～100mg/ml。
在一种实施方式中，步骤3)中，按照利拉鲁肽中间体：利拉鲁肽修饰剂＝1:1～1:1.2的摩尔比将所述利拉鲁肽修饰剂加入层析柱。
在一种实施方式中，步骤(3)中，按100～900cm/h的速度将利拉鲁肽修饰剂泵入层析柱中，推动利拉鲁肽修饰剂在层析柱流动，并完成2-6倍柱体积循环修饰，控制反应时间为0.5-2小时。
在一种实施方式中，所述利拉鲁肽修饰剂为棕榈酸-谷氨酸-OSU。
在一种实施方式中，步骤(4)中，修饰反应完成后先用洗脱液1淋洗层析柱，再用洗脱液2梯度洗脱收集利拉鲁肽。
在一种实施方式中，所述洗脱液1包括10mM-20mM Tris、3％～7％的乙腈溶液。所述淋洗指使用洗脱1淋洗层析柱不少于4倍柱体积。
所述洗脱液2为一组溶液，包括A液和B液，其中A液包括20mM Tris和30％乙腈；B液包括20mM Tris，0.3M NaCl和30％乙腈。所述梯度洗脱的流速为100～900cm/h。所述收集指根据紫外吸收收集洗脱的利拉鲁肽蛋白馏分。
在一种实施方式中，所述制备方法还包括将步骤(4)洗脱收集的利拉鲁肽进行结晶。
在一种实施方式中，结晶的方法包括以下步骤：向步骤(4)洗脱收集的利拉鲁肽中加入结晶试剂，从而获得利拉鲁肽晶体。
在一种实施方式中，所述结晶试剂包括碱性氨基酸、酚类化合物和聚乙二醇。所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的一种或多种。所述酚类化合物例如为苯酚。所述聚乙二醇为分子量为1000以上的聚乙二醇。所述聚乙二醇例如为PEG 1000、PEG 1500、PEG 2000、PEG 4000、PEG5000、PEG 8000等。
在一种实施方式中，以结晶体系的总体积为基准，所述碱性氨基酸的终浓度为0.1～1.0M。以结晶体系的总体积为基准，所述酚类化合物的终浓度为3～8g/L。以结晶体系的总体积为基准，所述聚乙二醇的终浓度为0.1-0.5g/L。
以结晶体系的总体积为基准，所述碱性氨基酸的终浓度选自以下中的任意范围：0.1～0.3M、0.3～0.5M、0.5～0.7M或0.7～1.0M。
以结晶体系的总体积为基准，所述酚类化合物的终浓度选自以下中的任意范围：3～4g/L、4～5g/L、5～6g/L、6～7g/L、7～8g/L。
以结晶体系的总体积为基准，所述聚乙二醇的终浓度选自以下中的任意范围：0.1-0.2g/L、0.2-0.3g/L、0.3-0.4g/L或0.4-0.5g/L。
在一种实施方式中，加入结晶试剂后，调节结晶体系的pH至6.5-8.0。较佳的，调节结晶体系的pH至6.8～7.2。
在一种实施方式中，调节pH后20～25℃搅拌60～90min。在合适的温度下搅拌可以使结晶体系均一，有利于结晶的产生。
在一种实施方式中，搅拌结束后2～8℃下静置8-12h使利拉鲁肽蛋白结晶，结晶后分离获得利拉鲁肽晶体。
在一种实施方式中，还需要将分离获得的利拉鲁肽晶体洗涤、干燥。
洗涤指用水洗涤利拉鲁肽蛋白晶体，去除残留的缓冲盐、苯酚、PEG5000和有机溶剂；干燥指除去利拉鲁肽蛋白湿粉中的水分，收获利拉鲁肽晶体。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
1.1修饰
将74mg Arg34-GLP-1(7-37)(序列示意图如图2所示)、80mg EDPA、5.2ml 50％乙腈水溶液的混合物在室温温和摇动至完全溶解。将棕榈酸-谷氨酸-OSU(购自成都普康生物科技有限公司，货号PK000574)(36mg，CAS号：294855-91-7，结构式为)溶解于乙腈(884μL)，加入蛋白溶液中，在室温温和摇动1小时20min，补入溶于50％乙醇水溶液(36ml)的甘氨酸(36mg)终止反应。反应结束用水稀释三倍后，用醋酸调pH至4.5，离心收集沉淀，用1M Tris复溶，再用水稀释8-10倍，准备C8纯化。修饰反应示意图如图3所示。
1.2纯化
层析填料：C8-100-10(20mm，80ml)；流动相A：50mM Tris，pH 9.0；流动相B：ACN；洗脱梯度为B液60min内0-100％。根据紫外吸收值收集利拉鲁肽馏分，等电点沉淀后干燥，得到利拉鲁肽干粉25mg。取少量混悬进行镜检，如图4所示，可见呈不定型粉末状的利拉鲁肽产物。Arg34-GLP-1(7-37)到利拉鲁肽干粉的回收率为33.78％，本发明中回收率的计算方法为：以利拉鲁肽产量除以Arg34-GLP-1(7-37)投料量，本实施例中即25/74＝33.78％。
实施例2
2.1溶液配制
修饰缓冲液Ⅰ：20mM碳酸钠，60％乙腈的水溶液，0.5mM EDTA，pH10.5。
修饰缓冲液Ⅱ：100mM碳酸钠。
Arg34-GLP-1(7-37)溶液制备：取Arg34-GLP-1(7-37)冻干粉900mg，用修饰缓冲液Ⅱ按照20mg/ml充分重悬，再补入等体积乙腈搅拌至澄清，控制pH 10.0。
修饰剂溶液制备：将棕榈酸-谷氨酸-OSU(180mg)溶解于乙腈(10ml)即得。
洗脱液1：5％乙腈；洗脱液2：A：20mM Tris，30％乙腈；B：20mM Tris，0.3M NaCl，30％乙腈。
2.2修饰和纯化
取NanoQ-15L填料装于直径20mm层析柱，高度25cm，用0.5M氢氧化钠清洗2倍柱体积，用纯化水冲洗2倍柱体积，后用修饰缓冲液Ⅰ置换4倍柱体积，泵入Arg34-GLP-1(7-37)蛋白溶液。用修饰缓冲液Ⅰ复平衡2-3倍柱体积。用注射器将修饰剂溶液注入层析柱中，再用修饰缓冲液Ⅰ进行循环平衡，共反应60min。
修饰反应结束后，用洗脱液1淋洗3倍柱体积，再进行梯度洗脱：10％B～30％B，洗脱2倍柱体积；30％B～50％B，洗脱10倍柱体积，洗脱流速15ml/min。根据UV280收集利拉鲁肽馏分。
2.3利拉鲁肽结晶
在利拉鲁肽蛋白馏分中补加0.5M的精氨酸，补加5g/L的苯酚，PEG5000 0.2g/L，调节pH至7.0，4℃静置10h，离心收集利拉鲁肽蛋白晶体湿粉。按每克蛋白湿粉加入20ml水洗涤三次，离心，真空干燥得到利拉鲁肽干粉506mg。取少量混悬进行镜检，如图5所示，可见均一性较好，晶体形状规则。
Arg34-GLP-1(7-37)到利拉鲁肽的回收率为56.22％。
实施例3
3.1溶液配制
修饰缓冲液Ⅰ：20mM碳酸钠，60％乙腈的水溶液，0.5mM EDTA，pH10.5。
修饰缓冲液Ⅱ：100mM碳酸钠。
蛋白溶液制备：取Arg34-GLP-1(7-37)-OH冻干粉5.55g，用修饰缓冲液Ⅱ按照20mg/ml充分重悬，再补入等体积乙腈搅拌至澄清，控制pH为10.5。
修饰剂溶液制备：将棕榈酸-谷氨酸-OSU 1g溶解于50ml乙腈即得。
洗脱液1:5％乙腈；洗脱液2：A-20mM Tris，30％乙腈；B-20mM Tris，0.3M NaCl，30％乙腈。
3.2修饰和纯化
取Source 15Q填料装于直径50mm层析柱，柱高25cm，用0.5M氢氧化钠清洗2柱体积，用纯化水冲洗2倍柱体积，再用B液再生3倍柱体积，最后用修饰缓冲液Ⅰ平衡4倍柱体积，载入蛋白。用修饰缓冲液Ⅰ复平衡2-3倍柱体积。用泵将修饰剂溶液泵入层析柱中，再用修饰缓冲液Ⅰ进行循环平衡，控制反应时间90min。
修饰反应结束后，用洗脱液1淋洗3倍柱体积，再进行梯度洗脱：10％B～30％B，洗脱2倍柱体积；30％B～50％B，洗脱10倍柱体积，洗脱流速50ml/min。根据UV280收集利拉鲁肽馏分。
3.3利拉鲁肽结晶
在利拉鲁肽蛋白馏分中补加0.5M的精氨酸，补加5g/L的苯酚，PEG5000 0.2g/L，调节pH至7.0，4℃静置10h，离心收集利拉鲁肽蛋白晶体湿粉。按每克蛋白湿粉加入20ml水洗涤三次，离心，真空干燥得到利拉鲁肽3.34g。取少量混悬进行镜检，如图6所示，可见均一性较好，晶体形状规则。
Arg34-GLP-1(7-37)到利拉鲁肽的回收率为60.18％。
实施例4
4.1溶液配制
修饰缓冲液Ⅰ：20mM碳酸钠，0.5mM EDTA，65％乙腈的水溶液，pH10.5。
修饰缓冲液Ⅱ：100mM碳酸钠。
蛋白溶液制备：取Arg34-GLP-1(7-37)-OH冻干粉32.00g，用修饰缓冲液Ⅱ按照20mg/ml充分重悬，再补入等体积乙腈搅拌至澄清，控制pH为9.0。
修饰剂溶液制备：将棕榈酸-谷氨酸-OSU(6.4g)溶解于乙腈(320ml)即得。
洗脱液1:5％乙腈；洗脱液2：A-20mM Tris，30％乙腈；B-20mM Tris，0.3M NaCl，30％乙腈。
4.2修饰和纯化
取BestPoly 15Q填料装于直径150mm层析柱，柱高25cm。用0.5M氢氧化钠清洗2倍柱体积，用纯化水冲洗2倍柱体积，再用B液再生3倍柱体积，最后用修饰缓冲液Ⅰ平衡4倍柱体积，泵入蛋白溶液。用修饰缓冲液Ⅰ复平衡2-3倍柱体积。用泵将修饰剂溶液泵入层析柱中，再用修饰缓冲液Ⅰ进行循环平衡，控制反应时间120min。
修饰反应结束后，用洗脱液1淋洗3倍柱体积，再进行梯度洗脱：10％B～30％B，洗脱2倍柱体积；30％B～50％B，洗脱10倍柱体积，洗脱流速500ml/min。据UV280收集利拉鲁肽馏分。
4.3利拉鲁肽结晶
在利拉鲁肽蛋白馏分中补加0.5M的精氨酸，补加5g/L的苯酚，PEG5000 0.2g/L，调节pH至7.0，4℃静置10h，离心收集利拉鲁肽蛋白晶体湿粉。按每克蛋白湿粉加入20ml水洗涤三次，离心，真空干燥得到利拉鲁肽20.65g。取少量混悬进行镜检，如图7所示，可见均一性较好，晶体形状规则。
Arg34-GLP-1(7-37)到利拉鲁肽的回收率为64.53％。
对比总结
1.不同实施例利拉鲁肽的回收率对比见表1：
表1不同实施例利拉鲁肽的回收率对比
实施例
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
Arg34-GLP-1(7-37)-OH投料量
74mg
900mg
5.55g
32.00g
利拉鲁肽收获量
25mg
506mg
3.34g
20.65g
利拉鲁肽生产回收率
33.78％
56.22％
60.18％
64.53％
由上表可知，与利拉鲁肽传统制造工艺(实施例1)相比，采用本发明的制造工艺(实施例2、3、4)制备的利拉鲁肽在生产回收率上具有优势。且本发明在层析规模20mm(实施例2)、50mm(实施例3)和150mm(实施例4)的放大生产中，回收率稳定。
2.不同实施例制备的利拉鲁肽稳定性对比
加速试验
将不同实施例制备的利拉鲁肽分别避光置于稳定性培养箱，4℃孵化12周，使用高效液相色谱法(HPLC)分别测定0周、4周、8周和12周的总杂和高分子蛋白。
总杂检测方法：色谱柱Kromasil C4柱或其他等效柱，流动相A:磷酸铵乙腈缓冲液，pH8.5，流动相B是80％乙腈水溶液，检测波长215nm。
HMWP的检测方法：色谱柱Waters Insulin HWMP凝胶柱或其他等效柱，流动相为冰醋酸-异丙醇-水溶液，检测波长276nm。
不同实施例制备的利拉鲁肽加速试验高分子蛋白和总杂结果见表2和图8。其中高分子蛋白在12周的加速过程中均低于0.1％，各实施例均无明显增长。总杂上，实施例1增幅约0.123％/周，实施例2、3和4增幅分别为0.004％/周、0.007％/周和0.021％/周，均远低于实施例1。
表2不同实施例利拉鲁肽加速试验数据汇总
以上加速试验证实，相比于实施例1的不定形粉末状利拉鲁肽、实施例2、3和4制备的晶体利拉鲁肽在稳定性上更优。
ThT荧光法
GLP-1中的淀粉样纤维(主要是β折叠的不稳定蛋白)会影响其稳定性，不同的制造工艺会导致淀粉样纤维的增长速率不同，进而导致在储存过程中的稳定性不一致。ThT(硫黄素T)能与样品中的淀粉样纤维结合，通过提高孵育温度，ThT可快速与制品中增加的淀粉样纤维反应，通过检测反应过程发射的荧光可记录淀粉样纤维的增长速率，再通过曲线拟合计算滞后时间Tlag(达到荧光快速增长需要的时间)，通过滞留时间可对比不同样品的稳定性，越大的滞后时间代表更优的稳定性。
将各实施例制备的利拉鲁肽分别配制为2mg/ml溶液，分别取200μL于96孔板中，各加入4μL 50mM ThT溶液，在96孔板中混合后，于酶标仪中40℃恒温孵育，然后连续检测荧光强度(激发波长：440nm，发射波长：480nm)。根据动力学曲线计算t1/2(达到荧光吸收最大值一半的时间)，在通过公式计算Tlag＝t1/2-2/k。其中k为增长期曲线的斜率。
实施例1、2、3和4的动力学曲线见图9至图12，对应的滞后时间见下表3。
表3不同实施例利拉鲁肽滞后时间Tlag对比
实施例
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
K
28.25
49.61
48.27
52.76
t<sub>1/2</sub>
2.32
4.39
4.19
4.83
T<sub>lag</sub>
2.24
4.35
4.15
4.79
实施例2、3和4制备的晶体利拉鲁肽滞后时间大于实施例1的不定形粉末利拉鲁肽，证明晶体利拉鲁稳定性上更优。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。