一种索玛鲁肽的合成方法
阅读说明：本技术 一种索玛鲁肽的合成方法 (Synthetic method of somaglutide ) 是由 袁慧星 黄嘉诚 汪伟 尹传龙 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及多肽合成技术领域,尤其涉及一种索马鲁肽的合成方法。本发明首先固相合成片段I(第1～19位),液相合成侧链单体(第20位氨基酸及其侧链),然后固相合成偶联侧链单体和其余氨基酸的片段II(第21～31位),最后将片段I和片段II缩合,精制,获得索马鲁肽。本发明采用特殊的合成策略,提高了粗肽纯度,收率大幅度提高,同时缩短了生产周期,降低了成本、且片段和侧链合成工艺更有利于规模化大生产,同时解决了三废处理中对钯残留的难题。(The invention relates to the technical field of polypeptide synthesis, in particular to a synthetic method of Somaloutide. According to the invention, firstly, a fragment I (1 st to 19 th positions) is synthesized in a solid phase, a side chain monomer (20 th position amino acid and a side chain thereof) is synthesized in a liquid phase, then, a fragment II (21 st to 31 th positions) of the side chain monomer and other amino acids is synthesized in a solid phase, and finally, the fragment I and the fragment II are condensed and refined to obtain the Somaloude. The method adopts a special synthesis strategy, improves the purity of the crude peptide, greatly improves the yield, shortens the production period, reduces the cost, is more favorable for large-scale production by the fragment and side chain synthesis process, and solves the problem of palladium residue in the three-waste treatment.)
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种索玛鲁肽的合成方法。
背景技术
索玛鲁肽(Semaglutide)是由Nove Nordisk公司研发的长效GLP-1类似物。2017年12月5日由FDA批准，在美国上市。
其结构(肽序)：
H-His7-Aib8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Arg34-Gly35-Arg36-Gly37-OH
AEEA为特殊氨基酸:2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸。
具体结构如下：
现有索马鲁肽的合成工艺大致分为两大类：
第一类是基因重组方式：(1)通过基因重组方法合成主链[Arg34]GLP-1-(9-37)肽；(2)固相合成侧链片段即17–((S)–1–叔丁氧基羰基–3–{2–[2–({2–[2–(2，5–二氧吡咯烷–1–基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰}丙基氨基甲酰)十七烷酸叔丁酯；(3)Boc-His(Boc)-Aib-OH。然后依次偶联侧链片段和Boc-His(Boc)-Aib-OH，最后三氟乙酸裂解得到索马鲁肽粗肽。如专利US9732137B2、CN105154498。
第二类是Fmoc固相合成方式。这类合成方法报道比较多，有依次顺序进行标准Fmoc固相，Lys脱除保护基进行侧链继续偶联合成，也有片段缩合。
专利CN104017062A和US8129343:是采用标准Fmoc固相肽合成制备[Aib8，Arg34]GLP–1–(7–37)粗肽并通过制备级HPLC纯化得到不保护的[Aib8，Arg34]GLP–1–(7–37)纯品。[Aib8，Arg34]GLP–1–(7–37)和17–((S)–1–叔丁氧基羰基–3–{2–[2–({2–[2–(2，5–二氧吡咯烷–1–基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰}丙基氨基甲酰)十七烷酸叔丁酯在2:1的乙腈/水反应，并通过制备级HPLC纯化以产生目标化合物。
专利CN201210501406采用Fmoc固相肽合成制备[Aib8，Arg34]GLP–1–(7–37)全保护肽树脂，脱除Lys26ε氨基保护基，将17–((S)–1–叔丁氧基羰基–3–{2–[2–({2–[2–(2，5–二氧吡咯烷–1–基氧基羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰}丙基氨基甲酰)十七烷酸叔丁酯偶联至Lys26ε氨基上，裂解和纯化后即可得到产品。
专利CN109456401B、CN108059666B:首先液相或固相法合成六个片段(1-4，5-9，10-16，17-22，23-27，28-31)，再将片段通过固相法偶联得到全保护肽树脂，裂解得到索马鲁肽粗肽。
以上方法中，专利US9732137B2、CN105154498需要采用基因重组的方法进行主链合成，基因重组技术本身的局限性以及此类合成的杂质不确定性，限制了该工艺的进行。专利CN201210501406采用逐次偶联，在Lys26ε氨基保护基处通常使用Alloc，需要采用四三苯基膦钯进行脱除，然后再进行侧链修饰，该工艺引入钯残留，且价格昂贵，增加了生产成本，同时该位点进行修饰，由于肽链较长，位阻较大，修饰难度较大，需要采用多次几倍的投料，进一步增加了成本。专利CN109456401B、CN108059666B等采用片段缩合，也没有规避使用Lys位点的保护基团，也是一样存在采用采用四三苯基膦钯进行脱除，然后再进行侧链修饰。虽然降低了位阻，但是分成6个片段，自然增加原料的成本，同时使得工艺变得复杂化。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种索马鲁肽的合成方法。该方法明显提高了索马鲁肽的纯度和收率的纯度，同时降低了生产成本，缩短了生产周期，对环境友好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种索马鲁肽的合成方法，包括如下步骤：
a)合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、His侧链上、Glu侧链上、Thr侧链上、Ser侧链上、Asp侧链上、Tyr侧链上、Gln侧链上偶联有保护基的片段I；
b)合成侧链单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-OH；
c)在固相载体上，按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序逐一偶联保护氨基酸，再偶联步骤b)合成的侧链单体，获得肽树脂，裂解获得片段II；
d)将片段I和片段II按照索马鲁肽的氨基酸顺序缩合，获得索马鲁肽。
一些实施方案中，步骤a)具体为：
在固相载体上按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，逐一偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc--Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，经裂解、纯化，获得片段I。
一些实施方案中，步骤a)：
所述固相载体为2-CTC Resin树脂，Fmoc-Ala-2CTC替代度为0.2-0.6mmol/g。
所述偶联的偶联剂为DIC/HOBt，偶联时间为1-3小时.
所述裂解的裂解液由体积比为1:99～5:95的TFA和DCM组成，或
由体积比为1:3～1:4的TFE和DCM组成；
所述裂解的温度为室温，时间为2小时；
所述纯化为：将裂解后的片段I的粗品浓缩至干，加入乙酸乙酯溶解，采用饱和氯化钠水溶液、柠檬酸水溶液洗涤，收集有机相，浓缩。
一些实施方案中，步骤b)具体包括：
b1)将Fmoc-Lys-OH与Boc-AEEA-OSu混合，加入DIPEA，室温反应2小时，浓缩，加入HCl/EA饱和液，脱除Boc保护基，浓缩至干；重复以上步骤，偶联第二个Boc-AEEA-OSu，将偶联产物精制后获得产物1：Fmoc-Lys(AEEA-AEEA)-OH；
所述精制为：将偶联产物加入乙酸乙酯溶解，滴加石油醚，析出沉淀，过滤；
b2)取十八烷酸叔丁基单酯，加入THF、Boc酸酐和无水吡啶，室温反应0.5小时，然后加入NH2-Glu(OtBu)-OH，搅拌反应2小时，加入乙醚，析出固体，得到产物2：γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic Acid；
b3)在DCC和DCM的作用下，将产物1和产物2产物缩合反应2小时，得到侧链单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-OH。
一些实施方案中，步骤c)具体为：
在固相载体上按照SEQ ID NO:2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，逐一偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH之后，再偶联侧链单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-OH，经裂解、纯化，获得片段II。
一些实施方案中，步骤c)中，
所述偶联反应的溶剂为二氯甲烷和/或DMF；所述偶联的偶联剂为DIPCDI和缩合剂A的组合，或DIPEA和缩合剂B的组合，其中，缩合剂A为HOBt或HOAt，缩合剂B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU；所述裂解的裂解液由摩尔比为1.2:1.1的TFA、TIS和DCM组成；
一些实施方案中，步骤c)中，
所述裂解的温度为室温，时间为3小时；所述纯化为将裂解后的片段II正己烷，打浆，搅拌，抽滤，减压干燥。
一些实施方案中，步骤d)中，所述缩合反应在DMF中进行；所述缩合的缩合剂包括HOSu和DIC，所述缩合的温度为室温，时间为2小时；所述缩合反应结束后还包括过滤、收集滤液的步骤。
本发明首先固相合成片段I(第1～19位)，液相合成侧链单体(第20位氨基酸及其侧链)，然后固相合成偶联侧链单体和其余氨基酸的片段II(第21～31位)，最后将片段I和片段II缩合，精制，获得索马鲁肽。本发明采用特殊的合成策略，明显提高了索马鲁肽的纯度和收率。本发明至少具有如下有益效果之一：
(1)本发明明显提高了索马鲁肽的纯度和收率，有利于规模化生产；
(2)本发明完全避免使用四三苯基膦钯等贵有金属，解决了三废处理中对钯残留的难题，成本降低，安全环保，工艺更加简单；
(3)本发明合成策略能够明显降低位阻，提高了反应收率。
附图说明
图1示质谱MS图；
图2示质谱MS图；
图3示粗肽HPLC(70.57％)；
图4示粗肽HPLC(71.92％)；
图5示精肽HPLC(99.88％)；
图6示精肽HPLC(99.95％)。
具体实施方式
本发明提供了一种索马鲁肽的合成方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
表1
本发明索马鲁肽的合成路线包括：
(1)合成片段I：
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(Boc)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH
(2)合成片段II
液相合成侧链
(3)固相合成片段II
(4)将片段I和片段II缩合，合成索马鲁肽
本发明索马鲁肽的合成方法，包括以下步骤：
a)合成片段I：
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(Boc)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH；
b)侧链单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid)-OH的液相合成，具体结构如下：
c)合成片段II：
NH2-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OH.
d)片段Ⅰ与片段Ⅱ在液相中缩合成、脱保护，最终得到索玛鲁肽粗肽；粗肽经高效液相方法纯化制备得到索玛鲁肽。
所述步骤a)中，载体树脂为2-CTC Resin树脂，Fmoc-Ala-2CTC替代度选用0.2-0.6mmol/g，优选为0.3-0.5mmol/g；。
所述步骤a)中，优选为DIC/HOBt作为偶联试剂，依次偶联下列氨基酸原料：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc--Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH，偶联时间为1-3小时，优选2小时。
所述步骤a)中，所述裂解采用的裂解试剂为TFA:DCM＝1:99～5:95,或TFE：DCM＝1:3～1:4，优选TFE：DCM＝1:3(体积比)；室温，裂解2小时，然后浓缩至干，加入乙酸乙酯溶解，采用饱和氯化钠水溶液、柠檬酸水溶液洗涤3次，收集有机相，浓缩，得到片段I。
步骤b)侧链单体合成步骤具体为：
①起始原料采用Fmoc-Lys-OH与Boc-AEEA-OSu或Boc-AEEA-ONb,优选Boc-AEEA-OSu；碱类选DEA、DIPEA、吡啶等，优选DIPEA，溶剂为THF、DCM、DMF，优选DCM。溶解下室温反应2小时；其中Boc-AEEA-OSu,是采用BocAEEA-OH与HOSu在DCC条件下缩合而成。该步骤精制方法为：浓缩后，加入乙酸乙酯：石油醚＝1：3重结晶。②采用HCl/EA饱和液脱除Boc基，2小时，10ml/g用量。反应毕，浓缩至干即可。③重复①，偶联第二个Boc-AEEA-OSu，再重复②得到化合物Fmoc-Lys(AEEA-AEEA)-OH；④十八烷酸叔丁基单酯为原料，加入THF，Boc酸酐，无水吡啶，室温反应0.5小时，然后加入NH2-Glu(OtBu)-OH，搅拌反应2小时，加入乙醚，析出固体，得到γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic Acid；⑤将③的产物和④的产物在DCC和DCM条件下，缩合反应2小时，得到侧链单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-OH。
步骤c)片段II的合成：
NH2-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OH。
所述步骤c)中树脂采用2CTCResin树脂，按照经典Fmoc策略偶联方法，依次偶联的氨基酸依次为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-OH。
所述步骤c)中，所述偶联反应的溶剂为二氯甲烷和/DMF，优选为DMF；Fmoc脱除溶剂为20％哌啶DMF溶液，最后用甲醇收缩树脂。
所述步骤c)中，所述偶联的偶联剂为DIPCDI和缩合剂A的组合，或DIPEA和缩合剂B的组合，其中，缩合剂A为HOBt或HOAt，缩合剂B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU。进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A＝1.2:1.1，DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0，Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-OH采用HOAt/DIC体系，其他采用HOBt/DIC体系，优选反应倍数为氨基酸的1.2倍当量。所述步骤3)中裂解，所用脱保护试剂为TFA：TIS：DCM＝2：3：95(V：V)的混合液；或者TFE:DCM＝1：3(V:V)～1：4(V:V),优选TFE:DCM＝1：3(V:V)。
所述步骤c)中所述粗品纯化方法是：抽滤后，滤液浓缩，加入乙酸乙酯溶解，用5％柠檬酸水溶液、饱和氯化钠水溶液各洗涤3次，收集有机层，浓缩。
本发明提供的合成方法中，步骤a)～c)在偶联氨基酸时，由于每个氨基酸都有保护基，需要脱除N端保护基再进行偶联，本发明脱除N端Fmoc保护基所采用的脱除剂优选哌啶溶液，更优选20％哌啶DMF溶液，包括但不仅限于此。
一些具体实施例中，步骤d)具体为：
在将段I溶解在DCM溶液中，加入HONb、DIC搅拌反应2小时，反应完成后，加入5％柠檬酸水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤2次，收集有机层，无水硫化钠干燥，再加入片段II的DCM溶液，搅拌澄清，加入DIPEA，搅拌反应2小时。反应毕浓缩，加入5mL/g用量的裂解液，裂解，乙醚沉淀得到粗肽。
所述步骤d)中的裂解液为TFA、TIS、H2O、PhOMe、的组合物；优选比例为TFA:：TIS：H2O:PhOMe＝85:5:5:5(V:V)。裂解液用量可以是4mL/g-10mL/g，优选5ml/g，反应2-3小时，优选2小时。
所述步骤d)中，反应溶剂可以是DCM、DMF、THF等有机溶剂，优选DCM。
所述步骤d)中，所述偶联试剂可以是HOSu、HONb等同类型化合物，优选HONb。
所述步骤d)中沉淀溶剂：乙醚、甲叔醚及同类溶剂，优选乙醚。
精肽制备：纯化采用反相高效液相色谱法制备，冻干法冻干所得。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1片段I合成
选用替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Ala-CTC Resin氨基酸树脂10g，加入到反应柱中，加入DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，抽干，加入20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc，两次(5分钟+7分钟)，脱除后，DMF洗涤5次，称取Fmoc-Ala-OH(1.868g，6mmol)、HOBt(0.973g，7.2mmol)、加入反应柱中，DMF溶解，再加入DIC(1.22mL,7.8mmol)，室温反应1小时，茚三酮检测反应完全，抽滤，适量DMF洗涤5次，继续重复以上操作，进行Fmoc-Gln(Trt)-OH(3.664g，6mmol)、Fmoc-Gly-OH(1.784g，6mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(2.553g，6mmol)、Fmoc-Leu-OH(2.120g，6mmol)、Fmoc-Tyr(Boc)-OH(2.757g，6mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(2.301g，6mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(2.301g，6mmol)、Fmoc-Val-OH(2.036g,6mmol)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(2.469g，6mmol)、Fmoc--Ser(tBu)-OH(2.301g，6mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(2.385g，6mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH(3.162g，6mmol)、Fmoc-Gly-OH(1.784g，6mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(2.553g，6mmol)、Boc-His(Trt)-Aib-OH(3.496g，6mmol)，其中Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH偶联时间为2小时，其他氨基酸均为1小时。最后得到肽树脂
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(Boc)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-2CTCResin
裂解步骤：采用的裂解试剂为TFE：DCM＝1:3～1:4，优选TFE：DCM＝1:3(体积比)；室温，裂解2小时，然后浓缩至干，加入乙酸乙酯溶解，采用饱和氯化钠水溶液、柠檬酸水溶液洗涤3次，收集有机相，浓缩，得到化合物I(片段I)
实施例2片段I合成
选用替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Ala-CTC Resin氨基酸树脂10g，加入到反应柱中，加入DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，抽干，加入20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc，两次(5分钟+7分钟)，脱除后，DMF洗涤5次，称取Fmoc-Ala-OH(1.868g，6mmol)、HOBt(0.973g，7.2mmol)、加入反应柱中，DMF溶解，再加入DIC(1.22mL,7.8mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测反应完全，抽滤，适量DMF洗涤5次，继续重复以上操作，进行Fmoc-Gln(Trt)-OH(3.664g，6mmol)、Fmoc-Gly-OH(1.784g，6mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(2.553g，6mmol)、Fmoc-Leu-OH(2.120g，6mmol)、Fmoc-Tyr(Boc)-OH(2.757g，6mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(2.301g，6mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(2.301g，6mmol)、Fmoc-Val-OH(2.036g,6mmol)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(2.469g，6mmol)、Fmoc--Ser(tBu)-OH(2.301g，6mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(2.385g，6mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-OH(3.162g，6mmol)、Fmoc-Gly-OH(1.784g，6mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(2.553g，6mmol)、Boc-His(Trt)-Aib-OH(3.496g，6mmol)，最后肽树脂收缩，得到肽树脂：
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(Boc)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-2CTCResin
裂解步骤：采用的裂解试剂为TFA：DCM＝0.5:95室温，裂解2小时，然后加入0.1M氢氧化钠调pH至6-7之间，浓缩DCM后，加入适量水，析出固体，过滤，得到固体，减压干燥，得到化合物I(片段I)：
Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(Boc)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-OH
实施例3片段II的侧链合成
称取Fmoc-Lys-OH(36.8g，100mmol)、Boc-AEEA-OSu(37.8,105mmol)溶解在500mLTHF中，加入DIPEA(34.86ml,200mml)，室温反应2小时；TLC监控反应完全，浓缩，在油状物固体中，加入500ml的HCl/EA饱和液(脱除Boc基，10ml/g)，2小时；反应毕，浓缩至干即可。重复，偶联第二个Boc-AEEA-OSu，得到化合物Fmoc-Lys(AEEA-AEEA)-OH；加入100乙酸乙酯溶解，滴加300mL石油醚，析出沉淀，过滤，得到固体备用；
称取十八烷酸叔丁基单酯46g，加入干燥处理的500mLTHF中溶解，再加入Boc酸酐，无水吡啶，室温反应0.5小时，然后加入NH2-Glu(OtBu)-OH，搅拌反应2小时，加入乙醚，析出固体，得到γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic Acid；
第一步的油状物溶解在DMF中，加入γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic Acid的DMF溶液，搅拌溶解，加入DCC，室温搅拌反应2小时，得到侧链单体Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-OH。
实施例4片段II合成
NH2-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OH。
称取替代度0.45mmol/g Fmoc-Gly-2CTCResin氨基酸树脂10g，加入到反应柱中，加入DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，抽干，加入20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc，两次(5分钟+7分钟)，脱除后，DMF洗涤5次，称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(5.839g，9mmol)、HOBt(1.459g，10.8mmol)、加入反应柱中，DMF溶解，再加入DIC(1.83mL,11.7mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测反应完全，抽滤，适量DMF洗涤5次，继续重复以上操作，进行Fmoc-Gly-OH(2.676g，9mmol)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(5.839g，9mmol)、Fmoc-Vla-OH(3.055g，9mmol)、Fmoc-Leu-OH(3.181g，9mmol)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(4.739g，9mmol)、Fmoc-Ala-OH(2.802g，9mmol)、Fmoc-Iie-OH(3.181g，9mmol)、Fmoc-Phe-OH(3.487g,9mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3.830g，9mmol),偶联毕，脱除Fmoc后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，再加入Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-OH的DMF溶液，HOAt(1.461g，10.8mmol)，DIC(1.83mL,11.7mmol)，反应3小时，茚三酮检测透明后，20％哌啶脱除Fmoc(5分钟，7分钟，两次)，DMF和DCM各洗涤5次，甲醇收缩，得到肽树脂：NH2-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-2CTCResin。
裂解步骤：采用的裂解试剂为TFE：DCM＝1:3室温，裂解3小时，浓缩，得到固体，加入正己烷，打浆，搅拌，抽滤。减压干燥。得到片段II：NH2-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OH
实施例5粗肽合成
分别将实施例1的片段I溶解在DMF中，加入HOSu,DIC，室温反应2小时，HPLC监控反应，待反应完全后，过滤，滤液待用。
将实施例4的片段II溶解在DMF溶液中，在加入3倍当量的DIPEA，溶解。
缩合：将片段I的滤液，滴加到片段II的溶液中，搅拌，缩合反应，HPLC监控反应，待反应毕，过滤，滤液通过制备色谱，乙腈溶剂替换掉DMF，收集全保护索马鲁肽乙腈液。浓缩干，得到索马鲁肽粗品。
裂解：全保护索马鲁肽68g溶解在420ml冷冻的裂解液中(TFA：H2O:PhOH：EDT＝87:.5:5:5：2.5)中，搅拌反应2.5小时，裂解液用4.2L甲基叔丁基醚沉淀，得到粗肽。色谱图见图3，粗肽纯度为70.57％。。
实施例6粗肽合成
将实施例2的片段I溶解在DMF中，加入HOSu,DIC，室温反应2小时，HPLC监控反应，待反应完全后，过滤，滤液待用。
将实施例4的片段II溶解在DMF溶液中，在加入3倍当量的DIPEA，溶解。
缩合：将片段I的滤液，滴加到片段II的溶液中，搅拌，缩合反应，HPLC监控反应，待反应毕，过滤，滤液通过制备色谱，乙腈溶剂替换掉DMF，收集全保护索马鲁肽乙腈液。浓缩干，得到索马鲁肽粗品。
裂解：全保护索马鲁肽68g溶解在420ml冷冻的裂解液中(TFA：H2O:PhOH：EDT＝87:.5:5:5：2.5)中，搅拌反应2.5小时，裂解液用4.2L甲基叔丁基醚沉淀，得到粗肽。色谱图见图4，粗肽纯度为71.92％。
实施例7粗肽纯化
取实施例5的粗肽，经反相高效液相色谱纯化，获得精肽，色谱图见图5(99.88％)。
实施例8粗肽纯化
取实施例6的粗肽，经反相高效液相色谱纯化，获得精肽，色谱图见图6(99.95％)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳翰宇药业股份有限公司
<120> 一种索马鲁肽的合成方法
<130> S21P001863
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> xaa= Aib
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)..(2)
<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 1
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
1 5 10
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