具体实施方式

令人惊讶地发现，通过引入新型单分散超顺磁性微珠可以全部或部分地解决上述问题。这些单分散超顺磁性微珠在整个微珠的核心和壳体中均分布有超顺磁性纳米粒子。令人惊讶地发现，这些微珠可以在很大的重量百分比范围内(例如，微珠总重量的30重量％至超过50重量％)负载Fe₃O₄纳米粒子，而不会遇到上述问题。相信这些微珠将会提高下游分离过程的效率并改善在IVD过程中的最终应用。

因此，本文公开了具有核壳结构的单分散超顺磁性微珠，该微珠包括：

核心部分，其由聚苯乙烯聚合物基体材料形成，其中，该聚苯乙烯聚合物基体材料包封第一批超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子；

第一壳体部分，其直接位于核心部分的外部并且由交联共聚物基体材料形成，交联共聚物基体材料由苯乙烯单体、交联单体和具有官能团的第一官能性单体形成，其中，交联共聚物基体材料包封第二批超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子；和

第二壳体部分，其直接位于第一壳体部分的外部，第二壳体部分形成为第一层、第二层和第三层，第一层包括超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子和第一层聚合物基体材料，第一层聚合物基体材料包括共轭单体和本体单体；

第二层延伸超过第一层，第二层由包括本体单体的第二层聚合物材料形成；并且

第三层位于第二层外部，第三层由包括本体单体和具有官能团的第二官能单体的第三层聚合物材料形成：

第一层中的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子直接结合到第一壳体部分的外表面上存在的官能团；第一层聚合物基体材料围绕第一层中的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子；并且

第二层聚合物基体材料从第一层聚合物基体材料延伸并形成每个单分散超顺磁性微珠的外表面。

在本文中，“包括”一词可以解释为需要所提到的特征，但不会限制其他特征的存在。另选地，“包括”一词也可以涉及仅存在所列出的组件/特征的情况(例如，“包括”一词可以由短语“由……组成”或“基本上由……组成”代替)。可以明确预期到，可以将更宽和更窄的解释都应用于本发明的所有方面和实施例。换言之，“包括”一词及其同义词可以由短语“由……组成”或短语“基本上由……组成”或其同义词代替，反之亦然。

当在本文中使用时，术语“粒子”旨在与术语“微珠”和“微球”同义。当在本文中使用时，术语“聚合物粒子”旨在与术语“聚合物微珠”和“聚合物微球”同义。当在本文中使用时，术语“超顺磁性聚合物粒子”旨在与术语“超顺磁性聚合物微珠”和“超顺磁性聚合物微球”同义。

当在本文中使用时，术语“单分散”是指粒子的特定参数(例如，粒径)的变异系数(CV)低，例如，CV小于20％，诸如小于15％，诸如小于10％，诸如小于5％。更特别地，粒子的CV可以小于或等于2％，诸如小于或等于1％。术语“单分散”还涵盖了术语“高度单分散”。当在本文中使用时，“单分散”是指CV可以小于5％，诸如小于或等于2％，诸如小于或等于1％。

当在本文中使用时，术语“变异系数”是指其统计含义。也即是：

术语“标准偏差”和“平均值”采用其一般统计含义。

本说明书中提及的“平均”直径是指通过扫描电子显微镜(SEM)获得的平均直径。

本文所指的磁性纳米粒子可以包括超顺磁性纳米粒子、超顺磁性纳米粒子、铁磁性纳米粒子或亚铁磁性纳米粒子中的至少一种。定义在下面列出。

当在本文中使用时，“磁性”是指某种材料中一种响应于磁场的特性。当在本文中使用时，“顺磁性”是指在去除外部磁场后，材料所展现的磁性被切断。当在本文中使用时，“超顺磁性”是指在去除外部磁场后，材料的磁性被立即切断。

当在本文中使用时，“铁磁性”是指每个域内的所有磁性原子对材料的整体净磁化强度的贡献值为正，该材料在去除外部磁场后仍保持磁性特性。所述材料在其居里温度以上时变成顺磁性材料。

当在本文中使用时，“亚铁磁性”是指每个域内的一些磁性原子是相反的，但是材料总体上表现出净磁化强度。在去除外部磁场之后，所述材料仍保持其磁性特性。所述材料在其居里温度以上时变成顺磁性材料。

图2D以动画的形式示出了根据本发明的完全形成的单分散超顺磁性微珠。图12更详细地示出了完全形成的单分散超顺磁性微珠。图12示出了根据本发明的单分散超顺磁性微珠100的截面图。该微珠具有核心110，第一壳体120和第二壳体130。核心110由聚苯乙烯聚合物基体材料111形成，其中，聚合物基体材料核心含有孔112，该孔112包封一部分超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子115。

第一壳体部分120可以是单层(未示出)或两层(121、122)的形式。当为单层形式时，第一壳体部分具有由苯乙烯单体、交联单体和具有官能团的第一官能单体形成的交联共聚物基体材料。当为两层形式时，第一层可以是由苯乙烯单体和交联单体的共聚物形成的交联共聚物基体材料123，第二层124是由苯乙烯单体、交联单体和官能单体的共聚物形成。再有，第一壳体部分中的一种或多种聚合物基体材料可以包封Fe₃O₄纳米粒子125。

第二壳体部分130由三层(131、132、133)形成。第一层含有Fe₃O₄纳米粒子134，该Fe₃O₄纳米粒子134与设置在第一壳体部分120表面上的官能团结合。另外，第一层还含有第一层聚合物基体材料135，该聚合物基体材料135包括共轭单体和本体单体。因此，第一层聚合物基体材料从第一壳体部分的表面延伸到Fe₃O₄纳米粒子134的外部附近。第二层132延伸超过第一层(并因此延伸超过Fe₃O₄纳米粒子134的外部)，并且该层由包括本体单体的第二层聚合物材料形成。第三层133形成在第二层外部，该第三层133由包括本体单体和具有官能团的第二官能单体的第三层聚合物材料形成。

当在本文中使用时，“包封”可以指一种材料完全包封在另一种材料内，或者也可以指一种材料部分包封在另一种材料内。该术语还指一种材料被捕获在另一种材料的孔隙中的情况。

应当注意，第二壳体部分中的第二层和第三层聚合物基体材料用于在将微珠放入溶剂中时，放置超顺磁磁性(Fe₃O₄)纳米粒子发生浸出。这种情况是可能的，因为如下所述，第二壳体部分的聚合物部分是在初生微珠的第一壳体(和核心)的表面负载Fe₃O₄纳米粒子后形成的。这使所形成的聚合物壳体充当屏障，以防止Fe₃O₄纳米粒子发生泄漏。

在第一壳体部分中和第二壳体部分的第三层中使用的官能单体上可以存在任何合适的官能团。如将理解的，在第一壳体部分上和第二壳体部分的第三层上的官能团的所需官能是不同的。第一壳体部分(的表面)上的官能团用于和Fe₃O₄纳米粒子结合，使得Fe₃O₄纳米粒子结合到第一壳体部分的表面。这种结合可以通过任何合适的化学相互作用完成，诸如，通过配位、共价键结、静电力或氢键结合。第二壳体部分的第三层中的官能团用于使完全形成的微珠能够轻松地进行官能化，以用于任何合适的预期应用(例如，将配体或抗体共价结合到完全形成的微珠的表面)。不过，第一壳体部分中和第二壳体部分的第三层中的官能单体上的官能团可以单独选自氨基、羧基、环氧基和羟基中的一种或多种。例如，第一壳体部分中和第二壳体部分的第二层中的官能单体上的官能团可以单独选自羟基基团和羧基基团的组合、或氨基基团和羧基基团的组合。

如上文所定义的，本发明的微珠为单分散微珠。更特别地，本文所公开的微珠的基于其直径的变异系数可以小于15％，诸如小于10％，诸如小于5％。然而更特别地，本文所公开的微珠可以是如上文所定义的高度单分散的微珠。例如，该微珠基于其直径的变异系数可以小于或等于2％。

本文所公开的微珠可以具有使其有效用于预期应用(例如，IVD)的任何合适的平均直径。例如，适当的平均直径为0.2-5.0μm，诸如0.5-4.0μm。

如上所指出的，核心由聚苯乙烯基体材料形成。这可以由任何合适的苯乙烯单体的均聚物或两种或更多种(例如，2、3、4、5或6种)苯乙烯单体的共聚物形成。如将理解的，当在本文中使用时，术语“苯乙烯单体”应被解释为涵盖一般种类的苯乙烯单体，即，苯乙烯本身及其单体衍生物。可以用于形成聚苯乙烯聚合物基体材料的合适的苯乙烯单体的示例包括但不限于：苯乙烯、苯乙烯衍生物及其共聚物。在本文中可能提及的特定实施方案中，苯乙烯衍生物可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：4-甲基苯乙烯，3-甲基苯乙烯和4-叔丁基苯乙烯。聚苯乙烯基体材料核心可以是未交联的材料。

如上所述，令人惊讶地发现，本文所公开的微珠对超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的负载值范围较宽，而不会发生常规设计遇到的问题。例如，微珠中的所有超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子占每个微珠的总重量可以为10-80重量％，诸如20-70重量％，诸如30-50重量％。在本文中可能提及的特定实施方案中，微珠中的所有超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子可以占每个微珠的总重量的30-50重量％。如将理解的，超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子在微珠的每个部分中的分布量是变化的。例如，可以应用以下一种或多种负载分布：

(a)第一批超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子可以占每个微珠的总重量的0.1-5重量％；

(b)第二批超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子可以占每个微珠的总重量的0.5-10重量％；并且

(c)第二壳体部分的第一层中的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子可以占每个微珠的总重量的9.4-79.4重量％，诸如19.4-69.4重量％，诸如29.4-49.4重量％。

如前文所述，使用交联单体在第一壳体部分中形成交联共聚物基体材料。据信，在微珠中引入交联可为其提供刚度和/或机械强度，以及对可能以其他方式由溶剂引起的溶胀的抗性。可以使用任何合适的交联单体在微珠的第一壳体部分中形成交联。合适的交联单体可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：二乙烯基苯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，双酚A二甲基丙烯酸酯，丁二醇二甲基丙烯酸酯，三环癸烷二甲醇二丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，三丙二醇二丙烯酸酯，丙氧基化新戊基二丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，二三羟甲基丙烷四丙烯酸酯，二季戊四醇五丙烯酸酯，二季戊四醇五/六丙烯酸酯，三丙烯二丙烯酸酯，三羟甲基丙烷乙氧基化三丙烯酸酯，三羟甲基丙烷丙氧基化三丙烯酸酯，二三羟甲基丙烷四丙烯酸酯，丙三醇丙氧基化三丙烯酸酯，季戊四醇丙氧基化三丙烯酸酯，聚(乙二醇)二丙烯酸酯，聚(丙二醇)二丙烯酸酯，和三(丙二醇)二丙烯酸酯。在本文可能提及的本发明的特定实施方案中，交联单体可以选自由以下各项组成的组中一种或多种：二乙烯基苯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，双酚A二甲基丙烯酸酯和N,N-亚甲基双(丙烯酰胺)。

根据以上讨论的官能团，交联共聚物基体材料中第一官能单体选自由以下各项组成的组中的一种或多种：丙烯酸，甲基丙烯酸，2-羧乙基丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，烯丙胺，(羟乙基)甲基丙烯酸酯，羟丙基甲基丙烯酸酯，4-羟丁酯丙烯酸酯，缩水甘油基甲基丙烯酸酯，烯丙基缩水甘油醚，1,2-环氧基-5-己烯，马来酸酐，2-羟乙基甲基丙烯酸酯，2-羧乙基丙烯酸酯低聚物。如将理解的，要获得以上讨论的官能团的特定组合，可以从这些单体中进行选择。

第一壳体部分中的交联共聚物基体材料也通过使用苯乙烯单体形成。如前所述，苯乙烯单体可以选自由以下各项组成的组中一种或多种：苯乙烯和苯乙烯衍生物。如前所述，苯乙烯衍生物可以选自由以下各项组成的组中一种或多种：4-甲基苯乙烯，3-甲基苯乙烯和4-叔丁基苯乙烯。

如上所述，第一壳体部分可以由两层材料形成，而不是由单层材料形成。也即是，可以存在第一层的第一聚合物基体组合物和第二层的第二聚合物基体组合物。在具有两层的实施方案中：

第一层可以由苯乙烯单体、交联单体的共聚物形成；并且

第二层可以由苯乙烯单体、交联单体和官能单体的共聚物形成。

苯乙烯单体、交联单体和官能单体如上所述。将理解的是，两层之间的实际界限可能并不完全清楚。这是因为制造方法可能涉及添加苯乙烯单体和交联单体的共聚物以形成第一层，然后在随后的阶段添加官能单体以形成第二层。如此，第一层的一部分也可以含有官能单体。为免生疑问，第二层旨在形成第一壳体部分的外表面，因此希望提供能够与超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子和/或共轭单体(后者使得能够形成第二壳体部分的聚合物部分)结合的官能团。有关第一壳体部分的更多制造细节，将在下面和实验部分中提供。

如上所述，本文描述的微珠包含超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子。这些超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子可以具有任何合适的直径，以使其处于“纳米粒子”的常规定义范围内。然而，在本文中可能提及的本发明的特定实施方案中，超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子可以具有5-15nm的平均直径。

在本文所提及的本发明实施例中，核心部分和第一壳体部分中的苯乙烯基团与交联基团的重量比可以为20:1至1:2，诸如10:1至1:1。在本文可能提及的另外或备选的实施例中，核心部分和第一壳体部分中的苯乙烯基团与官能团的重量比可以为20:1至1:2，诸如10:1至1:1。引述核心部分和第一壳体部分旨在表示在确定所提及的组分的总体负载时，应考虑这些组分中的组合重量。例如，尽管核心部分不含有交联基团或官能团，但在确定核心部分和第一壳体部分中这些组分与苯乙烯基团总重量的相对重量比时，应将其苯乙烯基团的重量考虑在内。

在本文中可能提及的本发明的某些实施方案中，Fe₃O₄纳米粒子还包含一部分Co₃O₄和/或Mn₃O₄纳米粒子。除了Fe₃O₄纳米粒子之外，可以存在任何合适量的Co₃O₄和/或Mn₃O₄纳米粒子。为免生疑问，当本文提供Fe₃O₄纳米粒子与微珠重量相比的重量百分比时，Fe₃O₄纳米粒子的重量包含存在的任何Co₃O₄和/或Mn₃O₄纳米粒子的重量。

如上所述，第二壳体部分由三个单独的材料层形成。第一层由Fe3O4纳米粒子部分形成，这些纳米粒子直接结合到第一壳体部分的外表面上存在的官能团。第一层还含有第一层聚合物基体材料，该聚合物基体材料包括共轭单体和本体单体。共轭单体是一种在第一壳体部分的表面上用作的锚定点的化合物。如此，共轭单体本身含有可以与第一壳体部分的表面上的官能团反应的官能团，以及可以用于聚合反应的官能团。本文可以使用任何合适的共轭单体。合适的共轭单体的示例包括但不限于：甲基丙烯酰氯，3-乙氧基-丙烯酰氯，丙烯酰氯，4-戊烯酰氯，甲基丙烯酸酐，4-戊烯酸酐，巴豆酸酐，戊酸酯，10-十一烯酰氯，缩水甘油甲基丙烯酸酯，缩水甘油，烯丙基缩水甘油醚及其组合。

形成第二壳体部分的第一层和第二层的一部分的本体单体可以选自聚醚单体、聚酯单体、聚丙烯酰胺单体和多元酸单体中的一种或多种。合适的本体单体的示例包括但不限于：甲基丙烯酸甲酯，丙烯酸，甲基丙烯酸，2-羧乙基丙烯酸酯，2-羧乙基丙烯酸酯低聚物，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，烯丙胺，(羟乙基)甲基丙烯酸酯，羟丙基甲基丙烯酸酯，4-羟丁酯丙烯酸酯，缩水甘油甲基丙烯酸酯，烯丙基缩水甘油醚，1,2-环氧基-5-己烯，马来酸酐及其组合。在本文中可能提及的特定实施方案中，本体单体可以选自甲基丙烯酸和/或2-羟乙酯甲基丙烯酸酯。

如前文所述，第二壳体部分的第三层可以由第二官能单体形成。该第二官能单体上的官能团可以如前文所述。合适的官能单体的示例包括但不限于以下各项中的一种或多种：丙烯酸，甲基丙烯酸，2-羧乙基丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，烯丙胺，(羟乙基)甲基丙烯酸酯，羟丙基甲基丙烯酸酯，4-羟丁酯丙烯酸酯，缩水甘油甲基丙烯酸酯，烯丙基缩水甘油醚，1,2-环氧基-5-己烯，马来酸酐，2-羟乙基甲基丙烯酸酯和2-羧乙基丙烯酸酯低聚物。

在第二壳体部分中使用的聚合物材料也可以是交联材料。例如，第一层可以是交联材料，第二层可以是交联材料，第三层可以是交联材料或其任意组合。在本文可能提及的实施方案中，第一层和第二层可以是交联材料，而第三层相对于其他层没有交联材料或交联材料较少。

交联单体用于在第二壳体部分中形成交联。该交联单体可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：二乙烯基苯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，双酚A二甲基丙烯酸酯，丁二醇二甲基丙烯酸酯，三环癸烷二甲醇二丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，三丙二醇二丙烯酸酯，丙氧基化新戊基二丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，二三羟甲基丙烷四丙烯酸酯，二季戊四醇五丙烯酸酯，二季戊四醇五/六丙烯酸酯，三丙烯二丙烯酸酯，三羟甲基丙烷乙氧基化三丙烯酸酯，三羟甲基丙烷丙氧基化三丙烯酸酯，二三羟甲基丙烷四丙烯酸酯，丙三醇丙氧基化三丙烯酸酯，季戊四醇丙氧基化三丙烯酸酯，聚(乙二醇)二丙烯酸酯，聚(丙二醇)二丙烯酸酯，和三(丙二醇)二丙烯酸酯；可选地，其中，所述交联单体选自由以下各项组成的组中的一种或多种：二乙烯基苯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，双酚A二甲基丙烯酸酯和N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)。

在本文可能公开的实施方案中，第二壳体的第二层和第三层的组合重量可以占每个微珠的总重量的1-30重量％，优选2-20重量％。

与本文所公开的微珠相关的优点包含但不一定限于以下各项：

·在这三种单体中，(a)苯乙烯提供成核模板，从而形成球形单分散微珠；(b)交联剂(诸如，DVB)实现交联作用，使微珠具有耐受有机溶剂的刚度；(c)官能单体促进超顺磁性纳米粒子(NP)的上载。

·所获得的三种单体(苯乙烯、交联剂、官能单体)的共聚物微珠为球形且高度单分散，微珠直径可以通过调节引发剂浓度、PVP浓度、单体负载量等聚合因素进行调整。

·可以在微珠(第一壳体表面和第二壳体表面上)中使用各种载有官能团的单体。这可以对微珠的表面性质进行微调，使其更易于在特定应用中使用。

·对于微珠表面上的官能团密度，可以通过调节官能单体(即，载有官能团的单体)的负载量进行微调。

·对于微珠上超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的高负载量(30-50重量％)，可以通过原位生成纳米粒子实现。

·由于在PS核心上接枝的官能团得到良好控制，因此可以对表面上形成的Fe₃O₄纳米粒子的大小进行很好地控制。

如将理解的，由于微珠的制造方法，存在与本文所述的微珠相关的结构优点和诸多优点。

在本发明中，单分散超顺磁性微珠通过4个步骤获得：

步骤1：经由“一锅三阶段”聚合流程，合成三种单体(苯乙烯、交联剂、官能单体)的高度单分散的共聚物微珠。

步骤2：用有机溶剂对所合成的共聚物微珠进行洗涤和表面改性。

步骤3：原位生成Fe₃O₄纳米粒子并上载到共聚物微珠上。

步骤4：在超顺磁性微珠上制备官能涂层。

发明人认为，以上列出的流程是用于生产单分散超顺磁性微珠的新过程，该过程与用于制作此类微珠的常规合成方法在根本上是不同的。该过程在图2中列出，其中图2A对应于步骤1后获得的产物，图2B对应于步骤2后获得的产物，图2C对应于步骤3后获得的产物，图2D对应于步骤4后获得的最终产物。在图2中，30表示孔，40表示Fe₃O₄纳米粒子，60表示第一壳体部分的聚合物部分，80表示第二壳体部分。

以下提供了每个步骤的更多细节。

步骤1：通过“一锅三阶段”的流程，使用三种单体(苯乙烯，交联剂和官能单体)合成高度单分散的共聚物微珠，该流程提供了核心和第一壳体聚合物材料(但不含Fe₃O₄纳米粒子)。该过程步骤的各个阶段总结如下：

(a)第一阶段是苯乙烯在溶剂(例如，含有1-20v％水的乙醇)中进行分散聚合。成核在该步骤中完成并且消耗大部分的苯乙烯(诸如，60-80重量％)，因此微珠数量在该阶段是固定的。溶剂可以是含有1-20v％水的醇的混合物。第一阶段总聚合时间为2-12小时，诸如4-10小时。

(b)第二阶段是添加交联剂进行交联，交联剂与其余苯乙烯单体发生交联共聚形成核壳结构(参见图2中的A)。交联剂相对于苯乙烯的重量百分比可以为1-40重量％，诸如5-30％。在该阶段，聚合时间可以为1-8小时，诸如2-6小时。

(c)在第三阶段中，添加官能单体以和剩余量的交联剂和苯乙烯发生共聚，从而将亲水性官能团引入到微珠表面。另外，在这一阶段可以一起添加一种以上的官能单体(诸如，两种或三种官能单体)，一次引入多种官能团。官能单体相对于苯乙烯的重量百分比可以为1-30重量％，诸如5-20重量％。在这一阶段，聚合时间可以为8-24小时，诸如10-20小时。

该“一锅三阶段”聚合步骤可以在任何合适的温度下进行，诸如40-80，诸如50-70。

步骤2：用有机溶剂彻底洗涤步骤1中所合成的共聚物微珠。洗涤的目的是从微珠中去除未反应的苯乙烯、交联剂和官能单体，以及稳定剂(当使用时)，诸如PVP。另外，用极性溶剂洗涤还可以从聚合物基体中去除一些线性聚苯乙烯，这可以使微珠松散并可以产生一些孔，使得能够将超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子负载到微珠的核心中或第一壳体内。微珠洗涤后可以重新分散到溶剂(例如水)中进行保存(参见图2中的B)。

在该洗涤步骤中，可以用水、甲醇、乙醇、异丙醇、THF和这些溶剂的混合物中的一种或多种洗涤微珠。可以将微珠浸泡在溶剂中数个小时，以去除一些线性聚苯乙烯，从而使微珠松散或在微珠内产生一些孔。在洗涤或浸泡过程中，可以进一步对微珠表面上的官能团进行改性，以促进超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的上载。将环氧基团引入到微珠表面时，在浸泡过程中，环氧基团可以进行开环水解、或开环氨解、或开环聚合，以进一步对微珠表面进行改性。这将取决于所用溶剂的性质，或者取决于添加到用于该洗涤步骤的所述溶剂中的任何试剂。

步骤3：将洗涤后的微珠以合适的摩尔比(例如，Fe³⁺:Fe²⁺的摩尔比为2:1)分散在含有Fe³⁺离子和Fe²⁺离子的溶液(例如,水溶液，诸如水和极性溶剂(例如THF)的混合物)中。然后，可以在搅拌下将溶液的温度升高(例如，升高至70)数个小时，以使两种离子与微珠表面上的官能团相互作用。一些Fe³⁺离子和Fe²⁺离子将渗透到微珠的聚合物基体中，而一些通过与所形成的微珠表面上的官能团(即，第一壳体表面)相互作用，将被吸附到微珠的表面上。然后，加入氨水，以将Fe³⁺离子和Fe²⁺离子原位转化为Fe₃O₄纳米粒子。在加入氨水之前，可以向溶液中添加用于稳定Fe₃O₄纳米粒子的配体(诸如，聚丙烯酸或酒石酸或柠檬酸)，以帮助形成超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子。通过离心分离所获得的超顺磁性聚合物微珠(参见图2中的C)，然后用水和甲醇洗涤，以去除任何松散的Fe₃O₄纳米粒子。

所添加的帮助稳定Fe₃O₄纳米粒子形成的配体可以是聚丙烯酸、酒石酸、柠檬酸或其混合物。

步骤4：通过在Fe₃O₄纳米粒子周围接枝聚合物网络，在超顺磁性聚合物微珠上制备涂层。为了实现聚合物接枝，使用一种或多种可以与第一壳体表面上的官能团反应的化合物。该材料为双官能材料，因为其具有可以与第一壳体表面上的官能团反应的第一官能团和可以参与聚合反应的第二官能团。该化合物一旦已经锚定在微珠表面上，然后就使用本体单体和可选的交联剂使其处于自由基聚合条件下。然后，随后，向聚合混合物中加入一种或多种具有用于下游处理的所需官能团或所需的最终官能团的单体，以提供第二壳体的最终部分。

在以上过程的步骤4中，超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子通过从步骤2的表面接枝的官能聚合物网络结合在一起。为了实现聚合物接枝，通过与步骤2中留在微珠表面上的官能团(例如，过量的羟基基团或胺基基团)反应，在表面上对单体进行改性。在该步骤中使用无水溶剂，该无水溶剂可以选自1,4-二恶烷、四氢呋喃、二甘醇二甲醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲乙酮中的一种或多种。可以在下文的该步骤中使用的具体溶剂可以是四氢呋喃和二甘醇二甲醚。反应时间可以是12-36小时，同时采用惰性气体吹扫。用有机溶剂对所得到的微珠进行洗涤，以去除过量的单体。

在需要时，可以在上述过程中使用引发剂。引发剂可以选自偶氮引发剂，诸如AIBN、AMBN。引发剂还可以选自过氧化物引发剂和过硫酸盐，包括叔戊基氢过氧化物、过硫酸钾、过硫酸钠和过硫酸氨。

交联剂相对于本体单体的重量百分比可以为5-70重量％，优选10-50重量％。在步骤4中，聚合时间可以为10-30小时，诸如16-24小时。在步骤4中，自由基聚合可以在40-80(诸如，50-70)的温度下进行。

因此，还公开了一种具有核壳结构的单分散超顺磁性微珠的制备方法，该方法包括：

(a)提供单分散超顺磁性前体微珠，其包括

核心部分，其由聚苯乙烯聚合物基体材料形成，其中，聚苯乙烯聚合物基体材料包封第一批超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子；

第一壳体部分，其直接位于核心部分的外部并且由交联共聚物基体材料形成，交联共聚物基体材料由苯乙烯单体、交联单体和具有官能团的第一官能单体形成，其中，共聚物基体材料包封第二批超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子；和

第二壳体部分，其直接位于第一壳体部分的外部，第二壳体部分包括超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子和聚合物前体锚定点，二者均结合到第一壳体部分的表面上的官能团上；以及

(B)通过一锅自由基聚合在单分散超顺磁性前体微珠上形成官能涂层，在该一锅自由基聚合中，

(i)在第一步中使用本体单体；并且

(ii)在第二步中，使用具有官能团的第二官能单体形成单分散超顺磁性微珠，其中

官能涂层借助于聚合物前体锚定点结合到第一壳体部分。

本体单体可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：聚醚单体，聚酯单体，聚丙烯酰胺单体和多元酸单体。例如，本体单体可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：甲基丙烯酸甲酯，丙烯酸，甲基丙烯酸，2-羧乙基丙烯酸酯，2-羧乙基丙烯酸酯低聚物，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，烯丙胺，(羟乙基)甲基丙烯酸酯，羟丙基甲基丙烯酸酯，4-羟丁酯丙烯酸酯，缩水甘油甲基丙烯酸酯，烯丙基缩水甘油醚，1,2-环氧基-5-己烯，马来酸酐；可选地，其中，本体单体选自甲基丙烯酸和/或2-羟乙基甲基丙烯酸酯。

直接在以上讨论的方法中，第一步可以使用包括本体单体和引发剂的混合物。在这种情况下，引发剂可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：叔戊基氢过氧化物，过硫酸钾，过硫酸钠，过硫酸氨，4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)，2,2’-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺，2,2’-偶氮双[N-(2-羧乙基)-2-甲基丙脒]水合物，2'-偶氮二(2-甲基丙脒)水合物，2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]，和2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐。该混合物还可以进一步包括：

(a)交联剂。例如，交联剂可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：二乙烯基苯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，双酚A二甲基丙烯酸酯，丁二醇二甲基丙烯酸酯，三环癸烷二甲醇二丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，三丙二醇二丙烯酸酯，丙氧基化新戊基二丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，二三羟甲基丙烷四丙烯酸酯，二季戊四醇五丙烯酸酯，二季戊四醇五/六丙烯酸酯，三丙烯二丙烯酸酯，三羟甲基丙烷乙氧基化三丙烯酸酯，三羟甲基丙烷丙氧基化三丙烯酸酯，二三羟甲基丙烷四丙烯酸酯，丙三醇丙氧基化三丙烯酸酯，季戊四醇丙氧基化三丙烯酸酯，聚(乙二醇)二丙烯酸酯，聚(丙二醇)二丙烯酸酯，和三(丙二醇)二丙烯酸酯；可选地，其中，交联单体选自由以下各项组成的组中的一种或多种：二乙烯基苯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，双酚A二甲基丙烯酸酯和N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)；和/或

(b)溶剂例如，溶剂可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：1，4-二恶烷，四氢呋喃，二甘醇二甲醚，乙酸乙酯，乙酸丁酯，丙酮，甲乙酮和水。

以上讨论的第二官能单体可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：丙烯酸，甲基丙烯酸，2-羧乙基丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，烯丙胺，(羟乙基)甲基丙烯酸酯，羟丙基甲基丙烯酸酯，4-羟丁基丙烯酸酯，缩水甘油甲基丙烯酸酯，烯丙基缩水甘油醚，1,2-环氧基-5-己烯，马来酸酐，2-羟乙基甲基丙烯酸酯，2-羧乙基丙烯酸酯低聚物。

在以上过程中：

(a)第一步和/或第二步的聚合可以是在30-80，诸如50-70的温度下进行的；和/或(b)第一步和第二步的总聚合时间可以为10-30小时，诸如16-24小时。

为了执行上述过程，需要提供单分散超顺磁性前体微珠。这些微珠可以通过以下过程形成：

(i)提供裸露的单分散超顺磁性微珠，其包括

核心部分，其由聚苯乙烯聚合物基体材料形成，其中，聚苯乙烯聚合物基体材料包封第一批超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子；

第一壳体部分，其直接位于核心部分的外部并且由交联共聚物基体材料形成，交联共聚物基体材料由苯乙烯单体、交联单体和具有官能团的第一官能单体形成，其中，共聚物基体材料包封第二批超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子；和

第二壳体部分，其直接位于第一壳体部分的外部，第二壳体部分包括超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子，超顺磁性Fe₃O₄结合到第一壳体部分的表面上的官能团上；以及

(ii)通过使裸露的单分散超顺磁性微珠与锚定材料反应，在第一壳体部分上形成聚合物前体锚定点，从而形成单分散超顺磁性前体微珠，锚定材料选自由以下各项组成的组中的一种或多种：甲基丙烯酰氯，3-乙氧基-丙烯酰氯，丙烯酰氯，4-戊烯酰氯，甲基丙烯酸酐，4-戊烯酸酸酐，巴豆酸酐，戊酸酐，10-十一碳烯酰氯，缩水甘油甲基丙烯酸酯，缩水甘油，和烯丙基缩水甘油醚。

裸露的单分散超顺磁性微珠可以通过以下过程形成：

(ai)提供单分散微珠，其包括

核心部分，其由聚苯乙烯聚合物基体材料形成；以及

第一壳体部分，其直接位于核心部分的外部并且由交联共聚物基体材料形成，交联共聚物基体材料由苯乙烯单体、交联单体和具有官能团的第一官能单体形成；以及

(aii)将单分散微珠放入包括Fe(III)盐和Fe(II)盐的溶液中，然后添加碱，形成裸露的单分散超顺磁性微珠。

直接在上述过程中：

(a)Fe(III)盐可以选自FeCl₃和/或Fe₂(SO₄)₃；和/或

(b)Fe(II)盐可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：FeCl₂，FeSO₄，Fe(OAC)₂；和/或

(c)碱可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：氢氧化氨，NaOH，KOH和胺；和/或

(d)溶液可以进一步包括CoCl₂和/或MnCl₂。

以上提及的单分散微珠可以通过“一锅三阶段”连续过程形成，该过程包括：

(a)在第一阶段中，使苯乙烯单体与引发剂和聚合物稳定剂在醇与水的混合物中进行分散聚合生成聚苯乙烯核心，从而形成成核的聚苯乙烯核心；

(b)在第二阶段中，将交联单体加入到包括成核的聚苯乙烯核心的混合物中；以及

(c)在第三阶段中，将第一官能单体加入到从第二阶段获得的材料中以提供单分散微珠，可选地，其中聚苯乙烯微珠原位产生，并且随后加入的交联剂和官能单体不会引起第二次成核，因此不会导致球形单分散共聚物微珠在表面上带有(苯乙烯/交联剂/官能单体)官能团。

直接在上述过程中：

(a)引发剂可以选自偶氮引发剂，可选地，其中，偶氮引发剂选自由以下各项组成的组中的一种或多种：2,2’-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN)和2,2’-偶氮双(2-甲基丁腈)(AMBN)；和/或

(B)聚合物稳定剂可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯亚胺(PEI)，聚丙烯酸(PAA)，聚乙烯醇(PVA)，羟丙基甲基纤维素(HPC)和壳聚糖；和/或

(c)苯乙烯单体可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：苯乙烯和苯乙烯衍生物；可选地，其中，苯乙烯衍生物选自由以下各项组成的组中的一种或多种：4-甲基苯乙烯，3-甲基苯乙烯和4-叔丁基苯乙烯；和/或

(d)醇可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：甲醇，乙醇，异丙醇，或其混合物；和/或

(e)醇与水的体积比可以为1:1至40:1，诸如2:1至20:1。

以上使用的交联单体可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：二乙烯基苯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，双酚A二甲基丙烯酸酯，丁二醇二甲基丙烯酸酯，三环癸烷二甲醇二丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，三丙二醇二丙烯酸酯，丙氧基化新戊基二丙烯酸酯，季戊四醇三丙烯酸酯，二三羟甲基丙烷四丙烯酸酯，二季戊四醇五丙烯酸酯，二季戊四醇五/六丙烯酸酯，三丙烯二丙烯酸酯，三羟甲基丙烷乙氧基化三丙烯酸酯，三羟甲基丙烷丙氧基化三丙烯酸酯，二三羟甲基丙烷四丙烯酸酯，丙三醇丙氧基化三丙烯酸酯，季戊四醇丙氧基化三丙烯酸酯，聚(乙二醇)二丙烯酸酯，聚(丙二醇)二丙烯酸酯，和三(丙二醇)二丙烯酸酯；可选地，其中，交联单体选自由以下各项组成的组中的一种或多种：二乙烯基苯，乙二醇二甲基丙烯酸酯，双酚A二甲基丙烯酸酯和N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)。

第一官能单体上的官能团可以单独选自氨基、羧基、环氧基和羟基中的一种或多种。例如，第一壳体部分中和第二壳体部分的第二层中的官能单体上的官能团可以单独选自羟基基团和羧基基团的组合、或氨基基团和羧基基团的组合。更具体地，第一官能单体可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：丙烯酸，甲基丙烯酸，2-羧乙基丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，烯丙胺，(羟乙基)甲基丙烯酸酯，羟丙基甲基丙烯酸酯，4-羟丁酯丙烯酸酯，缩水甘油基甲基丙烯酸酯，烯丙基缩水甘油醚，1,2-环氧基-5-己烯，马来酸酐，2-羟乙基甲基丙烯酸酯，2-羧乙基丙烯酸酯低聚物。

直接在以上过程中，苯乙烯单体与交联剂的重量比可以为20:1至1:2，诸如10:1至1:1。例如，苯乙烯单体与第一官能单体的重量比为20:1至1:2，优选10:1至1:1。

在使用单分散微珠之前，用一种或多种溶剂对其进行洗涤，然后用于后续过程步骤中。用于洗涤的溶剂可以选自由以下各项组成的组中的一种或多种：水，甲醇，乙醇，异丙醇和THF。

在上述过程中，所得到的单分散超顺磁性微珠可以具有：

(A)基于其直径的变异系数小于15％，诸如小于10％，诸如小于5％，诸如小于或等于2％；和/或

(B)平均直径为0.2-5.0μm，诸如0.5-4.0μm。

本发明涉及用于体外诊断(IVD)测定和其他应用的单分散超顺磁性微珠。这些单分散超顺磁性微珠具有聚苯乙烯核心，该核心由苯乙烯-交联剂-官能单体的交联层覆盖，并且进一步由超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子层覆盖，这些纳米粒子只有少部分分散在聚合物基体中。最后，在微珠表面上制备官能涂层，以结合并覆盖超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子，并为IVD测定提供官能团。

因此，将理解的是，本文所述的超顺磁性微珠可以用于IVD测定。

以下对本发明的优点进行描述。

·产生高度单分散的超顺磁性微珠。

·通过“一锅三阶段”聚合流程，生成由三种单体(苯乙烯、交联剂(例如，DVB)、官能单体)构成的高度单分散的共聚物微珠。现有技术流程需要进行多步合成过程，操作繁琐并且消耗更长的聚合时间，与其相比，本发明流程简单实用。

·在“一锅三阶段”聚合流程中，每种单体都起到一定的作用。

(a)苯乙烯提供成核模板，从而形成球形单分散微珠；

(b)交联剂(诸如DVB)提供交联作用，使微珠刚性更高并且耐受有机溶剂；以及(c)官能单体促进超顺磁性纳米粒子(NP)的上载。

·所获得的三种单体(苯乙烯、交联剂、官能单体)的共聚物微珠为球形且高度单分散，微珠直径可以通过调节引发剂浓度、PVP浓度、单体负载量等聚合因素进行调整。

·各种官能单体可以共聚到微珠中，以在微珠表面引入官能团。这些官能单体包含：2-羧乙基丙烯酸酯，丙烯酸，烯丙胺，1-乙烯基咪唑，4-乙烯基吡啶。另外，在第三阶段，可以一起添加一种以上的官能单体，以在一个过程中引入多种官能团。

·对于微珠表面上的官能团密度，可以通过调节官能单体的负载量进行微调。

·完成聚苯乙烯成核后，随后添加的交联剂(诸如DVB)和官能单体不会引起第二次成核，这是生成高度单分散的微珠的原因之一。

·对于微珠上超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的高负载量(30-50重量％)，可以通过原位生成纳米粒子实现。

·由于在PS核心上接枝的官能团得到良好控制，因此可以对表面上形成的Fe₃O₄纳米粒子的大小进行很好地控制。

将参考以下非限制性实施例对本发明的其他方面和实施方案进行描述。

实施例

本发明涉及具有核壳结构的单分散超顺磁性微珠。所述微珠可以通过图2中列出的四步过程进行来制备，这与用于生成单分散超顺磁性微珠的常规合成方法在根本上是不同的。

下面参考图2进一步对四个步骤的细节进行详细描述。

步骤1：经由“一锅三阶段”聚合流程，从三种单体(苯乙烯、交联剂、官能单体)合成高度单分散的三元共聚物微珠。

(a)第一阶段是苯乙烯在含有0-20体积％水的乙醇中的分散聚合。成核在该步骤中完成，得到聚苯乙烯核心20。消耗了大部分的苯乙烯单体(诸如，60-80重量％)，因此微珠数量在该阶段是固定的。聚合时间为2-12小时，优选4-10小时。

(b)第二阶段是通过添加交联剂进行交联。交联剂与剩余苯乙烯进行共聚形成核壳结构(A)。聚合时间为1-8小时，优选2-6小时。

(c)在第三阶段中，加入官能单体，与剩余的少量交联剂和苯乙烯进行共聚。所得到的三元共聚物壳体40在微珠表面上含有亲水性官能团。另外，在这一阶段可以一起添加一种以上的官能单体(诸如，两种或三种官能单体)，一次引入多种官能团。聚合时间为8-24小时，优选10-20小时。

令人惊讶地发现，“一锅三阶段”连续过程能够从三种单体(苯乙烯、DVB和官能单体)中生成高度单分散的球形三元共聚物微珠。这种“一锅三阶段”连续过程具有以下三个突出特点：

(a)苯乙烯提供成核模板，从而形成球形单分散微珠。

(b)交联剂(诸如DVB)提供交联作用，并决定了微珠的刚度以及对有机溶剂的耐受性。

(c)官能单体引入了亲水性官能团(诸如-COOH、-NH₂、环氧基团、酸酐基团)，从而可以得到进一步改性，以促进超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的上载。

还令人惊讶地发现，加入交联剂和官能单体后不会引起第二次成核。另外，通过在该阶段添加官能单体，在表面上实现了高密度官能团，这使得能够原位沉淀超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子。

步骤2：用有机溶剂对所合成的三元共聚物微珠进行洗涤和表面改性。

用有机溶剂彻底洗涤步骤1中所合成的三元共聚物微珠(A)。洗涤的目的是去除溶液中未反应的苯乙烯、交联剂和官能单体，以及稳定剂，诸如PVP。另外，用极性溶剂(以下示例)洗涤还可以去除聚合物基体中存在的一些线性聚苯乙烯，这可以使微珠松散并产生一些孔(如30所示)，从而有利于原位负载超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子。微珠洗涤后经重新分散并保存在水中，得到(B)。

在洗涤或浸泡过程中，可以进一步对微珠表面上的官能团进行改性，以促进超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的上载。将环氧基团引入到微珠表面时，环氧基团可以进行开环水解、或开环氨解、或开环聚合，以进一步对微珠表面进行改性。

步骤3：原位生成Fe₃O₄纳米粒子并上载到三元共聚物微珠上。

将洗涤后的微珠(B)分散到含有Fe³⁺和Fe²⁺(摩尔比为2:1)的水溶液(水和诸如THF之类的极性溶剂的混合物)中，并在搅拌下将分散液加热(例如，加热至70)数小时，使两种离子与微珠的官能团相互作用。不希望受到理论的束缚，据信在这一过程中，一些Fe³⁺离子和Fe²⁺离子将渗透到微珠聚合物基体中，而一些将被吸附到微珠表面上。然后，加入氨水，以将Fe³⁺离子和Fe²⁺离子转化为Fe₃O₄纳米粒子(Fe₃O₄NP；60)。在加入氨水之后，可以向微珠溶液中添加用于稳定Fe₃O₄纳米粒子的配体(诸如，聚丙烯酸或酒石酸或柠檬酸)，以帮助形成超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子。离心分离所获得的超顺磁性聚合物微珠(C)，然后用水和甲醇洗涤，以去除松散的Fe₃O₄纳米粒子。

步骤4：在超顺磁性微珠上制备官能涂层。

在超顺磁性聚合物微珠(C)上制备涂层80。制备涂层时，使锚定材料与(C)反应，接下来使本体单体、第二官能单体和可选的交联剂进行自由基聚合。可以根据所需的密度，将羟基基团、羧基基团等官能团进一步引入到表面上。

在具体实施例中，将超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子40包封在步骤2中形成的官能聚合物网络中。为了实现聚合物接枝，通过与步骤2中留在微珠表面上的官能团(例如，羟基基团或胺基基团)反应，引入锚定材料。锚定材料可以从具体实施方式中列出的材料中进行选择。无水溶剂选自1,4-二恶烷、四氢呋喃、二甘醇二甲醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲乙酮。优选四氢呋喃和二甘醇二甲醚。反应时间为12-36小时，同时采用惰性气体吹扫。用有机溶剂对所得到的微珠进行洗涤，以去除过量的单体。

使微珠表面上的锚定基团(诸如不饱和基团)与第一步中的本体单体、第二步骤中的第二官能单体、以及可选的交联剂发生反应，对涂层进行进一步接枝处理。具体材料在具体实施方式中列出。在这一阶段，聚合时间为10-30小时，优选16-24小时。自由基聚合可以在40-80(优选50-70)的温度下进行。

材料：

这些材料均购自以下提供的来源。

苯乙烯：东京化学工业公司(TCI)，用TBC(4-叔丁基邻苯二酚)稳定，>99.0％(GC)。

偶氮二异丁腈(AIBN)：Sigma-Aldrich(在丙酮中为12重量％)。

过硫酸钠(Na₂S₂O₈，SPS)：Alfa Aesar，晶状，98％。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30，MW＝40,000)：TCI，总氮12.0％-12.8％(以无水物质计)；最大水含量7.0％，K值26.0-34.0。

二乙烯基苯(DVB，间-和对-混合物)：TCI，50.0％(GC)(含有乙基乙烯基苯，二乙基苯)(用4-叔丁基邻苯二酚稳定)。

丙烯酸：TCI，>99.0％(GC)(用单甲醚对苯二酚稳定)。

缩水甘油甲基丙烯酸酯：Sigma-Aldrich，≥97.0％(GC)。

2-羟乙基甲基丙烯酸酯：Sigma-Aldrich，≥99.0％

2-羧乙基丙烯酸酯低聚物：Sigma-Aldrich，2000ppm MEHQ作为抑制剂。

乙醇：99％。

柠檬酸：Sigma-Aldrich，98％。

三羟甲基丙烷三丙烯酸酯：Sigma-Aldrich

甲基丙烯酸甲酯：TCI

2-(2-氨基乙氧基)乙醇：Sigma-Aldrich，98％；

去离子(DI)水：购自ELGA Ultrapure Water Treatment Systems(PURELAB选件)。

使用JEOL JSM 6700F进行扫描电子显微镜(SEM)成像。

使用JEOL 2100F进行透射电子显微镜(TEM)成像。

机械搅拌器：Wiggens，WB2000-M高架搅拌器。

使用Shimadzu，DTG-60进行热重分析(TGA)。将具有约15mg(干质量)微珠的样品在70的烤箱中干燥。将空坩埚(包含标准品坩埚和样品坩埚)平行放置在支架上。清除标准品坩埚和样品坩埚之间的重量差。然后将微珠样品装入样品坩埚中。温度曲线设置为从室温到700，增量为20/min，并在100下保持10分钟。整个过程在氮气吹扫下进行。磁含量根据以下公式计算：

其中Wi为保持10分钟后在100下的重量，W2是在700下的重量。

测量超顺磁特性时，采用Quantum Design的6000PPMS(物理特性测量系统)进行。将具有约15mg(干质量)微珠的样品在真空烘箱中在室温下干燥。使用配备振动样品磁力计(P525)和振动样品磁力计(Micro Sense，EV9)的物理特性测量系统(Quantum Design，PPMS6000)获得磁化曲线[M-H]。在300K的条件下，施加适当强度的磁场对M-H进行测量。

根据SEM图像(x10,000)测量结果，计算聚苯乙烯微珠的变异系数(CV)％。使用IMAGEJ测量100个微珠，然后计算平均直径和CV。

一般考虑因素：

所有聚合过程均使用机械搅拌(200rpm)。使用前，使用氮气使去离子水和乙醇鼓泡20分钟，去除氧气。所有化学品(包含AIBN、SPS、PVP、丙烯酸、烯丙胺，DVB、苯乙烯、缩水甘油、缩水甘油甲基丙烯酸酯、双酚A二缩水甘油醚和2-羟乙基甲基丙烯酸酯)均按原样使用，未经纯化。使用标准Schlenk线技术，在氮气保护下进行所有的聚合和反应。

实施例1：

带有-COOH和-OH基团的单分散微珠的合成

以下描述的是“一锅三阶段”聚合过程，用于合成带有-COOH和-OH基团的单分散微珠。

向配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中，加入AIBN溶液(2g，在丙酮中为12重量％)；然后从一个侧颈引入氮气，去除丙酮溶剂。氮气流动10分钟后，在反应器的底部观察到干燥的AIBN粉末。然后加入PVP(0.2g)、乙醇(80mL)和去离子水(20mL)。将混合物在室温下搅拌5分钟，获得透明溶液；然后用油浴将该溶液加热至60，接下来加入苯乙烯(7.5mL)。4小时后产生白色胶体溶液，这表明苯乙烯发生聚合。然后在30分钟内，使用恒压滴液漏斗缓慢加入DVB溶液(在7mL乙醇中为3mL DVB)。DVB溶液添加完成后，继续反应(交联聚合反应)3小时。然后，使用注射器加入2-羟乙基甲基丙烯酸酯(在5mL乙醇中为0.75g)和2-羧乙基丙烯酸酯低聚物(在5mL乙醇中为0.75g，用氨溶液中和，25％W/W)的单体溶液。反应(聚合反应)持续6小时，得到乳状胶体溶液。SEM图像表明，所合成的微珠为球形且呈单分散状态，直径约为1.0μm(图3)。将所获得的微珠称为“A-1”。

实施例2：

微珠A-1的洗涤和表面改性

离心分离A-1的微珠(50mL分散液，质量浓度约为8重量％)，然后通过超声处理重新分散在乙醇中。用乙醇(50mL×2)和THF与水的混合物(1:1体积比；50mL×2)洗涤微珠。对所获得的微珠进行离心，然后并重新分散在THF(50mL)中，得到B-1。SEM图像显示这些微珠为球形且呈单分散状态，直径约为1.0μm。

实施例3：

微珠B-1的磁化

向配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中，加入FeCl₃(8.0g)和100mL水，搅拌形成褐色溶液，接下来加入FeCl₂(3.1g)和THF(20mL)。搅拌混合物30分钟以形成溶液，向所得到的溶液中加入微珠B-1的水溶液(50mL，质量浓度约为8重量％)，然后在70下搅拌3小时。将混合物冷却至室温后，在剧烈搅拌下加入氨水(25重量％，30mL)，立即得到黑色浆体。向反应器中加入柠檬酸溶液(0.5g，在10mL水中)，然后将黑色浆体加热至70，保持1小时以完成反应。通过数次离心移位对超顺磁性微珠进行纯化，以去除未结合的超顺磁性纳米粒子，最后将其重新分散到去离子水中(100mL，约4重量％)。将所获得的黑褐色超顺磁性微珠称为“C-1”。TGA结果显示微珠含有43重量％的纳米粒子。所获得的磁性微珠为单分散微珠，一些Fe₃O₄纳米粒子均匀地分散在核心内，表面上有一层非常厚的蓬松的Fe₃O₄纳米粒子。Fe₃O₄纳米粒子层在微珠周围的厚度约为70-100nm(图4)。使用Quantum Design的6000PPMS(物理特性测量系统)，对超顺磁性进行测量。使用根据原子吸收光谱法测定的微珠质量，对饱和磁化(MS)值进行归一化。

图5显示了样品C-1在室温下的典型磁滞曲线。磁滞回线表示超顺磁行为，如通过磁化回线上的零矫顽力和剩磁明显可见。

实施例4：

官能涂层的制备

结合步骤：向配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中，加入超顺磁性微珠C-1(30mL，在无水THF中为4重量％)，甲基丙烯酰氯(100mg，溶解在10mL无水THF中)。在氮气吹扫下，将混合物加热至60并保持18小时，然后将其冷却至室温。用THF洗涤微珠，去除过量的甲基丙烯酰氯，然后用水洗涤。在氮气保护下将微珠保存在水中。

乳液聚合涂覆步骤：将来自之前步骤的改性超顺磁性微珠(10mL，约4重量％水溶液)加入到装有30mL去离子水的50mL离心管中。然后将混合物加入到配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中。用氮气吹扫反应器以去除氧气，然后加入SPS(30mg，溶于2mL水中)。将混合物分散液加热至60并在60下搅拌10分钟。随后，在1小时的时间内分4批(因此以20分钟为间隔)添加含有甲基丙烯酸甲酯(400mg)、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(200mg)的单体混合物。单体混合物添加完成后，在60下继续反应(涂覆聚合)6小时。冷却至室温后，用磁分离器分离涂覆的超顺磁性微珠，然后用乙醇(50mL×2)和去离子水(50mL×2)洗涤。将具有涂层的超顺磁性微珠称为D-1。图6中的TEM图像清楚地表明，微珠的结构对应于图2(D)中提出的那些结构。微珠边缘完全被一层聚合物覆盖，这可以防止磁性粒子浸出。

实施例5：

带有环氧基团的单分散微珠的合成

以下描述的是“一锅三阶段”聚合过程，用于合成由三种单体(苯乙烯、DVB、GMA)制成的单分散微珠，这些微珠均带有环氧基团。

向配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中，加入AIBN溶液(2.0g，在丙酮中为12重量％)，然后从一个侧颈引入氮气以去除丙酮溶剂。氮气流动10分钟后，在反应器的底部观察到干燥的AIBN粉末。然后加入PVP(0.3g)、乙醇(80mL)和去离子水(16mL)。将混合物在室温下搅拌5分钟，获得透明溶液；然后用油浴将该溶液加热至60，接下来加入苯乙烯(7.5mL)。

6小时后生成白色胶体溶液，这表明苯乙烯发生聚合。然后在30分钟内，用恒压滴液漏斗缓慢加入DVB溶液(1.5mL，溶于8.5mL乙醇中)。DVB溶液添加完成后，继续反应(交联聚合反应)2小时。然后用注射器加入缩水甘油甲基丙烯酸酯(GMA)溶液(2.0g，溶于10mL乙醇中)。继续反应(聚合)24小时，得到乳状胶体溶液。SEM图像表明，所合成的微珠为球形且呈单分散状态，直径约为1.0μm(图7)。将所获得的微珠称为“A-2”。

实施例6：

A-2的洗涤和表面改性

离心分离A-2的微珠分散液(50mL，质量浓度约为8重量％)，然后通过超声处理重新分散在乙醇中。用乙醇(50mL×2)和THF与水的混合物(1:1体积比；50mL×2)洗涤微珠。将微珠重新分散在含有1g 2-(2-氨基乙氧基)乙醇的THF溶液中，然后在室温下搅拌20小时。然后用水洗涤微珠5次，并重新分散在水中，得到B-2。SEM图像显示这些微珠为球形且呈单分散状态，直径约为1.0μm。

实施例7：

B-2微珠的磁化

向配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中，加入FeCl₃(8.0g)和100mL水，搅拌形成褐色溶液，接下来加入FeCl₃(3.1g)和THF(20mL)。搅拌混合物30分钟以形成溶液，向所得到的溶液中加入微珠B-2的溶液(50mL，水溶液质量浓度约为8重量％)，然后在65下搅拌3小时。将混合物冷却至室温后，在剧烈搅拌下加入氨水(25重量％，25mL)，立即得到黑色浆体。向反应器中加入柠檬酸溶液(0.5g，在10mL水中)，然后将黑色浆体加热至70，保持1小时以完成反应。通过数次离心移位对超顺磁性微珠进行纯化，以去除未结合的超顺磁性纳米粒子，最后将其重新分散到去离子水中(100mL，约4重量％)。将所获得的黑褐色超顺磁性微珠称为“C-2”。TGA结果显示微珠含有41重量％的纳米粒子。图8显示了C-2的TEM图像。

实施例8：

官能涂层的制备

结合步骤：向配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中，加入超顺磁性微珠C-2(10mL，在无水THF中为4重量％)、甲基丙烯酸酐(120mg，溶解在30mL无水THF中)和三乙胺(TEA)(20μL，溶解在10mL无水THF中)。在氮气吹扫下，将混合物加热至65并保持3小时，然后将其冷却至室温。用THF洗涤微珠，去除过量的甲基丙烯酸酐，然后用水洗涤。在氮气保护下将微珠保存在水中。

接枝聚合涂覆步骤：将来自之前步骤的改性超顺磁性微珠(10mL，约4重量％水溶液)加入到装有30mL去离子水的50mL离心管中。然后将混合物加入到配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中。用氮气吹扫反应器以去除氧气，然后加入SPS(30mg，溶于2mL水中)。将混合物分散液加热至60并在60下搅拌10分钟。随后，在4小时内分4批(1小时的间隔)加入含有甲基丙烯酸甲酯(400mg)、双酚A环氧丙烯酸酯(150mg)的单体混合物。单体混合物添加完成后，在60下继续反应(涂覆聚合反应)4小时。加入丙烯酸单体(在水中稀释100mg，用氨溶液进一步中和，25％(w/w)。)，然后在60下继续反应16小时。冷却至室温后，用磁分离器分离涂覆的超顺磁性微珠，然后用乙醇(50mL×2)、去离子水(50mL×2)洗涤。将具有涂层的超顺磁性微珠称为D-2。图9中的TEM图像显示，与C-1的图像相比外层更光滑。这表明纳米粒子已经被有效地封装在聚合物网络中。

比较实施例1

不带官能团的单分散微珠的合成

以下描述的是“一锅两阶段”聚合过程，用于合成两种单体(苯乙烯-DVB)的单分散微珠(不含官能团)。

向配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中，加入AIBN溶液(2.2g，在丙酮中为12重量％)，然后从一个侧颈引入氮气以去除丙酮。氮气流动10分钟后，在反应器的底部观察到干燥的AIBN粉末。然后加入PVP(0.9g)、乙醇(90mL)和去离子水(10mL)。将混合物在室温下搅拌5分钟，获得透明溶液；然后用油浴将该溶液加热至70，接下来加入苯乙烯(7.5mL)。

6小时后产生白色胶体溶液，这表明苯乙烯发生聚合。然后在30分钟内，使用恒压滴液漏斗缓慢加入DVB溶液(1.5mL，溶解在8.5mL乙醇中)。DVB溶液添加完成后，继续反应(交联聚合)20小时，得到乳状胶体溶液。SEM图像表明，所合成的微珠为球形且呈单分散状态，直径约为0.8μm(图10)。将所获得的微珠称为“CE-1”。由于未添加官能单体，微珠CE-1在表面上没有官能团，所以微珠具有疏水性。

比较实施例2

CE-1的洗涤和浸泡

离心分离所合成的CE-1的苯乙烯-DVB聚合物微珠(50mL分散液，质量浓度约为8重量％)，然后通过超声处理重新分散在乙醇中。用乙醇(50mL×2)和THF与水的混合物(1:1体积比；50mL×2)以及THF(50mL×2)洗涤微珠。将洗涤后的微珠称为“CE-2”。SEM图像显示这些微珠为球形且呈单分散状态，直径约为0.8μm。

比较实施例3

CE-2微珠的磁化

向配备机械搅拌器的250mL三颈圆底玻璃反应器中，加入FeCl₃(8.0g)和100mL水，搅拌形成褐色溶液，接下来加入FeCl₂(3.1g)、柠檬酸(8.5g)和THF(20mL)。搅拌混合物30分钟以形成溶液，向所得到的溶液中加入微珠CE-2的THF溶液(50mL，质量浓度约为8重量％)，然后在60下搅拌3小时。将混合物冷却至室温后，在剧烈搅拌下加入氨水(25重量％，30mL)，立即得到黑色浆体。将黑色浆液加热至60，保持1小时以完成反应。通过数次离心移位对超顺磁性微珠进行纯化，以去除未结合的超顺磁性纳米粒子，最后将其重新分散到去离子水中(100mL，约4重量％)。

所获得的微珠仍为白色，被称为“CE-3”。TGA结果显示微珠含有1重量％的纳米粒子。该比较实验表明，苯乙烯-DVB聚合物微珠无法结合足够量的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子。TEM图像(图11)进一步证实了这一点，该图像显示在CE-3的表面上仅形成了少量(5个)磁性纳米粒子。磁性纳米粒子仅聚集在微球间隙之间。