一种高效、快速制备原人参二醇及原人参三醇的方法
阅读说明：本技术 一种高效、快速制备原人参二醇及原人参三醇的方法 (Method for efficiently and rapidly preparing protopanaxadiol and protopanaxatriol ) 是由 赵庆杰 卓小斌 宋琰 邹燕 李修正 李安鹏 于 2021-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种高效、快速制备原人参二醇及原人参三醇的方法,包括如下步骤：(1)将原料溶解在碱性溶剂中,通入适量臭氧,在高压条件下反应2-10小时,得反应液；(2)反应液用正丁醇萃取有机相,洗涤,减压浓缩,得原人参二醇或原人参三醇粗品；(3)取原人参二醇或原人参三醇粗品溶解,减压浓缩,降温析晶,抽滤,烘干,得原人参二醇或原人参三醇精品。本发明提供了一种可简单、方便、快速、高转化率、大批量生产原人参二醇或原人参三醇的方法,显著减少了反应时间,显著降低了20(R)型异构体的生成,提高了反应的选择性、加快了反应速度。本发明简单方便、成本低、回收率高(皂苷得率≧95％)、质量好(纯度≧98％)。(The invention relates to a method for efficiently and quickly preparing protopanaxadiol and protopanaxatriol, which comprises the following steps: (1) dissolving the raw materials in an alkaline solvent, introducing a proper amount of ozone, and reacting for 2-10 hours under a high pressure condition to obtain a reaction solution; (2) extracting the organic phase of the reaction solution by using n-butanol, washing, and concentrating under reduced pressure to obtain a crude product of protopanaxadiol or protopanaxatriol; (3) dissolving the crude product of protopanaxadiol or protopanaxatriol, concentrating under reduced pressure, cooling, crystallizing, filtering, and oven drying to obtain refined product of protopanaxadiol or protopanaxatriol. The invention provides a method for simply, conveniently, quickly and massively producing protopanaxadiol or protopanaxatriol with high conversion rate, which obviously reduces the reaction time, obviously reduces the generation of 20(R) type isomer, improves the reaction selectivity and accelerates the reaction speed. The method is simple and convenient, has low cost, high recovery rate (the saponin yield is larger than or equal to 95 percent) and good quality (the purity is larger than or equal to 98 percent).)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以人参属植物的总皂苷或原人参二醇组或原人参三醇组皂苷为原料，高效、快速制备原人参二醇及原人参三醇的新方法。
背景技术
人参(Panax Ginseng)、西洋参(PanaxQuinguefol)和三七(PanaxNotoginseng)等均属于五加科人参属植物，这些植物的几乎所有部分，如根、根茎、花、果实和茎叶都含有多种人参皂苷。人参皂苷是人参属植物中的主要生物活性成分，属于四环三萜类化合物，按化学结构的不同可将人参皂苷分成原人参二醇型、原人参三醇型和齐墩果酸型等三大类。在人参属植物体内，这些人参皂苷均为20(S)构型，人工碱解、酸解过程中可得到20(R)构型人参皂苷。
基于原料总皂苷的单体成分，人参植物总皂苷的二醇型(PPD)组分主要是人参皂苷-Ra1、Ra2、Ra3、Ro、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd中的几种或所有单体的混合物。三醇型(PPT)组分主要是人参皂苷-Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1等。研究表明，人参皂苷具有多方面的生物活性，在人参抗癌活性研究方面，国内外学者报道了原人参二醇型次级皂苷如20(S)-人参皂苷Rg3，Rh2及其皂苷元20(S)-原人参二醇(Protopanaxadio1)的抗癌活性，研究结果表明，这三种化合物均具有较强的抑制肿瘤细胞生长的作用，其中20(S)-原人参二醇的抑瘤作用最强。20(S)-原人参二醇的对应异构体为20(R)-原人参二醇。
除此之外，人参皂苷在免疫调节、改善微循环、调节消化机能、安神、抗疲劳、抗衰老、抗紧张、预防消化道溃疡、提高生命质量、增强记忆力等方面均具有较好的生物活性。但原人参二醇或原人参三醇在人参中的含量极低。
目前制备原人参二醇或原人参三醇的方法有生物转化法(CN1229086A、CN01133410.X、CN02132403.4)、高温高压碱水解法(CN1225366A)、高温碱水解法(CN1293198A)、酸水解法(CN1243128A)、酸催化热解法(CN02144780.2)等。
根据ZL01133408.8，一种人参皂苷酸水解制备原人参二醇的方法，该发明以二醇型皂苷为原料，采用抗坏血酸等保护剂，在有机溶剂中溶解，在惰性气体的保护下，在酸性条件下，加热水解得到原人参二醇。
根据ZL03134090.3，一种碱解人参皂苷制备单体低极性人参皂苷及其苷元的方法，该方法采用惰性气体保护，使用过氧化苯甲酰或叔丁基过氧化氢为诱发剂，在碱性条件下，高温160-180度碱解得到原人参二醇或原人参三醇。
根据ZL200410018038.8，原人参二醇及原人参三醇的制备方法，该方法采用西洋参茎叶提取物等为原料，采用氧化碱解的方式，得到原人参二醇或原人参三醇，采用的碱为醇钠，采用的氧化剂为氧气或压缩空气，反应温度为80-140度。
根据ZL200510100735.2，采用氧和过氧化物协同氧化碱解三七总皂苷制备原人参二醇和原人参三醇的方法，该方法也是采用过氧化物为氧化剂，以醇钠为碱，碱解人参皂苷得到原人参二醇或原人参三醇。
根据CN201310130423.0的方法，一种原人参二醇的生物合成方法及其生产菌株，该方法采用毕赤酵母工程菌株，通过酶解的方式生产得到原人参二醇或原人参三醇。
根据CN1225366A，20(S)-人参皂苷Rh2的制备方法，其药物组合物及应用，该方法在0.1-4KPa压力下，在100-300℃，采用醇钠或氢氧化钠等碱性试剂，在高压反应釜中水解，得到20(S)-人参皂苷Rh2。
以上方法均存在生产周期长、得率低，产生较多R型异构体等缺点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种高效、快速制备原人参二醇及原人参三醇的方法，以解决现有技术中生产周期长、得率低、无法规避产生大量20(R)型异构体等问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种高效、快速制备原人参二醇及原人参三醇的方法，其原料为天然人参皂苷，所述天然人参皂苷为二醇型人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Ra1、Ra2、Ra3、Rg3、Rh2、三醇型人参皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2、西洋参茎叶或根或根茎或果实的总皂苷、人参茎叶或根或根茎或果实的总皂苷、三七茎叶或根或根茎或果实的总皂苷、或绞股蓝茎叶总皂苷，其特征在于，包括如下步骤：(1)将原料溶解在碱性溶剂中，通入适量臭氧，在高压条件下反应2-10小时，得反应液；(2)反应液用正丁醇萃取有机相，洗涤，减压浓缩，得原人参二醇或原人参三醇粗品；所述臭氧是指浓度为0.01mg/m3-1mg/m3的臭氧气体；所述碱性溶剂的碱为甲醇钠、乙醇钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种，碱用量为0.01-0.5mol/L；反应压力为1-5Mpa；所述碱性溶剂的溶剂为正丁醇、乙二醇、丙三醇、甲醇或乙醇；反应温度为80-120℃，反应时间为2-10小时。
进一步，所述制备方法还包括：步骤(3)取原人参二醇或原人参三醇粗品溶解，减压浓缩，降温析晶，抽滤，烘干，得原人参二醇或原人参三醇精品。
进一步，所述步骤(2)反应液用正丁醇萃取三次，合并有机相，1％柠檬酸水溶性洗涤3次，饱和氯化钠水溶性洗涤3次，有机相降压浓缩至干，即得原人参二醇或原人参三醇粗品。
进一步，所述臭氧是指浓度为0.05mg/m3-0.1mg/m3的臭氧气体。
进一步，所述碱为乙醇钠，碱用量为0.1-0.2mol/L。
进一步，所述反应压力为1-2Mpa。
进一步，所述溶剂为正丁醇。
进一步，所述反应温度为90-100℃，反应时间为2-5小时。
进一步，所述反应时间小于3小时。
进一步，所述原人参二醇为20(S)-原人参二醇，所述原人参三醇为20(S)-原人参三醇。
进一步，所述产物中皂苷得率≧95％，纯度≧98％。
本发明优点在于：
1、本发明的方法，通过原料和反应条件的控制，对糖基的降解具有极高的选择性，可得到较高纯度的20(S)-原人参二醇或20(S)-原人参三醇，产物中20(R)型的异构化较低，总得率较高。
2、本发明提供了一种可简单、方便、快速、高转化率、大批量生产原人参二醇或原人参三醇的方法，显著减少了反应时间，显著降低了20(R)型异构体的生成，提高了反应的选择性、加快了反应速度。本工艺简单方便、成本低、回收率高(皂苷得率≧95％)、质量好(纯度≧98％)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1 20(S)-原人参二醇的制备
取5g 70％人参皂苷Rb1(不含三醇型皂苷)，100ml正丁醇溶解后，加入0.5g乙醇钠，放入实验型高压反应釜中，开启臭氧发生器，通臭氧10分钟，臭氧浓度为0.05mg/m3。然后断开臭氧管道，升温至90℃，使用压缩空气压力，将反应压力升至1MPa，持续反应2小时后，减压至常压，TLC点板确认原料是否反应完全。如没有反应完全，按同样方法，再通入臭氧10分钟，按相同步骤再反应2小时。重复2次，直至原料反应完全。
反应完成后，加入100ml蒸馏水，再加入100ml正丁醇，搅拌5分钟，静置分层得到有机相，再用相同的方法处理2次，每次100ml正丁醇萃取2次，合并有机相。有机相用100ml/次的1％柠檬酸水溶液洗涤3次，100ml/次的饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠脱水后，90℃减压浓缩至干，得到2.1g原人参二醇粗品。
取1g原人参二醇粗品，加入100ml乙醇，加热至80度溶解，缓慢减压浓缩至溶液呈浑浊状态，停止浓缩，降至10-15℃，析出白色晶体，抽虑，烘干。反复结晶2-3次，得到0.56g98％以上20(S)-原人参二醇精品。
实施例2 20(S)-原人参三醇的制备
取5g 70％人参皂苷Rg1(不含二醇型皂苷)，100ml正丁醇溶解后，加入0.5g乙醇钠，放入实验型高压反应釜中，开启臭氧发生器，通臭氧10分钟，臭氧浓度为0.1mg/m3。然后断开臭氧管道，升温至90℃，使用压缩空气压力，将反应压力升至1MPa，持续反应2小时后，减压至常压，TLC点板确认原料是否反应完全。如没有反应完全，按同样方法，再通入臭氧10分钟，按相同步骤再反应2小时。重复2次，直至原料反应完全。
反应完成后，加入100ml蒸馏水，再加入100ml正丁醇，搅拌5分钟，静置分层得到有机相，再用相同的方法处理2次，每次100ml正丁醇萃取2次，合并有机相。有机相用100ml/次的1％柠檬酸水溶液洗涤3次，100ml/次的饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠脱水后，在90℃减压浓缩至干，得到2.3g原人参三醇粗品。
取1g原人参三醇粗品，加入100ml乙醇，加热至80度溶解，缓慢减压浓缩至溶液呈浑浊状态，停止浓缩，降至10-15℃，析出白色晶体，抽虑，烘干。反复结晶2-3次，得到0.51g98％以上20(S)-原人参三醇精品。
实施例3原人参二醇和原人参三醇的制备
取5g西洋参茎叶总皂苷，100ml甲醇溶解后，加入0.5g甲醇钠，放入实验型高压反应釜中，开启臭氧发生器，通臭氧10分钟，臭氧浓度为1mg/m3。然后断开臭氧管道，升温至80℃，使用压缩空气压力，将反应压力升至2MPa，持续反应2小时后，减压至常压，TLC点板确认原料是否反应完全。如没有反应完全，按同样方法，再通入臭氧10分钟，按相同步骤再反应2小时。重复2次，直至原料反应完全。
反应完成后，加入100ml蒸馏水，再加入100ml正丁醇，搅拌5分钟，静置分层得到有机相，再2次，每次100ml正丁醇萃取2次，合并有机相。有机相用100ml/次的1％柠檬酸水溶液洗涤3次，100ml/次的饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠脱水后，在90℃减压浓缩至干，得到2.3g原人参二醇和原人参三醇混合粗品。
取1g原人参二醇和原人参三醇混合样品，用适量70％甲醇水溶解，使用汉邦DAC-50制备色谱系统分离，以C18为固定相，以70％-90％的甲醇水为梯度流动相，经色谱分离后，减压浓缩，分别得到0.35g的98％原人参二醇和0.05g的98％原人参三醇。
实施例4原人参二醇和原人参三醇的制备
取5g人参根总皂苷，100ml乙醇溶解后，加入0.5g乙醇钠，放入实验型高压反应釜中，开启臭氧发生器，通臭氧10分钟，臭氧浓度为0.01mg/m3。然后断开臭氧管道，升温至100℃，使用压缩空气压力，将反应压力升至1MPa，持续反应2小时后，减压至常压，TLC点板确认原料是否反应完全。如没有反应完全，按同样方法，再通入臭氧10分钟，按相同步骤再反应2小时。重复2次，直至原料反应完全。
反应完成后，加入100ml蒸馏水，再加入100ml正丁醇，搅拌5分钟，静置分层得到有机相，再2次，每次100ml正丁醇萃取2次，合并有机相。有机相用100ml/次的1％柠檬酸水溶液洗涤3次，100ml/次的饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠脱水后，在90℃减压浓缩至干，得到2.3g原人参二醇和原人参三醇混合粗品。
取1g原人参二醇和原人参三醇混合样品，用适量70％甲醇水溶解，使用汉邦DAC-50制备色谱系统分离，以C18为固定相，以70％-90％的甲醇水为梯度流动相，经色谱分离后，减压浓缩，分别得到0.3g的98％原人参二醇和0.1g的98％原人参三醇。
实施例5 20(S)-原人参二醇的制备
取5g 70％人参皂苷Rc，100ml乙二醇溶解后，加入0.5g碳酸氢钠，放入实验型高压反应釜中，开启臭氧发生器，通臭氧10分钟，臭氧浓度为0.05mg/m3。然后断开臭氧管道，升温至120℃，使用压缩空气压力，将反应压力升至5MPa，持续反应5小时后，减压至常压，TLC点板确认原料是否反应完全。如没有反应完全，按同样方法，再通入臭氧10分钟，按相同步骤再反应2小时。重复2次，直至原料反应完全。
反应完成后，加入100ml蒸馏水，再加入100ml正丁醇，搅拌5分钟，静置分层得到有机相，再用相同的方法处理2次，每次100ml正丁醇萃取2次，合并有机相。有机相用100ml/次的1％柠檬酸水溶液洗涤3次，100ml/次的饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠脱水后，90℃减压浓缩至干，得到2.2g原人参二醇粗品。
取1g原人参二醇粗品，加入100ml乙醇，加热至80度溶解，缓慢减压浓缩至溶液呈浑浊状态，停止浓缩，降至10-15℃，析出白色晶体，抽虑，烘干。反复结晶2-3次，得到0.53g98％以上20(S)-原人参二醇精品。
实施例6 20(S)-原人参二醇的制备
取5g 70％人参皂苷Ra1，100ml丙三醇溶解后，加入0.5g碳酸钠，放入实验型高压反应釜中，开启臭氧发生器，通臭氧10分钟，臭氧浓度为0.1mg/m3。然后断开臭氧管道，升温至100℃，使用压缩空气压力，将反应压力升至0.1MPa，持续反应10小时后，减压至常压，TLC点板确认原料是否反应完全。如没有反应完全，按同样方法，再通入臭氧10分钟，按相同步骤再反应2小时。重复2次，直至原料反应完全。
反应完成后，加入100ml蒸馏水，再加入100ml正丁醇，搅拌5分钟，静置分层得到有机相，再用相同的方法处理2次，每次100ml正丁醇萃取2次，合并有机相。有机相用100ml/次的1％柠檬酸水溶液洗涤3次，100ml/次的饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠脱水后，90℃减压浓缩至干，得到2.4g原人参二醇粗品。
取1g原人参二醇粗品，加入100ml乙醇，加热至80度溶解，缓慢减压浓缩至溶液呈浑浊状态，停止浓缩，降至10-15℃，析出白色晶体，抽虑，烘干。反复结晶2-3次，得到0.55g98％以上20(S)-原人参二醇精品。
实施例7 20(S)-原人参三醇的制备
取5g 70％人参皂苷Rf，100ml正丁醇溶解后，加入0.5g碳酸钠，放入实验型高压反应釜中，开启臭氧发生器，通臭氧10分钟，臭氧浓度为0.1mg/m3。然后断开臭氧管道，升温至100℃，使用压缩空气压力，将反应压力升至0.1MPa，持续反应5小时后，减压至常压，TLC点板确认原料是否反应完全。
反应完成后，加入100ml蒸馏水，再加入100ml正丁醇，搅拌5分钟，静置分层得到有机相，再用相同的方法处理2次，每次100ml正丁醇萃取2次，合并有机相。有机相用100ml/次的1％柠檬酸水溶液洗涤3次，100ml/次的饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠脱水后，90℃减压浓缩至干，得到2.3g原人参三醇粗品。
取1g原人参三醇粗品，加入100ml乙醇，加热至80度溶解，缓慢减压浓缩至溶液呈浑浊状态，停止浓缩，降至10-15℃，析出白色晶体，抽虑，烘干。反复结晶2-3次，得到0.50g98％以上20(S)-原人参三醇精品。
实施例8原人参二醇和原人参三醇的制备
取5g三七根总皂苷，100ml正丁醇溶解后，加入0.5g乙醇钠，放入实验型高压反应釜中，开启臭氧发生器，通臭氧10分钟，臭氧浓度为0.1mg/m3。然后断开臭氧管道，升温至100℃，使用压缩空气压力，将反应压力升至1MPa，持续反应5小时后，减压至常压，TLC点板确认原料是否反应完全。
反应完成后，加入100ml蒸馏水，再加入100ml正丁醇，搅拌5分钟，静置分层得到有机相，再2次，每次100ml正丁醇萃取2次，合并有机相。有机相用100ml/次的1％柠檬酸水溶液洗涤3次，100ml/次的饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠脱水后，在90℃减压浓缩至干，得到2.5g原人参二醇和原人参三醇混合粗品。
取1g原人参二醇和原人参三醇混合样品，用适量70％甲醇水溶解，使用汉邦DAC-50制备色谱系统分离，以C18为固定相，以70％-90％的甲醇水为梯度流动相，经色谱分离后，减压浓缩，分别得到0.35g的98％原人参二醇和0.15g的98％原人参三醇。
对比例
取5g 70％人参皂苷Rb1(不含三醇型皂苷)，100ml正丁醇溶解后，加入0.5g乙醇钠，放入实验型高压反应釜中，升温至90℃，使用压缩空气压力，将反应压力升至1MPa，持续反应2小时后，减压至常压，TLC点板确认原料是否反应完全。如没有反应完全，按同样方法，再通入臭氧10分钟，按相同步骤再反应2小时。重复2次，直至原料反应完全。
反应完成后，加入100ml蒸馏水，再加入100ml正丁醇，搅拌5分钟，静置分层得到有机相，再用相同的方法处理2次，每次100ml正丁醇萃取2次，合并有机相。有机相用100ml/次的1％柠檬酸水溶液洗涤3次，100ml/次的饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠脱水后，90℃减压浓缩至干，得到1.5g原人参二醇粗品。
取1g原人参二醇粗品，加入100ml乙醇，加热至80度溶解，缓慢减压浓缩至溶液呈浑浊状态，停止浓缩，降至10-15℃，析出白色晶体，抽虑，烘干。反复结晶2-3次，得到0.42g80％以上20(S)-原人参二醇精品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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