具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种皂苷单体化合物，所述皂苷单体化合物如式(I)所示：

其中，R选自H、

本发明还提供了一种上述皂苷单体化合物的分离方法，包括：S1)将口服用三七总皂苷溶解于水中，经非极性大孔吸附树脂吸附后，乙醇洗脱，得到三七二醇皂苷；S2)将所述三七二醇皂苷溶于乙腈水溶液中进行中高压制备色谱分离，以C18填料为固定相，以乙腈与水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，得到组分Fr.A与组分Fr.B；所述乙腈与水的体积比为(30～50)：(70～50)；S3a)将组分Fr.A溶于乙腈水溶液中进行半制备高压液相色谱分离，以C18填料为固定相，以乙腈与水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，得到化合物1与化合物2；所述乙腈与水的体积比为(28～50)：(72～50)；S3b)将组分Fr.B溶于乙腈水溶液中进行半制备高压液相色谱分离，以C18填料为固定相，以乙腈与水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，得到化合物3；所述乙腈与水的体积比为(30～50)：(70～50)；所述S3a)与S3b)并无先后顺序之分；

所述化合物1为R为的式(I)所示的化合物；化合物2为R为的式(I)所示的化合物；化合物3为R为H的式(I)所示的化合物。

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

将口服用三七总皂苷溶解于水中，经非极性大孔吸附树脂吸附后，乙醇洗脱，得到三七二醇皂苷；所述口服用三七总皂苷为供口服用的三七总皂苷即可，其质量标准优选符合药典2020标准；所述口服用三七总皂苷与水的比例优选为1：5～1：20(g/mL)，更优选为1：5～1：15(g/mL)，再优选为1：5～1：10(g/mL)，最优选为1：6(g/mL)；所述非极性大孔吸附树脂优选为D101大孔吸附树脂；所述乙醇洗脱优选为70％～80％乙醇洗脱，更优选为75％乙醇洗脱；在本发明中，乙醇洗脱前优选还包括依次用水与低浓度乙醇洗脱；所述低浓度乙醇洗脱优选为25％～35％乙醇洗脱，更优选为30％乙醇洗脱；即在本发明中，此步骤优选具体为经非极性大孔吸附后，依次用水、25％～35％乙醇、70％～80％乙醇洗脱，收集70％～80％乙醇洗脱液，浓缩，得到三七二醇皂苷；更优选具体为经非极性大孔吸附后，依次用水、30％乙醇、75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，浓缩，得到三七二醇皂苷；所述水、25％～35％乙醇、70％～80％乙醇洗脱时，洗脱液的用量各自独立地优选为4～8BV，更优选为5～7BV，再优选为6BV。

将所述三七二醇皂苷溶于乙腈水溶液中进行中高压制备色谱分离，以C18填料为固定相，以乙腈与水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，得到组分Fr.A与组分Fr.B；所述乙腈水溶液中乙腈的体积浓度优选为5％～15％，更优选为8％～12％，再优选为10％；所述三七二醇皂苷与乙腈水溶液的质量体积比优选为1：5～1：10(g/mL)，更优选为1：6～1：9(g/mL)，再优选为1：8～1：9(g/mL)；所述中高压制备色谱以C18填料为固定相，优选以反相C18填料为固定相，更优选为以UniSil反相C18填料为固定相；所述C18填料的粒径优选为10μm；所述中高压制备色谱以乙腈与水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱；所述流动相的流速优选为300～500mL/min，更优选为350～450mL/min，再优选为400mL/min；所述乙腈与水的体积比为(30～50)：(70～50)；在本发明中，以体积百分比计，以乙腈为流动相A，水为流动相B，所述梯度洗脱的程度优选具体为：

0～15min，流动相A从28％～32％升至33％～37％；

15～40min，流动相A从33％～37％升至38％～42％；

40～50min，流动相A从38％～42％升至43％～47％；

50～53min，流动相A从43％～47％升至48％～52％；

53～70min，流动相A保持48％～52％；

70～80min，流动相A从48％～52％降至28％～32％；

更优选具体为：

0～15min，流动相A从30％升至35％；

15～40min，流动相A从35％升至40％；

40～50min，流动相A从40％升至45％；

50～53min，流动相A从45％升至50％；

53～70min，流动相A保持50％；

70～80min，流动相A从50％降至30％。

所述中高压制备色谱的检测波长优选为203nm；经中高压制备色谱分离收集相似的流份，得到组分Fr.A与组分Fr.B。

将组分Fr.A溶于乙腈水溶液中进行半制备高压液相色谱分离，以C18填料为固定相，以乙腈与水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱；所述乙腈水溶液中乙腈的体积浓度优选为15％～25％，更优选为18％～22％，再优选为20％；所述组分Fr.A与乙腈水溶液的质量体积比优选为1：5～1：10(g/mL)，更优选为1：5～1：8(g/mL)，再优选为1：5～1：6(g/mL)；所述半制备高压液相色谱以C18填料为固定相，优选以反相C18填料为固定相，更优选为以UniSil反相C18填料为固定相；所述C18填料的粒径优选为10μm；固定相的尺寸优选为50×250mm；所述半制备高压液相色谱以乙腈与水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱；所述流动相的流速优选为20～30mL/min，更优选为22～28mL/min，再优选为25mL/min；所述乙腈与水的体积比为(28～50)：(72～50)；在本发明中，以体积百分比计，以乙腈为流动相A，水为流动相B，所述梯度洗脱的程度优选具体为：

0～20min，流动相A从25％～30％升至33％～37％；

20～45min，流动相A从33％～37％升至38％～42％；

45～60min，流动相A从38％～42％升至43％～47％；

60～70min，流动相A从43％～47％升至48％～52％；

70～75min，流动相A保持48％～52％；

75～80min，流动相A从48％～52％降至28％～32％；

80～90min，流动相A保持28％～32％；

更优选具体为：

0～20min，流动相A从28％升至35％；

20～45min，流动相A从35％升至40％；

45～60min，流动相A从40％升至45％；

60～70min，流动相A从45％升至50％；

70～75min，流动相A保持50％；

75～80min，流动相A从50％降至30％；

80～90min，流动相A保持30％。

所述半制备高压液相色谱的检测波长优选为203nm；经半制备高压液相色谱分离收集单独出峰相似的流份，得到化合物1与化合物2。

将组分Fr.B溶于乙腈水溶液中进行半制备高压液相色谱分离，以C18填料为固定相，以乙腈与水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱；所述乙腈水溶液中乙腈的体积浓度优选为20％～25％，更优选为21％～24％，再优选为22％～23％；所述组分Fr.B与乙腈水溶液的质量体积比优选为1：5～1：10(g/mL)，更优选为1：6～1：9(g/mL)，再优选为1：7～1：8(g/mL)；所述半制备高压液相色谱以C18填料为固定相，优选以反相C18填料为固定相，更优选为以UniSil反相C18填料为固定相；所述C18填料的粒径优选为10μm；固定相的尺寸优选为50×250mm；所述半制备高压液相色谱以乙腈与水混合溶剂为流动相进行梯度洗脱；所述流动相的流速优选为15～25mL/min，更优选为18～22mL/min，再优选为20mL/min；所述乙腈与水的体积比为(30～50)：(70～50)；在本发明中，以体积百分比计，以乙腈为流动相A，水为流动相B，所述梯度洗脱的程度优选具体为：

0～18min，流动相A从28％～32％升至33％～37％；

18～45min，流动相A从33％～37％升至38％～42％；

45～55min，流动相A从38％～42％升至43％～47％；

55～60min，流动相A从43％～47％升至48％～52％；

60～70min，流动相A保持48％～52％；

70～75min，流动相A从48％～52％降至28％～32％；

75～90min，流动相A保持28％～32％；

更优选具体为：

0～18min，流动相A从30％升至35％；

18～45min，流动相A从35％升至40％；

45～55min，流动相A从40％升至45％；

55～60min，流动相A从45％升至50％；

60～70min，流动相A保持50％；

70～75min，流动相A从50％降至30％；

75～90min，流动相A保持30％。

所述半制备高压液相色谱的检测波长优选为203nm；经半制备高压液相色谱分离收集单独出峰的流份，得到化合物3。

本发明对三七总皂苷进一步分离研发，获得一种新颖的皂苷单体，部分结构在心血管方面的作用接近上市的血塞通药物或者主要含量单体，部分结构甚至优于现有的三七总皂苷药物及单体。

本发明还提供了一种式(I)所示的皂苷单体化合物在制备治疗和/或预防缺血性心脑血管疾病药物中的应用；所述缺血性心脑血管疾病优选包括缺血性脑中风、脑梗塞与脑偏瘫中的一种或多种。

本发明还提供了一种药物组合物，包括式(I)所示的皂苷单体化合物中的一种或多种；优选还包括药学上可接受的辅料；所述药物组合物的给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等；所述药物组合物的剂型可为片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、丸剂、滴丸、注射液、冻干粉针剂、口服液、贴剂、膏剂、巴布剂或缓释制剂、控释制剂注射剂、片剂、口服液、胶囊、软胶囊、滴丸、缓释制剂或控释制剂。

所述药学上可接受的辅料为本领域技术人员熟知的辅料即可，并无特殊的限制。

为了将本发明药物组合物制成胶囊剂，可以将本发明药物组合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将本发明药物组合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。

为将本发明药物组合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇、聚乙二醇或它们的混合物作溶剂，并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是乙醇、异丙醇、丙二醇、聚乙二醇、泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化物等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。此外，如需要也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

本发明还提供了一种血塞通药物，包括式(I)所示的皂苷单体化合物中的一种或多种。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种皂苷单体化合物、其分离方法及在制备血塞通药物中的应用进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售，如无特殊说明，实施例均在室温条件下进行。

仪器与材料

仪器

材料

本发明产品所用的三七总皂苷(供口服用)由昆药集团股份有限公司生产，质量标准符合药典2020标准。分离用D101大孔吸附树脂为沧州宝恩吸附材料科技有限公司产品；反相C18制备色谱柱为苏州纳微科技股份有限公司产品；反相柱层析所用水为去离子水，乙腈为制备级。

实施例1

1.1提取分离

取三七总皂苷(供口服用)500g溶解于3000ml水中，上D101大孔吸附树脂(装柱2500ml)，分别以水、30％乙醇、75％乙醇洗脱6BV柱体积，收集75％乙醇洗脱液，浓缩至干，得到三七二醇皂苷266g。

取三七二醇皂苷266g，以10％乙腈水溶液2200ml溶解，过中高压制备色谱，色谱条件：乙腈/水，体积比30～50：70～50(溶剂梯度洗脱程序如下表所示)，流速：400mL/min，检测波长203nm；色谱柱：C18(10μm)填料，装柱3.5Kg。多次上样洗脱，并收集流份，得到Fr.A(174g)与Fr.B(26g)。

取Fr.A，以20％乙腈水溶液1000ml溶解，过高压半制备色谱，色谱条件：乙腈/水，体积比28～50：72～50(溶剂梯度洗脱程序如下表所示)，流速：25mL/min，检测波长203nm；制备色谱柱：C18(10μm)，50×250mm。多次上样洗脱，并收集流份得305mg化合物1和220mg化合物2。

取Fr.B，以23％乙腈水溶液200ml溶解，过高压半制备色谱，色谱条件：乙腈/水，体积比30～50：70～50(溶剂梯度洗脱程序如下表所示)，流速：20mL/min，检测波长203nm；制备色谱柱：C18(10μm)，50×250mm。多次上样洗脱，并收集流份得化合物3(67mg)。

1.2结构鉴定

化合物1：为白色粉末，(+)-ESI-MS m/z:1108.80[M+H]+，确定分子式为C₅₄H₉₂O₂₃；

利用核磁共振对实施例1中得到的化合物1进行分析，得到其核磁共振氢谱图如图1所示；得到其核磁共振碳谱图如图2所示。

由图1与图2可知：

¹H-NMR(300MHz,DMSO),δ(ppm):5.60(s,1H),5.40(s,3H),5.20(s,1H),4.88(s,3H),4.77(s,3H),4.71(s,4H),4.14(s,1H),3.94(s,4H),3.90(s,5H),3.80(s,1H),3.70(s,2H),3.60(s,7H),3.57-3.51(m,8H),3.44(s,1H),3.30(s,1H),3.04(s,1H),1.94(s,2H),1.82(s,3H),1.70(s,3H),1.70-1.45(m,2H),1.66-1.41(m,2H),1.62-1.38(m,2H),1.56-1.32(m,2H),1.50-1.26(m,2H),1.41(s,1H),1.38(s,2H),1.20(s,3H),1.04(s,1H),0.94(s,2H),0.89(s,12H),0.84(s,3H)。

¹³C-NMR(300MHz,DMSO),δ(ppm):131.3,124.7,112.5,110.4,105.6,92.5,90.3,83.9,83.1,81.5,79.6,76.8,76.0,74.4,74.1,71.8,71.5,69.8,62.5,62.2,56.1,55.6,50.4,49.8,48.5,40.7,39.1,38.7,38.1,36.1,35.2,31.9,26.8,25.5,24.6,23.9,23.7,22.8,18.8,18.6,18.5,16.1。

¹H-NMR谱中显示化合物有8个甲基质子信号δH0.84(3H,s),0.89(12H,s),1.20(3H,s),1.70(3H,s)和1.82(3H,s)提示为三萜类化合物；1个双键次甲基信号δH5.20(1H,s)以及4个糖端基质子信号δH 5.60(1H,s)，5.40(3H,s)。13C-NMR谱中给出54个碳信号，包括8个甲基信号δC 16.1(C-29),18.5(C-30),18.6(C-27),18.8(C-18),24.6(C-26),31.9(C-28)；1对双键碳信号δH 124.7(C-24)和131.3(C-25)以及4个糖基的端基碳信号δC 105.9(C-1′)，110.4(C-1″)，92.5(C-1″′)，112.5(C-1″″)，应为化合物1是1个连有4个葡萄糖基的三萜皂苷。其他位置¹H-和¹³C-NMR数据与文献报道的Rb1基本一致，差别在于20位糖的连接位置的变化，人参皂苷Rb1的20位糖的连接位置为1-6取代，而化合物1的20位的连接位置为1-4取代，鉴定化合物1为异人参皂苷Rb1-I。

异人参皂苷Rb1-I。

化合物2：为白色粉末，(+)-ESI-MS m/z:1108.82[M+H]+，确定分子式为C₅₄H₉₂O₂₃。

利用核磁共振对实施例1中得到的化合物2进行分析，得到其核磁共振氢谱图如图3所示；得到其核磁共振碳谱图如图4所示。

由图3与图4可知：

¹H-NMR(300MHz,DMSO),δ(ppm):5.40(s,4H),5.20(s,1H),4.88(s,3H),4.77(s,4H),4.71(s,3H),4.14(s,1H),3.94(s,4H),3.90(s,3H),3.80(s,2H),3.70(s,2H),3.60(s,5H),3.57-3.51(m,8H),3.44(s,1H),3.40(s,1H),3.30(s,1H),3.04(s,1H),1.94(s,2H),1.90-1.65(m,2H),1.82(s,3H),1.70(s,3H),1.70-1.45(m,2H),1.66-1.41(m,2H),1.62-1.38(m,2H),1.38(s,2H),1.56-1.32(m,4H),1.50-1.26(m,2H),1.41(s,1H),1.20(s,3H),1.04(s,1H),0.94(s,2H),0.89(s,12H),0.84(s,3H)。

¹³C-NMR(300MHz,DMSO),δ(ppm):131.3,124.7,110.7,110.4,105.6,92.5,90.3,87.7,83.1,81.8,81.5,79.6,76.8,74.7,74.1,72.2,71.5,69.8,69.6,62.5,62.2,55.6,51.6,50.4,49.8,48.5,40.7,39.1,38.7,38.1,36.1,35.2,31.9,26.8,25.5,24.6,23.9,23.7,22.8,18.8,18.6,18.5,16.1。

¹H-NMR谱中显示该化合物有8个甲基信号δH 0.84(3H,s),0.89(12H,s),1.20(3H,s),1.70(3H,s)和1.82(3H,s)提示为三萜类化合物；1个双键次甲基信号δH 5.20(1H,s)以及4个糖端基质子信号δH 5.40(4H,s)。13C-NMR谱中给出54个碳信号，包括8个甲基信号δC16.1(C-29),18.5(C-30),18.6(C-27),18.8(C-18),24.6(C-26),31.9(C-28)；1对双键碳信号δH 124.7(C-24)和131.3(C-25)以及4个糖基的端基碳信号δC 105.6(C-1′)，110.4(C-1″)，92.5(C-1″′)，110.7(C-1″″)，结合1H-和13C-NMR数据，应该化合物2是1个连有4个葡萄糖基的三萜皂苷，其NMR数据与人生皂苷Rb1非常相似，差别在于3位连接的糖的位置不一样，Rb1的3位糖的连接位置为1-2位连接，而化合物2的3位糖的连接位置1-3连接，故鉴定化合物2为异人参皂苷Rb1-II。

异人参皂苷Rb1-II

化合物3：为类白色粉末，(+)-ESI-MS m/z:784.9[M+H]+，确定分子式为C₄₂H₇₂O₁₃。

利用核磁共振对实施例1中得到的化合物3进行分析，得到其核磁共振氢谱图如图5所示；得到其核磁共振碳谱图如图6所示。

由图5与图6可知：

¹H-NMR(300MHz,DMSO),δ(ppm):5.40(s,2H),5.20(s,9H),4.88(s,1H),4.77(s,3H),4.71(s,2H),4.14(s,1H),3.94(s,2H),3.90(s,3H),3.80(s,1H),3.70(s,1H),3.60(s,2H),3.57-3.51(m,4H),3.44(s,1H),3.34(s,1H),3.30(s,1H),1.94(s,2H),1.90-1.65(m,2H),1.82(s,3H),1.72-1.47(m,2H),1.70(s,3H),1.66-1.41(m,2H),1.62-1.38(m,2H),1.56-1.32(m,4H),1.50-1.26(m,2H),1.41(s,1H),1.38(s,2H),1.20(s,3H),1.04(s,1H),0.94(s,2H),0.89(s,12H),0.84(s,3H)。

¹³C-NMR(300MHz,DMSO),δ(ppm):131.3,124.7,110.4,105.4,90.3,83.1,81.5,79.6,78.6,76.8,74.7,74.1,71.5,69.8,62.5,62.2,59.4,55.3,51.6,49.8,48.4,40.7,38.8,38.4,38.1,36.1,35.2,31.9,27.4,26.8,24.6,23.9,23.4,22.8,18.8,18.6,18.5,16.1。

¹H-NMR谱中显示该化合物有8个甲基质子信号δH 0.84(3H,s),0.89(12H,s),1.20(3H,s),1.70(3H,s)和1.82(3H,s)，提示该化合物为三萜类化合物；从氢谱中还能够观察到1个双键次甲基质子信号δH 5.20(1H,s)以及2个糖端基质子信号δH 5.40(2H,s)，提示化合物结构中含有双键以及2分子的糖。13C-NMR谱中给出42个碳信号，包括8个甲基信号δC16.1(C-29),18.5(C-30),18.6(C-27),18.8(C-18),24.6(C-26),31.9(C-28)；1对双键碳原子信号δC 124.7(C-24)和131.3(C-25)以及2个糖基的端基碳信号δC 105.9(C-1′)，110.4(C-1″)，与化合物Rb1比较，其¹H-和¹³C-NMR数据几乎一致，差别在于缺少3位糖取代，以及20位的糖的连接位置从变化，人参皂苷Rb120位糖的连接位置为1-6取代，而化合物4的20位的连接位置为1-4取代，应为化合物4是连有2个葡萄糖基的三萜皂苷，鉴定为3-去葡糖基-异人参皂苷Rb1。

3-去葡糖基-异人参皂苷Rb1

实施例2：对小鼠局灶永久性脑缺血的影响

2.1实验材料

2.1.1样品

受试物：

本发明化合物1～化合物3，含量均大于98％。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

三七总皂苷，来源：本发明产品所用的三七总皂苷(供口服用)由昆药集团股份有限公司生产，质量标准符合药典2020标准。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

Rb1、Rg1含量均＞98％，来源：商业购得。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

溶媒对照：

氯化钠注射液，规格：250mL/瓶，四川科伦药业股份有限公司，批号：N21011602A。

2.1.2动物

SPF级ICR小鼠，雄性，3～5周龄，体重25～28g，由昆药集团股份有限公司动物室提供，生产许可证：SCXK(滇)2019-0001，发证机关：昆明市科学技术局；使用许可证：SYCK(滇)K2019-0001，发证单位：昆明市科学技术局。饲养于IVC动物实验室，温度20～25℃(日温差≤3℃)，湿度40％～70％，照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx，噪音≤60dB，实验动物使用许可证：SYXK(滇)2009-0001，发证单位：昆明市科学技术局；PVC透明塑料盒群养，每箱≤6只，每日喂饲鼠用配合饲料，自由饮水，视情况更换笼具和垫料，饲料来源于江苏省协同医药生物工程有限责任公司，许可证号：苏饲证(2014)01008。

2.1.3主要仪器

AC211S电子分析天平，Sartorius；LT2000B型电子天平，常熟市天量仪器有限责任公司；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；Biofuge冷冻高速离心机，Thermo；HHS-1型恒温水浴箱，金坛市大地自动化仪器厂；容量瓶、剪刀、弯镊、止血钳、动脉夹，国产；线栓，北京西浓。

2.1.4主要试剂

水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司出品，批号：20081027；使用时，用氯化钠注射液配制成4％浓度。

2.2实验方法及结果

参考Koizum线栓法，选择25～28g雄性ICR小鼠，以4％的水合氯醛腹腔注射麻醉(400mg/kg.bw)后，切开右侧颈部皮肤，分离、结扎右侧颈总动脉近心端及颈外动脉。于颈内动脉(ICA)处放置动脉夹，在颈总动脉分叉处的近端2～3mm处切口，插入线栓，线栓进入ICA、穿过大脑中动脉(MCA)起始端至大脑前动脉近端，阻断MCA的所有血流来源。结扎备线并缝合皮肤，待动物完全清醒后评分按层分为7组：模型、化合物1、化合物2、化合物3、络泰、Rg1、Rb1，每组10只，另设1假手术组，共8组动物。假手术组除不插管外，其余操作同造模动物。各组动物于造模后每天腹腔注射给药一次，容积均为20mL/kg，模型组及假手术组注射同容积的氯化钠注射液。观察并计算小鼠的存活时间及与模型组小鼠比较存活时间的延长率，得到结果见表1。

存活时间＝死亡时间-造模时间。

延长率＝(给药组存活时间－模型存活时间)/模型组存活时间*100。

表1显示，与假手术组(存活时间均长于8天，以8天计)相比，模型组小鼠存活时间明显缩短(p<0.01)，提示造模成功；与模型组相比，给药组均能明显延长永久性脑缺血小鼠的存活时间(p<0.05或p<0.01)，而X对小鼠存活时间的延长率最高。

表1系列样品对局灶性永久脑缺血小鼠存活时间的影响

与假手术组相比较：^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组相比较：*P<0.05，**P<0.01。

实施例3：对小鼠局灶缺血再灌注模型的影响

3.1实验材料

3.1.1样品

受试物：

本发明化合物2，含量大于98％。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

三七总皂苷，来源：本发明产品所用的三七总皂苷(供口服用)由昆药集团股份有限公司生产，质量标准符合药典2020标准。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

Rb1、Rg1含量均＞98％，来源：商业购得。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

溶媒对照：

氯化钠注射液，规格：250mL/瓶，四川科伦药业股份有限公司，批号：N21011602A。

3.1.2动物

SPF级ICR小鼠，雄性，体重25～28g，由昆药集团股份有限公司动物室提供，生产许可证：SCXK(滇)2019-0001，发证机关：昆明市科学技术局；使用许可证：SYCK(滇)K2019-0001，发证单位：昆明市科学技术局。饲养于IVC动物实验室，温度20～25℃(日温差≤3℃)，湿度40％～70％，照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx，噪音≤60dB，实验动物使用许可证：SYXK(滇)2009-0001，发证单位：昆明市科学技术局；PVC透明塑料盒群养，每箱≤6只，每日喂饲鼠用配合饲料，自由饮水，视情况更换笼具和垫料，饲料来源于江苏省协同医药生物工程有限责任公司，许可证号：苏饲证(2014)01008。

3.1.3主要仪器

AC211S电子分析天平，Sartorius；LT2000B型电子天平，常熟市天量仪器有限责任公司；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；Biofuge冷冻高速离心机，Thermo；HHS-1型恒温水浴箱，金坛市大地自动化仪器厂；容量瓶、剪刀、弯镊、止血钳、动脉夹，国产；线栓，北京西浓。

3.1.4主要试剂

水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司出品，批号：20081027；使用时，用氯化钠注射液配制成4％浓度。

Na₂HPO₄·12H₂O，国药集团化学试剂有限公司，批号：20121120；NaH₂PO₄·2H₂O，天津市风船化学试剂有限公司，批号：20120202。磷酸盐缓冲液(PH＝7.6)配制：称取12.463gNa₂HPO₄·12H₂O、0.8112g NaH₂PO₄·2H₂O加入双蒸水定溶至200mL冷藏保存。

红四氮唑(TTC)，中国医药集团上海化学试剂公司，批号：20120315。实验时，称取1.20g红四氮唑加入100mL磷酸盐缓冲液，配制成1.2％TTC，避光保存、现配现用。

丙二醛(MDA)测试盒，TBA法测定，批号：20121208；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，羟胺法测定，批号：20121208；均购自南京建成生物工程有限公司。

3.2实验方法及结果

25～28g雄性ICR小鼠，随机分为6组，分别为假手术组、模型组、化合物2、络泰、Rb1、Rg1，每组10只，各组给药体积均为20mL/kg。参考Koizum线栓法，将小鼠以4％的水合氯醛腹腔注射麻醉(400mg/kg.bw)后，切开右侧颈部皮肤，分离、结扎右侧颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉。在颈内动脉(ICA)近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入线栓，栓线进入ICA、穿过大脑中动脉(MCA)起始端至大脑前动脉近端，阻断MCA的所有血流来源。假手术组只切开右侧颈部皮肤，分离血管，结扎备线并缝合皮肤。2小时后，静脉给予各组药物后拔出尼龙线，使其血流再通，并缝合皮肤，将手术大鼠分笼放回笼内饲养，模型组及假手术组注射相同容积的氯化钠注射液。并于再灌注后24h后，摘眼球采血，3000rpm离心15分钟，取血清-20℃冷冻保存，严格按照试剂盒说明书操作，测定MDA、SOD；取脑后将大脑平均冠状分为4片，放于1.2％TTC溶液中，37℃避光温育15min染色，梗死区不着色，正常脑组织染成红色，分别称量全脑重量和梗死部分重量，计算梗死区重量占全脑重量的百分率，得到结果见表2。

由表2可见，模型组小鼠手术24h脑梗死百分率与假手术组相比具有非常显著性差异(p<0.01)，说明造模成功；给药组对小鼠脑梗死百分率均有显著的降低作用(p<0.05或p<0.01)，X组对小鼠脑梗死百分率的改善作用优于络泰组，但与络泰组相比不具有显著性差异(p>0.05)。

与假手术组相比，模型组血清中SOD活力明显降低、MDA含量明显升高，并具有非常显著性差异(p<0.01)，提示模型小鼠体内抗氧化能力降低；与模型组相比，除Rb1外，各给药组血清中SOD活力均明显升高(p<0.05)，尤以X最显著；除X对血清MDA有显著降低外外(p<0.05)，其余给药组对MDA含量仅有下降趋势，提示X的抗氧化活性优于络泰。

3.3统计学处理

采用SPSS17.0软件，计量资料用平均数±标准差表示，方差齐进行t检验，方差不齐进行t’检验，偏态分布用非参数秩和检验。P<0.05有统计学意义，P<0.01有显著统计学意义。

表2系列样品对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠脑梗死百分率及部分生化指标的影响

与假手术组相比较：^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组相比较：*P<0.05，**P<0.01。

实施例4：对小鼠全脑缺血模型的影响

4.1实验材料

4.1.1样品

受试物：

本发明化合物2，含量大于98％。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

三七总皂苷，来源：本发明产品所用的三七总皂苷(供口服用)由昆药集团股份有限公司生产，质量标准符合药典2020标准。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

Rb1、Rg1含量均＞98％，来源：商业购得。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

溶媒对照：

氯化钠注射液，规格：250mL/瓶，四川科伦药业股份有限公司，批号：N21011602A。

4.1.2动物

SPF级ICR小鼠，雄性，体重25～28g，由昆药集团股份有限公司动物室提供，生产许可证：SCXK(滇)2019-0001，发证机关：昆明市科学技术局；使用许可证：SYCK(滇)K2019-0001，发证单位：昆明市科学技术局。饲养于IVC动物实验室，温度20～25℃(日温差≤3℃)，湿度40％～70％，照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx，噪音≤60dB，实验动物使用许可证：SYXK(滇)2009-0001，发证单位：昆明市科学技术局；PVC透明塑料盒群养，每箱≤6只，每日喂饲鼠用配合饲料，自由饮水，视情况更换笼具和垫料，饲料来源于江苏省协同医药生物工程有限责任公司，许可证号：苏饲证(2014)01008。

4.1.3主要仪器

AC211S电子分析天平，Sartorius；LT2000B型电子天平，常熟市天量仪器有限责任公司；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；Biofuge冷冻高速离心机，Thermo；HHS-1型恒温水浴箱，金坛市大地自动化仪器厂；容量瓶、剪刀、弯镊、止血钳、动脉夹，国产。

4.1.4主要试剂

水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司出品，批号：20081027；使用时，用氯化钠注射液配制成4％浓度。

4.2实验方法及结果

选25～28g雄性小鼠，按体重随机分为6组：假手术组、模型组、化合物2、络泰、Rb1、Rg1，每组10只，各组动物每日按剂量灌胃给药1次，连续7日；假手术组和模型组给予氯化钠注射液，容积均为20mL/kg。末次给药后30min，小鼠以400mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰位固定，行颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，下穿手术线，同时阻断双侧颈总动脉血流。造模完成缝合伤口，将小鼠放回笼饲养，观察2小时内存活时间，大于2h以2h计，结果见表3。

结果显示，与假手术组(存活时间均长于2h，以2h计)相比，模型组小鼠存活时间明显缩短(p<0.01)，提示造模成功；与模型组相比，给药组均能明显延长全脑缺血小鼠存活时间(p<0.05或p<0.01)，X对小鼠存活时间的延长率最高。

表3系列样品对全脑缺血小鼠存活时间的影响

与对假手术组相比，^▲/▲▲P＜0.05/0.01；与模型组相比*^/**P＜0.05/0.01。

实施例5：对小鼠断头后张口喘气时间的影响

5.1实验材料

5.1.1样品

受试物：

本发明化合物2，含量均大于98％。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

三七总皂苷，来源：本发明产品所用的三七总皂苷(供口服用)由昆药集团股份有限公司生产，质量标准符合药典2020标准。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

Rb1、Rg1含量均＞98％，来源：商业购得。实验时，用氯化钠注射液配制成相应浓度的溶液供动物注射用。

溶媒对照：

氯化钠注射液，规格：250mL/瓶，四川科伦药业股份有限公司，批号：N21011602A。

5.1.2动物

SPF级ICR小鼠，雄性，3～5周龄，体重25～28g，由昆药集团股份有限公司动物室提供，生产许可证：SCXK(滇)2019-0001，发证机关：昆明市科学技术局；使用许可证：SYCK(滇)K2019-0001，发证单位：昆明市科学技术局。饲养于IVC动物实验室，温度20～25℃(日温差≤3℃)，湿度40％～70％，照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx，噪音≤60dB，实验动物使用许可证：SYXK(滇)2009-0001，发证单位：昆明市科学技术局；PVC透明塑料盒群养，每箱≤6只，每日喂饲鼠用配合饲料，自由饮水，视情况更换笼具和垫料，饲料来源于江苏省协同医药生物工程有限责任公司，许可证号：苏饲证(2014)01008。

5.1.3主要仪器

AC211S电子分析天平，Sartorius；LT2000B型电子天平，常熟市天量仪器有限责任公司；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；HHS-1型恒温水浴箱，金坛市大地自动化仪器厂；容量瓶、剪刀、弯镊、止血钳。

5.1.4主要试剂

水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司出品，批号：20081027；使用时，用氯化钠注射液配制成4％浓度。

5.2实验方法及结果

选25～28g雄性小鼠，按体重随机分为5组：空白组、化合物2、络泰、Rb1、Rg1，每组10只，各组动物每日按剂量灌胃给药1次，连续7日；空白组给予氯化钠注射液，容积均为20mL/kg。末次给药后30min，将小鼠逐只断头，立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止时间作为耐缺氧指标，观察药物对脑缺氧的保护作用。根据小鼠断头后喘气时间的长短，以空白对照组为参照，判断药物是否能延长小鼠断头后张口呼吸时间，表现出对完全性缺血/缺氧的对抗作用及其作用强弱，得到结果见表4。

结果显示，与空白组相比，除Rg1组，其余给药组均能延长断头小鼠张口时间(p<0.05或p<0.01)，其中X能非常显著延长小鼠张口时间(p<0.01)。

表4系列样品对小鼠断头后张口呼吸时间的影响

与空白组相比，*^/**P＜0.05/0.01。