壳聚糖及其衍生物在消减土壤中抗生素抗性基因污染中的应用
阅读说明：本技术 壳聚糖及其衍生物在消减土壤中抗生素抗性基因污染中的应用 (Application of chitosan and derivatives thereof in reducing antibiotic resistance gene pollution in soil ) 是由 宋嘉劲 方华 张厚朴 于 2021-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了壳聚糖及其衍生物在消减土壤中抗生素抗性基因污染中的应用,根据土壤的实际情况,直接投加适当比例的壳聚糖及其衍生物于土壤中,操作简单快捷,且可显著降低土壤中多类抗生素抗性基因的丰度,为控制土壤中的ARGs污染提供新的、有效的途径,应用前景广阔。(The invention discloses application of chitosan and derivatives thereof in reducing antibiotic resistance gene pollution in soil, according to the actual condition of the soil, chitosan and derivatives thereof in a proper proportion are directly added into the soil, the operation is simple and rapid, the abundance of various antibiotic resistance genes in the soil can be obviously reduced, a new and effective way is provided for controlling the ARGs pollution in the soil, and the application prospect is wide.)
技术领域
本发明涉及环境工程技术领域，特别是涉及壳聚糖及其衍生物消减土壤中抗生素抗性基因污染的应用。
背景技术
环境中抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)对生态环境和人类健康过程潜在风险，已被公认为一种新兴环境污染物。大量研究发现一些临床致病菌中，ARGs来源于环境中的非致病性细菌，其借助质粒、转座子等可移动遗传元件进行水平基因转移进行传播和扩散。
土壤是环境中ARGs的重要储存库，而人类活动带入的外源ARGs是土壤中ARGs的主要来源，例如在畜牧业中常使用抗生素作为饲料添加而被广泛用于促进动物生长和治疗疾病，但抗生素进入动物体内后不能被完全吸收，会随粪便排出体外，造成畜禽粪便中往往含有抗生素及ARGs。为提高作物产量，畜禽粪便作为有机肥被大量施用到农业土壤中，导致抗生素在土壤中持续残留，直接造成土壤中ARGs的多样性增加和丰度升高。此外，污水处理厂的污泥和出水中含有数百种不同类型的ARGs，这些ARGs随着污泥施用和污水灌溉等措施进入农业土壤。多项研究已对全球多地耕地土壤中ARGs总体格局进行研究，均发现ARGs检出率高，类别多样化，且丰度较高，特别是磺胺类抗性基因(sul1等)、四环素类抗性基因(tetM、tetW等)等ARGs的污染情况严重，且已证实ARGs污染的热点地区主要是人类活动活跃的农业种植区域。
土壤中的细菌群落是ARGs的进化起源之一，ARGs可以在环境细菌和临床病原体之间通过水平基因转移进行迁移传播。并且，多种ARGs可以在农业土壤中种植的蔬菜的不同部位检测到，能通过食物链的迁移对人体产生潜在危害，其产生的抗生素耐性严重降低临床药物的使用效果及缩小了用药选择范围，从而威胁人类健康。
现有技术对ARGs这类污染的控制策略不多，例如对于施用到土壤中的粪肥或污泥主要进行好氧堆肥或者厌氧消化处理，以期从源头上减少ARGs，但对于已经进入土壤乃至积累多代的ARGs，只能通过添加土壤改良剂来进行消减。目前发现的土壤改良剂种类较少，且并不是所有的土壤改良剂都具有消减ARGs污染的正面效果。
发明内容
针对现有技术问题，本发明将壳聚糖及其衍生物作为土壤改良剂作用于抗生素抗性基因污染的土壤中，能够大幅度消减土壤抗生素抗性基因污染。
本发明中，壳聚糖及其衍生物在消减土壤中抗生素抗性基因污染中的应用。
具体地，所述壳聚糖及其衍生物在降低土壤中抗生素抗性基因丰度中的应用。其中，基因丰度指基因组中各类抗生素抗性基因的拷贝数量，丰度越高，即该基因的数量越多。丰度包括绝对丰度和相对丰度，其中相对丰度用于描述单个基因数占总基因数的百分比。
可选的，壳聚糖衍生物包括羧化壳聚糖、羟化壳聚糖、壳聚糖盐类、壳寡糖。
可选的，所述羧化壳聚糖为羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖；所述羟化壳聚糖为羟甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、甲基乙二醇壳聚糖；所述壳聚糖盐类为壳聚糖乳酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖硝酸盐、壳聚糖硫酸盐、壳聚糖醋酸盐、壳聚糖柠檬酸盐、壳聚糖琥珀酸盐、壳聚糖谷氨酸盐、壳聚糖酒石酸盐、壳聚糖乙酰水杨酸盐；所述壳寡糖为由壳聚糖降解得到的寡糖产品。
可选的，所述抗生素抗性基因为二氨基嘧啶类、磷霉素类、核苷类、大环内酯类-林可霉素类-链阳性菌素B类(MLSB类)、糖肽类、四环素类、氯霉素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、利福霉素类、氨基香豆素类、磺胺类和肽类。
可选的，所述应用包括：将壳聚糖及其衍生物添加于待处理土壤中。
可选的，所述壳聚糖及其衍生物的添加量为20～50g/kg土壤干重。
可选的，所述壳聚糖及其衍生物的添加量为30g/kg土壤干重。
可选的，所述壳聚糖及其衍生物以粉末状添加于土壤中。
可选的，所述壳聚糖及其衍生物脱乙酰度≥95％，粘度<200mPa·s，分子量在10000～50000Da。
本发明使用的壳聚糖及其衍生物购自西亚化学科技(山东)有限公司，其中壳聚糖由阿拉斯加深海雪蟹经脱钙、脱蛋白、脱色、脱乙酰等工艺加工而成，为类白色至黄褐色粉末。
本发明提供了壳聚糖及其衍生物的一种新用途，其在消减土壤中抗生素抗性基因污染中具有良好的应用，可显著降低多种抗生素抗性基因的丰度，为控制土壤中ARGs污染提供了理想的途径。
附图说明
图1为壳聚糖(添加比例为30g/kg土壤干重)对各类型抗生素抗性基因的影响结果图；
图2为壳聚糖处理后各类型抗生素抗性基因消减率图。
图3为羧甲基壳聚糖处理后各类型抗生素抗性基因消减率图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但本发明不仅限于此。
实施例1
本发明通过在实验室内模拟试验来验证和评价壳聚糖在控制土壤中抗生素基因污染的应用效果，具体操作步骤如下：
土壤的采集
试验所用土壤于2020年9月采集自中国浙江省嘉兴市一处具有多年禽畜粪肥施用历史的规模化蔬菜种植设施基地，采用五点取样法，去除表层凋落物后采集0～15cm的表层土壤。总共采集40kg土壤并迅速转移至实验室，去除植物残余物和石块，进行风干，随后过2mm筛，获得样本土壤。在样本土壤中加入30g/kg土壤干重的鸡粪肥混合均匀，以模拟一种常见的土壤改良方式，其可能向土壤中带入多种ARGs。调节土壤含水量为最大持水量的60％，置于人工气候箱，在25℃、70％湿度条件下培养7天，待用。
微宇宙试验
称取500.0g(干重)上述待用土壤于白瓷盘中，将壳聚糖(西亚化学科技(山东)有限公司)均匀撒至土壤中并不断搅拌，使土壤中壳聚糖含量达到30g/kg土壤干重，然后喷赛适量无菌水，调节土壤含水量至最大持水量的60％，以不加壳聚糖组为对照。将土壤分为等质量的3份(每份干重150.0g，剩余土壤于-20℃冰箱留存)，转移至已编号的聚乙烯盆中(内口径10cm，高9cm，底部直径6.5cm)，用锡箔纸覆盖盆口，并扎5个1mm孔，置于人工气候箱，在25℃、70％湿度条件下进行黑暗培养90天，获得的土壤样品置于-20℃保存。黑暗培养过程中每两天采用土壤称重法监测土壤含水量，并加入适量的无菌水以保持土壤含水量恒定。
土壤总DNA提取及质量检测
取0.5g土壤样品，采用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒提取土壤总DNA，具体步骤参考试剂盒说明书，提取的DNA样品保存于-20℃冰箱备用。使用Qubit荧光定量仪测定土壤DNA样品的浓度，同时采用凝胶电泳方法检测DNA样品的完整性与纯度，琼脂糖浓度为1％，Marker为Trans 15K plus，样品上样量为1μL，电压为100V，电泳时间为40min。结果表明DNA样品可以用于宏基因组建库和测序分析。
宏基因组文库构建及测序
采用UltraTMDNA文库制备试剂盒构建DNA测序文库。用超声波破碎仪将土壤总DNA随机打断成长度为350bp片段。
进行末端修复，将55.5μLDNA片段(约1μg)，3.0μL末端修复酶，末端修复反应缓冲液(10X)加入管中，置于热循环仪，设置热盖温度≥75℃，反应步骤为20℃保持30分钟，65℃保持30分钟，4℃保存。
进行接头连接，将15μl Blunt/TA连接酶，1μL连接增效剂，2.5μLNEBNext接头加入到末端修复反应混合物中，在热循环仪中20℃孵育15分钟，再向混合体系中加入3μLUSER酶，混合均匀后在37℃下孵育15分钟，热盖温度≥47℃。
进行核酸片段大小筛选，加入13.5μL蒸馏水及40μLAMPure XP磁珠至连接反应体系中。混合均匀，在室温下孵育5分钟。将管子放在磁力架上，使上清液与磁珠分离。5分钟后，小心将含有DNA的上清液转移到新管中，同时丢弃含有较大DNA片段的磁珠，再重新加入20μLAMPure XP磁珠。混合均匀，在室温下孵育5分钟。将管子放在磁力架上5分钟，使上清液与磁珠分离。5分钟后，小心去除包含非目标大小DNA片段的上清液。在磁力架上，向管中加入200μL80％乙醇。在室温下孵育30秒，吸弃上清液，重复一次上述步骤，最后开盖晾干磁珠5分钟。将管子从磁力架上取下，将符合目标大小的DNA从磁珠中洗脱至17μL10 mMTris-HCl中，并用旋涡仪混合均匀，在室温下孵育2分钟。将管子置于磁力架上，5分钟后，将15μL液体转入新的PCR管中进行扩增。
进行PCR扩增，将15μL接头连接片段，25μLNEBNext Q5 Hot Start HiFi PCRMaster Mix，10μLIndex/通用引物加至PCR管中(总体积50μl)。PCR反应条件为98℃预变性30秒；98℃变性10秒；65℃退火/延伸75秒，重复4个循环；65℃最终延伸5分钟；4℃保存。
进行PCR扩增产物纯化，在PCR反应体系中加入45μL(0.9X)AMPure XP珠粒。混合均匀，室温下孵育至少5分钟。将管子置于磁力架上，使上清液与磁珠分离。5分钟后，小心吸弃上清液。在磁力架上，向管中加入200μL80％乙醇。在室温下孵育30秒，然后小心吸弃上清液，再重复洗涤一次。管子置于磁力架上，开盖晾干磁珠5分钟。从磁力架上取下管子，加入33μL0.1×TE洗脱磁珠中的DNA。用旋涡仪混匀，室温下孵育2分钟。将管子置于磁力架上，5分钟后将其中28μL液体转入新PCR管中，于-20℃保存。最后，使用安捷伦2100芯片生物分析仪来确认文库中DNA片段大小范围。
最后，在IlluminaNovaSeq测序仪中采用PE 150测序策略对构建文库进行宏基因组测序。
其中，文库构建涉及的接头序列由“锚定序列+index+引物”组成，包括两条(序列如下)，其中下划线为锚定序列，非下划线为引物序列：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(index)TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO：1)
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(index)ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(SEQ ID NO：2)
测序数据分析及ARGs控制效果评价
对于测序下机的宏基因组原始序列数据，使用fastp软件进行质控。随后采用BLASTX将序列比对到抗生素抗性基因数据库(The Comprehensive AntibioticResistance Database,CARD)，比对参数E-value设置为1e-5，max_target_seqs设置为1。采用自定义python脚本去除比对结果中相似度低于80％和联配长度小于25个氨基酸的序列，过滤后得到ARGs相似序列集合。最后，采用自定义python脚本计算ARGs相对丰度，并对ARGs的耐药类别进行分类，统计壳聚糖处理对土壤中各类型ARGs污染的控制效果。
ARGs相对丰度(ppm)计算公式如下：
其中：NARGs相似序列为符合比对筛选参数的ARGs相似序列数目；N序列总数为测序数据总数；n为归类到特定抗生素类型的ARGs总数。
预实验阶段对不同添加比例(20～50g/kg土壤干重)壳聚糖及其衍生物处理下ARGs污染的控制效果进行了初步探究，定量分析土壤中几种典型ARGs，发现添加比例为20～50g/kg土壤干重的壳聚糖及其衍生物对ARGs污染均有一定消减效果，综合考虑消减效率及材料成本，尤以比例为30g/kg土壤干重的壳聚糖及其衍生物对于ARGs污染的控制效果最具优势，抗性基因污染消减效率最高。
结果如图1所示，与对照组相比，壳聚糖处理后的土壤中ARGs的总丰度和各类型ARGs相对丰度呈现显著下降(p<0.01)
各类型抗生素抗性基因相对丰度的下降率如图2所示，其中，二氨基嘧啶类抗生素抗性基因丰度下降100％，磷霉素类抗生素抗性基因丰度下降95.9％，核苷类抗生素抗性基因丰度下降90.2％，MLSB类抗生素抗性基因丰度下降86.4％，糖肽类抗生素抗性基因丰度下降83.2％，四环素类抗生素抗性基因丰度下降81.6％，氯霉素类抗生素抗性基因丰度下降79.3％，氨基糖苷类抗生素抗性基因丰度下降70.0％，氟喹诺酮类抗生素抗性基因丰度下降68.4％，利福霉素类抗生素抗性基因丰度下56.0％，氨基香豆素类抗生素抗性基因丰度下降43.8％，磺胺类抗生素抗性基因丰度下降28.3％，肽类抗生素抗性基因丰度下降17.9％。
试验结果表明应用添加比例为30g/kg土壤干重的壳聚糖对ARGs污染具有很强的控制效果，能够有效降低土壤中各类型抗生素抗性基因的丰度。
实施例2
本发明通过在室内模拟试验来同时验证和评价壳聚糖衍生物—羧甲基壳聚糖在控制土壤中抗生素基因污染的应用效果，具体操作步骤如下：
土壤的采集
步骤同实施例1。
微宇宙试验
除实验添加物为壳聚糖衍生物羧甲基壳聚糖，其余步骤同实施例1。
土壤总DNA提取及质量检测
步骤同实施例1。
宏基因组测序
步骤同实施例1。
测序数据分析及ARGs控制效果评价
步骤同实施例1。
结果如图1所示，与对照组相比，羧甲基壳聚糖处理后的土壤中ARGs的总丰度和各类型ARGs相对丰度呈现显著下降(p<0.05)
各类型抗生素抗性基因相对丰度的下降率如图3所示，其中，核苷类抗生素抗性基因丰度下降80.6％，氟喹诺酮类抗生素抗性基因丰度下降78.9％，二氨基嘧啶类抗生素抗性基因丰度下降70.2％，磷霉素类抗生素抗性基因丰度下降58.3％，氨基香豆素类抗生素抗性基因丰度下降51.3％，糖肽类抗生素抗性基因丰度下降34.9％，利福霉素类抗生素抗性基因丰度下降33.6％，MLSB类抗生素抗性基因丰度下降24.8％。
试验结果表明应用添加比例为30g/kg土壤干重的羧甲基壳聚糖对ARGs污染具有很强的控制效果，能够有效降低土壤中各类型抗生素抗性基因的丰度。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 壳聚糖及其衍生物在消减土壤中抗生素抗性基因污染中的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacatctcgt atgccgtctt ctgcttg 57