具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例1

本实施例制备了一种猕猴桃根提取物，具体过程为：

D1.对中华猕猴桃根进行打粉处理，过80目筛，得中华猕猴桃根干燥粉末；

D2.采用渗漉法依次石油醚、二氯甲烷洗脱，再用乙酸乙酯对中华猕猴桃根干燥粉末渗漉，收集乙酸乙酯渗漉液，其中提取过程中，石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯的流速均为4h/柱体积，乙酸乙酯的用量为8倍柱体积；

D3.用旋转蒸发仪回收步骤D2所得提取液，后用真空干燥箱干燥，得粗提物；

D4.将步骤D3所得粗提物进行硅胶柱层析，用二氯甲烷与甲醇体系洗脱，首先以50:1的比例进行洗脱(洗脱液流速1.5柱体积/h)，弃去洗脱液后，再以比例为30：1的洗脱液进行洗脱(洗脱液流速1.5柱体积/h)，所得洗脱液经薄层色谱检测、合并，除去溶剂后，得呈白色粉末状的猕猴桃根提取物。

实施例2

本实施例制备了一种化合物，具体过程为：

T1.对实施例1所得猕猴桃根提取物进行硅胶柱层析，经薄层色谱检测产物，合并相似成分，得到中间组分；其中硅胶柱层析的洗脱液比例为以8:2:2:1的体积比混合的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水，混合均匀后下层溶液分离，洗脱液流速为1.5柱体积/h；

T2.对步骤T1所得中间产物进行中压质谱液相分离，即得；其中液相为40:60体积比混合的水和甲醇；洗脱液的流速为2-5ml/min，在该范围内均可实现相似的技术效果。

本实施例所得化合物的结构式如图1所示。

试验例1

本试验例测试了实施例1所制备的猕猴桃根提取物的性能。

测试方法为质谱分析，具体检测方法为：色谱柱选择Agilent公司生产的C18色谱柱(4.6mm(直径)*250mm(长度)，5μm(填料粒径))。实验以0.12％磷酸-乙腈为流动相，乙腈比例为5％到100％，时间为40min，接着纯乙腈洗脱20min。流动相流速为1.0mL/min，柱温控制为室温，本次实验为25℃，进样量为5μL，波长选择210nm。所得质谱总离子流图如图2所示；猕猴桃根提取物组分的LC-MS分析谱图如图3所示。

根据图3所得结果，猕猴桃根提取的质谱分析数据如表1所示。

表1猕猴桃根提取物组分的LC-MS分析谱图的峰位分析结果

通过对图2～3以及表1所得结果分析，发现猕猴桃根提取物的化合物分子式多为C₃₀H₄₈O₅，其相对分子质量多在488左右，进一步的，结合文献调研，发现本发明所得猕猴桃根提取物组分的化合物多为三萜类化合物。

另外，中华猕猴桃根三萜类成分具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抑菌、降血糖、保肝等活性，其抗肿瘤作用一直是研究的热点；因此，本发明提供的猕猴桃根的乙酸乙酯提取物，可能具有抗胰腺癌的作用。

试验例2

本试验例测试了实施例1所制备的猕猴桃根提取物对MP、Patu8988t、HPAC三种胰腺癌细胞的增殖活性的抑制能力。

具体测试方法为：以细胞增殖实验(CCK8法)对本发明所得猕猴桃根提取物进行胰腺癌细胞活性评价。以MP、Patu8988t、HPAC三种胰腺癌细胞作为细胞评价模型，进行三次重复独立细胞实验。其细胞数据如表2所示下：

表2实施例1所得猕猴桃根提取物的胰腺癌细胞活性评价结果

其中，IC₅₀表示半抑制浓度，SD表示标准偏差。

由表2数据可知本发明提供的猕猴桃根提取物，对MP、Patu8988t、HPAC胰腺癌细胞均有抑制增殖的活性，且活性较强，为具有抗胰腺癌活性的化合物。

并且，由测试例1对中华猕猴桃根的乙酸乙酯提取物中主要成分的确定，结合测试例2的结果，可知本发明提供猕猴桃根提取物中的起到抗胰腺癌作用的物质基础可能是三萜类化合物群。

根据实施例1可知，实施例1步骤D1还获得了中华猕猴桃根的石油醚提取物和二氯甲烷提取物，此外，在获取乙酸乙酯提取物之后，还以步骤D1所用中华猕猴桃根为原料获取了80％乙醇提取物；本测试例还测试了上述石油醚、二氯甲烷和80％乙醇提取物对胰腺癌细胞的抑制作用，结果显示此三种提取物均对HPAC胰腺癌细胞无抑制作用。

试验例3

本测试例确定了实施例2所得化合物的确定结构式，具体测试方法包括如下步骤：

第一步，获取了实施例2所得化合物的核磁氢谱(¹HNMR谱)，结果显示：实施例2所得化合物具有四个甲基；直接与季碳相连的有三个[δ_H 1.25(3H,s,H-27),1.09(3H,s,H-25),0.88(3H,s,H-26)；δ_C 22.6(C-27),15.9(C-25),16.4(C-26)]；与叔碳直接相连的甲基有一个[δ_H 1.04(3H,d,J＝6.0Hz,H-29)；δ_C 15.38(C-29)]；

与氧相连的有一个亚甲基[δ_H 3.90(1H,d,J＝10.8Hz,H-23a),3.86(1H,d,J＝10.8Hz,H-23β)；δ_C 60.75(C-23)]和一对末端烯氢质子信号[δ_H 4.66(1H,brs,H-30a),4.70(1H,brs,H-30b)；δ_C 103.8(C-30)]；

同时还具有一个环内烯氢质子信号[δ_H 5.30(1H,t,J＝3.6Hz,H-12)]；

上述结果提示实施例2所得化合物的基本结构可能为三萜类化合物；

此外，¹HNMR谱还显示一个醛基质子信号[δ_H 9.70(1H,brs,H-24)；δ_C 206.97(C-24)]；两个与羟基相连的次甲基[δ_H 3.84(1H,ddd,J＝11.2,4.4,2.4Hz,H-2),δ_C 65.5(C-2)；δ_H4.11(1H,d,J＝2.4Hz,H-3),δ_C 70.11(C-3)]和一个羧基信号δ_C 179.92(C-28)；

综上，¹HNMR谱结果提示实施例2所得化合物可能为新的乌苏烷类三萜化合物。

第二步，获取了实施例2所得化合物的核磁碳谱(¹³CNMR谱)和DEPT(无畸变极化转移增强，是一种¹³C核磁共振谱中的一种检测技术)图谱，结果显示：

实施例2所得化合物含有一个羧基碳信号δ_C 179.92(C-28)；

4个烯烃碳信号[δ_C 103.8(C-30),125.41(C-12),138.21(C-13),153.2C-20]；

4个甲基碳信号[δ_C 22.6(C-27),15.9(C-25),16.4(C-26),15.38(C-29)]；

共9个季碳信号[δ_C 58.3(C-4),39.5(C-8),37.4(C-10),138.2(C-13),42.0(C-14),47.6(C-17),153.2(C-20),179.9(C-28),206.97(C-24)]；

7个叔碳信号[δ_C 65.5(C-2),70.1(C-3),42.0(C-5),47.8(C-9),125.4(C-12),55.2(C-18),37.1(C-19)]；

10个仲碳信号[δ_C 40.5(C-1),19.9(C-6),32.8(C-7),23.0(C-11),27.7(C-15),23.9(C-16),31.9(C-21),39.0(C-22),60.7(C-23),103.8(C-30)]；

¹³CNMR谱和DEPT谱进一步证明该化合物为带醛基的乌苏烷类三萜化合物。

第三步，获取了实施例2所得化合物的HSQC(异核单量子关系)谱图；HSQC谱图数据对质子信号(氢谱)与碳谱信号相互归属，以确定实施例2所得化合物的碳氢信号类型；首先通过HSQC谱归属醛基碳与醛基氢[δ_H 9.70(1H,brs,H-24)；δ_C 206.97(C-24)]；其次归属双键碳氢[δ_H 4.66(1H,brs,H-30a),4.70(1H,brs,H-30b)；δ_C 103.8(C-30)；δ_H 5.30(1H,t,J＝3.6Hz,H-12)；δ_C 125.41(C-12)]；后对δc 50.0-80.0的连氧碳以及18位上碳进行信号归属[δ_H 3.84(1H,ddd,J＝11.2,4.4,2.4Hz,H-2),δ_C 65.5(C-2)；δH 4.11(1H,d,J＝2.4Hz,H-3),δ_C 70.11(C-3)；δ_H 3.90(1H,d,J＝10.8Hz,H-23a),3.86(1H,d,J＝10.8Hz,H-23b)；δ_C60.75(C-23)]；δ_H 1.00-2.80由于之间存在多个亚甲基和次甲基质子信号重叠峰，识别度不高。

因此进行HMBC(1H的异核多碳相关谱，将1H核和远程耦合的13C核关联起来，通常2～3个键的质子与碳的耦合信息较多)解谱时不以该区域质子信号作为起点；在高场区存在诸多甲基信号，其谱图信号明显且清楚，易于观察以及解析。如[δ_H 1.25(3H,s,H-27),1.09(3H,s,H-25),0.88(3H,s,H-26),1.04(3H,d,J＝6.0Hz,H-29)；δ_C 22.6(C-27),15.9(C-25),16.4(C-26),15.38(C-29)]。

通过HMBC远程耦合对实施例2所得化合物进行解析。首先对醛基的位置进行分析，谱图显示：δ_H 9.70(H-24)与δ_C 58.3(C-4),70.1(C-3),42.0(C-5)相关，表明醛基碳可能与4号位碳相连；δ_H 4.11(H-3)与δ_C 206.97(C-24)相关可以确定醛基碳与4号位碳相连。δ_H5.30(H-12)与δ_C 42.0(C-14),47.8(C-9),55.2(C-18)相关；δ_C 15.9(C-25)与δ_C 40.5(C-1),42.0(C-5),47.8(C-9),37.4(C-10)相关；δ_H 3.90(H-23a),3.86(H-23b)与δ_C 58.3(C-4),70.1(C-3),42.0(C-5),206.97(C-24)相关；δ_C 16.4(C-26)与δ_C 32.8(C-7),39.5(C-8),47.8(C-9),42.0(C-14)相关，通过H-25和H-26相关情况可以确定A环和B环的基本结构。δ_H1.25(H-27)与δ_C 39.5(C-8),138.2(C-13),42.0(C-14),27.7(C-15)相关，通过H-27与C-13相关可以确定27位甲基的质子信号。通过H-27的HMBC信号确定C/D环的基本结构。通过δ_H2.30(H-18)与δ_C 138.2(C-13),37.1(C-19),47.6(C-17),39.0(C-22),15.38(C-29)，153.2(C-20)相关，确定E环的基本结构。

通过J_H-2β/H-3β＝2.40Hz可以得知H-2与H-3为同构型，通过J_H-18/H-19＝12.4Hz可以得出C-18与C-19的构型。C-25为β构型，观察NOESY(揭示质子与质子间在空间的相互接近关系)谱的信号发现δ_H 1.09(H-25)与δ_H 3.84(H-2)相关；δ_H 1.09(H-25)与δ_H 3.90(H-23)相关；δ_H 3.84(H-2)与δ_H 3.90(H-23)相关；δ_H 4.11(H-3)与δ_H 3.90(H-23)相关，可以确定C-2和C-3以及C-23的绝对构型。此外通过比较相似化合物的碳谱化学位移确定C-28与C-29的绝对构型。鉴定实施例2所得化合物为(2α,3α,4β)-2,3,23-Trihydroxy-24-oxours-12,20(30)-dien-28-oic acid。

实施例2所得化合物的HMBC相关图如图4所示；NOESY相关图如图5所示。

实施例2所得化合物的1H NMR、13C NMR数据如表3所示。

表3实施例2所得化合物的1H NMR、13C NMR数据

采用与实施例2相似的分离方法和本测试例相似的测试方法，得到猕猴桃根提取物中还含有其他13种三萜类物质，其结构式如图6所示，其中图6中的结构式1为本发明所得化合物。

试验例4

本试验例测试了实施例2所得化合物对MP胰腺癌细胞、Patu8988t胰腺癌细胞、Panco2胰腺癌细胞的活性抑制试验。具体的测试方法为：以CCK8法对所得新化合物进行细胞评价，选用MP胰腺癌细胞、Patu8988t胰腺癌细胞、Panco2胰腺癌细胞作为细胞评价模型。测试结果如表4所示。

表4实施例2所得化合物对胰腺癌细胞的活性抑制试验结果

本表格中IC₅₀的单位是μM，与表2中IC₅₀的单位不同，换算成g/L的单位后，实施例2所得化合物对MP胰腺癌细胞和Patu8988t胰腺癌细胞的IC₅₀值约为0.025g/L，说明本发明从中华猕猴桃根中制备的化合物，对胰腺癌细胞增殖活性的抑制能力，更优于实施例1所得猕猴桃根提取物。

综合试验例2和试验例4的测试结果可知，本发明所得的猕猴桃根提取物以及从猕猴桃根中制备的化合物，均具有优异的抑制胰腺癌细胞增殖的效果，在制备治疗胰腺药物的制备中，具有良好的应用前景。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。