酵母菌株及其在石油烃降解中的应用
阅读说明：本技术 酵母菌株及其在石油烃降解中的应用 (Yeast strain and application thereof in petroleum hydrocarbon degradation ) 是由 元英进 王妍 丁明珠 吴莎 于 2021-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物修复技术领域,尤其涉及酵母菌株及其在石油烃降解中的应用。本发明提供了经基因改造的解脂耶氏酵母,该重组酵母菌株能够表达烷烃转运蛋白酶,从而提高了对烷烃的降解能力,特别是对长链烷烃的降解能力。配合本发明优化后的降解条件,该菌株对长链烷烃的降解率可达60％以上。(The invention relates to the technical field of bioremediation, in particular to a yeast strain and application thereof in petroleum hydrocarbon degradation. The invention provides genetically modified yarrowia lipolytica, which can express alkane transport protease, thereby improving the degradation capability of alkanes, in particular the degradation capability of long-chain alkanes. By matching with the optimized degradation conditions of the invention, the degradation rate of the strain on long-chain alkane can reach more than 60%.)
技术领域
本发明涉及生物修复技术领域，尤其涉及酵母菌株及其在石油烃降解中的应用。
背景技术
随着人类对石油及其产品需求量的日益增加，油田附近的湿地面临着石油污染加剧的严重威胁，其污染物主要是在原油开采、运输、石化燃料的生产使用及事故性泄露中所产生的石油污染物。烃类化合物是石油产品的主要成分，按照其骨架结构的不同分为饱和链烃(烷烃)、不饱和链烃(烯烃和炔烃)、脂环烃和芳香烃，其中烷烃占石油产品主要成分的50％以上。因此，在石油污染物中，烷烃是最常见的污染物。在自然环境中，短链烷烃易挥发，中链烷烃可以被微生物降解，而不易挥发、低溶解性的长链烷烃则属于很难被生物降解的污染物，对环境的危害较持久。因此，微生物的降解作用是实现石油污染湿地中长链烷烃去除的有效途径。
生物修复是一种符合绿色发展理念的主要修复方式，并逐渐成为研究重点。生物修复石油烃污染环境大致可以分为以下三个过程，微生物对石油烃的间期适应过程、转运过程和降解过程。在生物修复石油烃污染环境的过程中，微生物首先会对石油烃进行间期适应过程，在此过程中微生物一般通过分泌表面活性剂和趋化运动两种方式增大对石油烃污染物的生物利用度；然后，石油烃经过转运过程进入细胞内，主要方式有自由扩散、被动运输、主动运输和内吞作用，且大部分石油烃的转运过程需要转运蛋白的参与；最后，石油烃在细胞内完成降解，石油烃分子一旦进入细胞内，即被加氧酶氧化为脂肪族醇，脂肪族醇依次转化为脂肪族酸和脂酰辅酶A等，随后经β-氧化降解。
但现有的石油烃降解菌研究集中在细菌领域，而大部分石油烃降解细菌遗传背景不清楚，且降解效果较为有限。因此，进一步提高菌种对石油烃的降解效率仍是本领域的研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种能够提高石油烃降解率的酵母菌株及其在石油烃降解中的应用。
本发明提供了表达烷烃转运蛋白的解脂耶氏酵母。
长链烷烃在水相中的溶解度非常低，因此烃降解菌必须采取某些特定的摄取模式才能获取这些疏水性底物。烷烃通过特异性转运蛋白转运到细胞中。有研究表明，长链烷烃(C14～C16)需要烷烃转运蛋白ABC1才能进入细胞或输出，以防止烷烃毒性。然后它们被细胞色素P450依赖的烷烃单加氧酶系统(ALK基因编码)转化为相应的脂肪醇，然后被脂肪醇脱氢酶(FADH基因)转化为醛，并被脂肪醛脱氢酶(FALDH)转化为相应的长链脂肪酸。解脂耶氏酵母降解长链烷烃途径如图1所示。
本发明中，所述烷烃转运蛋白为解脂耶氏酵母ATCC 201249的烷烃转运蛋白。具体的，其编码的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
构建本发明所述解脂耶氏酵母的表达载体为K8FB载体或PINA1269载体。其中，K8FB为单拷贝载体(图谱如图9，序列如SEQ ID NO:4)，PINA1269载体为多拷贝载体。
本发明中，用于构建重组菌株的底盘菌为解脂耶氏酵母ATCC 201249。
本发明提供的重组菌株以解脂耶氏酵母为底盘进行基因改造，通过K8FB、pINA1269质粒使菌株表达烷烃转运蛋白酶基因(ABC1)，进一步提高了解脂耶氏酵母对烷烃降解的能力，并且结果表明，以pINA1269质粒为载体表达ABC1蛋白更有利于石油烃的降解。
本发明所述重组菌株的构建方法包括：将编码ABC1蛋白的核酸片段通过同源重组的方法构建入表达载体；以限制性内切酶对构建后的表达载体进行线性化；将线性化的载体以同源重组的方式整合入底盘菌。
本发明构建的解脂耶氏酵母在石油烃降解中的应用。
本发明构建的重组解脂耶氏酵母能够降解的石油烃中含有正十六烷。
本发明还提供了一种降解石油烃的方法，其包括：将本发明构建的重组解脂耶氏酵母接种于含有石油烃的培养物，进行培养、降解。
所述培养物种含有的石油烃含有正十六烷。
所述培养物中包含培养基，所述培养基为YPD培养基或SC-G培养基。优选的培养基为SC-G培养基更有利于对石油烃的降解。
一些实施例中，所述培养物中，石油烃的初始浓度为5～20g/L。结果表明在一定范围内，石油烃初始浓度提高更有利于其降解。
一些实施例中，所述降解的条件包括30℃，rpm振荡降解4天。
本发明提供了经基因改造的解脂耶氏酵母，该重组酵母菌株能够表达烷烃转运蛋白酶，从而提高了对烷烃的降解能力，特别是对长链烷烃的降解能力。配合本发明优化后的降解条件，该菌株对长链烷烃的降解率可达60％以上。
附图说明
图1示解脂耶氏酵母降解途径；
图2示K8FB-ABC1表达载体构建流程；
图3示PINA1269-ABC1表达载体构建流程；
图4示正十六烷标准曲线图；
图5示野生型解脂耶氏酵母及工程酵母生长曲线；
图6示重组菌株的降解率；
图7示培养基成分对工程菌株降解率的影响；
图8示不同正十六烷初始浓度梯度对工程菌株降解烷烃的影响；
图9示载体K8FB图谱。
具体实施方式
本发明提供了酵母菌株及其在长链烷烃降解中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、菌株构建
从解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组中PCR扩增获得编码烷烃转运蛋白ABC1的基因(SEQ ID NO:1)。通过在其两侧引入20bp同源臂序列(左：SEQ ID NO:2，右：SEQ ID NO:3)，使得其可以通过同源重组的的方式分别连入单拷贝载体K8FB(插入为点为Bsa I)和多拷贝载体PINA1269(插入为点为BamH I和KpnI)中。构建流程如图2～3所示。
将构建好的载体进行用NotI酶切回收后，通过同源重组的方式将过表达基因整合入解脂耶式酵母ATCC 201249基因组中，获得目标菌株。其中：
将烷烃转运蛋白基因ABC1连接在单拷贝载体K8FB上，再整合于解脂耶氏酵母基因组上，构建得到的菌株命名为M-1(y-K8FB-ABC1)；
将烷烃转运蛋白基因ABC1连接在多拷贝载体pINA1269上，再整合于解脂耶氏酵母基因组上，构建得到的菌株命名为M-3(y-pINA1269-ABC1)。
2、菌株烷烃降解率的结果分析
(1)正十六烷标准曲线的测定
量取色谱纯的标品正十六烷0.2g/L，并用乙酸乙酯将正十六烷依次稀释至0.175g/L、0.15g/L、0.125g/L、0.1g/L、0.075g/L、0.05g/L、0.025g/L、0.01g/L经0.22μm有机滤膜过滤后进样1mL进行检测，色谱条件如下。
气相色谱-质谱联用分析仪(GC-MS)系统包括气相色谱Agilent 6890N、质谱Agilent 5975C MSD(Agilent Technologies,USA)和自动进样器Agilent7683B。
色谱条件：HP-5MS毛细管柱(最大承受温度为325℃，行程长度为30.0m，标称内径为25.0μm，标准膜厚度为0.25μm)
载气：高纯氦气(载气流速为1mL/min)
进样量：1μL(采用分流进样，分流比为1:1，进样口温度设置为290℃)柱温：初始柱温为40℃保持3min，以6℃/min的速度升温到300℃
检测质谱条件：质谱接口温度为250℃，离子源电压70eV，离子电流40μA，扫描质量范围为50-650m/z。
通过GC-MS对一系列浓度梯度的正十六烷标准品的检测，以正十六烷浓度为横坐标，积分所得正十六烷峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。如图4所示，正十六烷的标准曲线为y＝8041463.448x-20371.301，相关系数约为0.998。
(2)生长曲线的测定
对野生型解脂耶氏酵母Y、构建获得解脂耶氏酵母母M-1和构建获得的解脂耶氏酵母母M-3设置三组平行，用YPD培养基进行培养，并每隔适当时间取样，测定OD600值，记录数值并绘制培养过程中工程酵母的生长曲线，如图5所示。相比于野生型解脂耶氏酵母Y，工程酵母M3、M1长势较好。
(3)烷烃降解率结果分析
对野生型解脂耶氏酵母Y、构建获得解脂耶氏酵母母M-1和构建获得的解脂耶氏酵母母M-3进行培养，将菌液以0.2的初始OD600转接到50mL发酵用YPD培养基中(20g/L葡萄糖)，于250rpm，28℃的条件下培养4天后，用乙酸乙酯提取培养基中的剩余烷烃，之后利用气相色谱－质谱联用分析仪(GC-MS)进行检测分析。
通过积分计算剩余正十六烷的峰面积，利用图4中测定的标准曲线计算得出相对应的浓度值，测定正十六烷结果如表1所示。
表1测定结果数据
菌株
底物浓度(g/L)
峰面积
剩余烷烃浓度(g/L)
降解率(％)
Y-1
10
202498
5.543
44.57
Y-2
10
196829
5.402
45.98
Y-3
10
204951
5.604
43.96
M1-1
10
171860
4.781021
52.19
M1-2
10
166031
4.636134
53.64
M1-3
10
173709
4.827102
51.73
M3-1
10
151274
4.269
57.31
M3-2
10
148138
4.191
58.09
M3-3
10
149143
4.216
57.84
根据测定测定结果数据，重组菌株的降解率如图6所示。
根据图6所示K8FB-ABC1工程酵母的降解率比野生型解脂耶氏酵母高约10％。说明ABC1基因在烷烃降解过程中发挥重要作用，有利于菌体的生长。因此，初步判定过表达ABC1基因能够在一定程度上提高工程酵母降解正十六烷的能力。与K8FB系列菌株相比，pINA1269系列菌株的降解率更高。比野生型解脂耶氏酵母高约15％。实验结果表明，提高过表达基因的拷贝数可以有效提高菌株对正十六烷的降解能力。
3、烷烃降解因素的分析与优化
对具有较高的烷烃降解能力的菌株的培养结果分析，表明在初始添加10g/L葡萄糖和正十六烷烃的YPD培养基条件下，虽然工程菌株的降解能力达到58.09％，取得良好的成果，但是培养过程中工程菌株可能会优先利用葡萄糖从而影响对正十六烷的降解。并且培养基中不添加葡萄糖，只添加正十六烷作为唯一碳源的条件与现实油藏环境条件相接近。此外，烷烃浓度也可能会影响工程菌株降解能力。据此，为解决工程菌株培养过程中碳源的优先利用问题，接下来将研究培养基成分和碳源浓度对工程菌株培养的影响。
综上所述，本实验将对培养基中的成分、烷烃浓度影响因素进行研究，优化工程菌株的培养条件。本实验已构建出有较高的烷烃降解能力的菌株。因此，本研究将基于M-3菌株进行降解条件优化的实验。
3.1培养基成分对工程菌株降解烷烃的影响
为了研究解脂耶氏酵母对烷烃降解是否受到培养基成分的影响，本实验使用仅以初始浓度为10g/L的正十六烷作为碳源的SC-G培养基，研究其对烷烃降解率的影响。选择最高降解率的工程酵母M-3分别在SC-G培养基和YPD培养基中培养，比较培养基成分对工程菌株降解烷烃的影响，实验结果如图7所示。
根据图7，在培养过程中，使用SC-G培养基的工程酵母对正十六烷的降解率比用YPD培养基高约5％。此结果表明，工程酵母可以以正十六烷为唯一碳源生长，并且消除解脂耶氏酵母优先利用葡萄糖的弊端，进一步提高工程酵母对正十六烷的降解效率。其次，培养基中含有不同碳源会存在一种竞争现象，可能会优先利用葡萄糖而降低对正十六烷降解率。
3.2烷烃初始浓度对工程菌株降解烷烃的影响
由于SC-G培养基培养的降解效果较好，因此本实验在SC-G培养基的基础上，设置初始正十六烷浓度梯度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L，以研究初始烷烃浓度对工程菌株降解正十六烷烃的影响。实验结果如图8所示。实验结果表明，随着初始添加正十六烷浓度的升高，正十六烷降解率也随之升高，降解率提升约为4％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 酵母菌株及其在石油烃降解中的应用
<130> MP21016771
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5312
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母ATCC 201249(Yarrowia lipolytica ATCC 201249)
<400> 1
gcgcactact acccgtcggg cgtgtcgtcg gtcggcaact tcgactcgct agatgtcgag 60
atcagatcgc tggccgaggg aatggtacac aaacctcacc atcgagaatc gcgatacatt 120
ttcgaccaca cctttgacga cgagtttcga gaagagcatg aggacgaata cgactatgat 180
atgctgcgga agacgtcttt tgagaacccc gacgtcaacc cttacgtgga ggccagtgcg 240
gagccggagc tggatccctg gtcgggcgag ttcaactcgc gaaagtggat caagaccgtg 300
ctgggtctca aggagcgatt tggaaacagt aagggaatca cggccggcgt gtcgttcaag 360
aacctgggtg cctacgggta cggcagtcgc agtgactacc agaagacgtt tctcaacgtc 420
attgtggcca ctggagattt gctgcgaagt gctattggcg ctaaacggac aagcaaaatc 480
cagattctgc gcaagtgcga tggactggtg cttccaggtg aaacctgtgt agttctggga 540
cgtcccggat caggatgcac tacatttctc aagagtattg cttgcgagac gtacggattt 600
catgtggagg aagagacaca atggaactat cagggtgagt atttgggatt atggggctat 660
gaggttatga gggagatgga aataccggaa tgaacatctt ccaggtggtc tattctttct 720
tgttggccgt tattttgtgt ccacctgatt ttttttattt ttttattttt tattttttat 780
ttttgtgtgt tgcacacatt ccaatcagtg cagatcactc ccaacacggc cggtatctaa 840
tacctagacc cgaatagagt gttctgtacg cgataatcat accaggtggg aatcagaaca 900
caagaacaaa gaaagcagat ttccgcggag cgcgaaaaac aataaccaat aatgacccta 960
ctaacgcagg cgtaccacga gatgtcatga caaagcattg ccgaggagaa attgtctaca 1020
atgctgaaca cgatatccat ttccctcact tgacggtcgg acagaccctc atgtttgcgg 1080
ctctagcccg aactccccga aaccgagtgc tgggagtgac ccgagagcag tatgctcgtc 1140
acacccgaga tgttaccatg gccactctcg gtctgtctca cacaatcaac accaaggttg 1200
gatccgatct agtgcgtgga gtctccggtg gagagagaaa acgagtctct attgccgagt 1260
ccgtcgtctg cggagcgcct ctacagtgct gggataactc cactcgaggt ctggatgctg 1320
cgaacgccac cgaattcatt cgatctctgc gactttccgc ccagatgaca ggcgcctcca 1380
tgtttgtgtc tctgtaccag gcttcccagg aggcctacga catgttcgac aaggtgtgtc 1440
tgctgtacga gggacgacaa atcttcttcg gtaaggccgg agaggccaca tcatactttg 1500
agggtctggg attcgagcga gcccatcgcc agaccactgg tgattttctg acctccctta 1560
caaaccctgt cgagcgaaga atcaaggctg gatgggagaa gctcgtgcct cgaactcccg 1620
aggagtttga gtctcgatgg agatcgtccc gaacacacgc tctgttagtt tacaacatcg 1680
accgattcaa taccactcat cctcttggtg gtcagggtta tgtcgagttc atgaagctcc 1740
gaaaggagtc tcaggcccga aatacccgtc tgtcgtcgcc atatctgctc tcctggccca 1800
tgcaggttcg tctgtgtctc tggagaggct tcttgttggt gagaggagac ttgtccatga 1860
cgctgatgac catcattggt aacttcatca tggccctcat tctggcatca atgtactata 1920
atttgcgaga gtcgactgat gccttcttct cgcgatctgc cctgcttttc ttggccatgt 1980
tgctgaacgc tatggcctcc gttttggaga ttttcgtgct gtacggacag cgaccactga 2040
ttgagaaaca caaacgatat gcattgtacc atccctttgc agaatcaatc gcgtcaatgt 2100
tggttgattt accgaccaaa ctggcaactc tgatttcagt caacctcgct ctttacttca 2160
tgactaacct gagacgaacc ccgggtgcct tcttcatctt cctgctcttt tcgttcacct 2220
gtaccatggc aatgtccatg attttccggt tcactgcttc tgtcaccaag actatggaac 2280
aggctctggc ccccgcctct gtgctagttt tggcactggt tatttacact ggtttcacgc 2340
ttcccgtcga ttacatgcat ggatgggccc gatggatgaa ttacctcaat cctgttgctt 2400
atgcgtttga ggcagtaatg gtgaacgagt tccgaaacag aaggttccct tgtggacttt 2460
acgttccttc ccggtctttc tacaactctg tgcccgctga gtccaagtct tgtgtggcta 2520
tcggcgccaa gctcggccag gactacgtcg atggctccgt gttcatcagc acggcctaca 2580
agtacgagac tggacacctg tggcgaaacc tgggcattct gtgggccttt gctggctttt 2640
tctgcggcgt ctacctgctt gctgccgagt acgtgaccat ggcccagtcc aagggtgagg 2700
ttctgctgtt caagcgatcc cagcatcgaa agaacctcaa ggccaagcct gacaagcgat 2760
tccaagacgt tgagcttgga gacaacctcg gcgaccacaa cttggaccaa aacctcggcg 2820
acaaccactc gacgtactct taccagcaac ccatccaggc tcagattccc ccttctcggt 2880
acgcccagca ggctcccatg actcccgctc ctatgatgca tgtccccatg actcctggtg 2940
gcatgctttc tcccggtcag caaatgttct ctcccggtca gcaaatgatg acgcctggtc 3000
ccatgtcacc cgcaggcatg atgactcccg gttttacata tgtgcccccc catggagaca 3060
ctattcacca accgcctacc gttggagacg acatcaacta cacgactccc gcgccccagg 3120
tgaacttcac ccctgccact ccagctcagt acactactcc cgccacccca gctcagtaca 3180
acactcctgg cacccctggt attactggtg ggtacgagcc ccctcatgga gacactgttc 3240
acatgccccc cacagttggt gatgacacaa actacattcc caccaaggtt cgcaccaacc 3300
tgtctctcaa ctcgtccaaa tctaacttgc agcactctgg agtgttccaa tggaccgatg 3360
tttgctacga tatcaaggtt gctggtgaga acaagcgatt gctggaccat atcgacggtt 3420
acgtgaagcc cggtaccctc accgctctca tgggagcttc tggtgctgga aagactactc 3480
ttcttgatgt gctggctgat cgaaaatcca ctggtattgt tcatggagac atgttggtca 3540
atggccagca gcgaaacgcc tctttccagc gaaagaccgg atacgttcaa cagcaggatt 3600
tgcatactgc cactgccact gttcgtgagt ctctcgagtt ctcagctctg ttgcgacagc 3660
cctcttctgt gtctcgagct gacaagctgg cttacgtcga tgaggtcatt tctattcttg 3720
agatggattc ttacgctgat gccgttgttg gtgttcctgg tgaaggtctt aacgtggaac 3780
agcgaaagcg tctgactatc ggcgtcgagc ttgctgccaa gcccgagctg ctgcttttcc 3840
tggatgagcc tacctccggt ctggattccc agactgcttg gtctatcgtc tctctgctca 3900
aaaagctggc tgccaacggt caggctatcc tgtgtaccat ccatcagccc tctgccattc 3960
tgttccaaga gtttgatcga cttctgttcc tggcagccgg tggaaagaca gtgtactacg 4020
gagacctcgg tgataaggcg tctctgctca ttgaatactt tgaaagtaac ggtgctgacc 4080
cttgtcctga taacggtaac cctgccgaat ggatgctgga ggtaattggt gctgctcctg 4140
gttcccgggc caagaaggac tggccctcag tctggcgata ctcccagctt cgacgacaac 4200
agcgtgagga actcgatgat atgcgtcttg cattcaacgc tgactctcag gcagctcttg 4260
cagttggagg agaagacact gatttcgccg tgtctcagtg gacccagctg tactacgtta 4320
ccaagcgact gctgcagttc cactggcgaa ctccctccta tctgtggtcc aagatgactc 4380
tgtgtattgg ttgtgctctg ttcattggtt tctccttcta caagtcggct cgagacattc 4440
agggtcttca gaaccaaatg tttagtattt tcctcatgtt cctgattttc accacagttg 4500
ccgagcagat tatgcctctt ttcatgattc agcgagactt gtacgaggct cgagagcgtg 4560
cttccaagac ttactcgtgg caggtgttcc tcggcggaaa tatgctcgcg gagcttccct 4620
ggcagattat cgtggcggtt gtcgtcttct tctgcatgta ctaccccatt ggattctatc 4680
gaattgcggc tgagaaccac cagacacagg agcgaggagc tctctacttc ctcttcctgc 4740
tggtcttctt catttacgac tctacctacg ctcacatgat tggtgtcatg ttcaacaacc 4800
acgagacggc agccaacttt gcatacctgc tcttctcctt ctgtcttatg ttctgtggtg 4860
tgctggccac gaaggagtcc atgcctggat tctggatctt catgtaccga gcgtcgcctc 4920
tgacatactt cattggcggt ttcatggcca ctggtttggc cggaggaaag gtgacatgtt 4980
cgcaacatga gattttgcag ttcaagcctc tcaagggcaa ctcttgtgca cagtacatga 5040
aacccttcct ggacaatgct ggcatcttca agggctacct gctcaatgaa actgccaccg 5100
acatgtgtca ctattgcccc atcgagaacg ctgatgccta cctcgacaat gcctccattt 5160
tctatggaga ccgatggcga aactttggca ttgtgtttgc ctatcccatc ttcaacgttt 5220
gtgccacctt tatgctctac tacgttcttc gagttcctgg cgtgcgatac aagattgcgt 5280
ccaaggtccg atggcgacga aagaagcagt aa 5312
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母ATCC 201249(Yarrowia lipolytica ATCC 201249)
<400> 2
tagcaacaca cactctctac acaaactaac 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母ATCC 201249(Yarrowia lipolytica ATCC 201249)
<400> 3
atgtacatac aagattattt atagaaatga 30
<210> 4
<211> 9692
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgcggc cgcagcaacc cactgccgct 420
caacccgcag ccacttcata tagccctgct cccgcaaagg ctgccccccc acctcctcct 480
cctgctcccc cggcagcccc tgccgcccct gccgagccaa cttacaaggc tctgtatgac 540
tacgtggcca acggactcaa ccagctgtcc atttctgccg gtgaacaggt tctcatttct 600
gtgaaggagg atcagggatg gtggttggcc aagagaatgg acggctccga agagggatgg 660
acccccgcag cctacttgga ggaggtccag ggtggcgctg cagctcctcc ccccgctgct 720
ccaactgctg gaggtgcgtc tgctggagcc tctctggctg aggctctcaa gcagaagcaa 780
cagtccaatc agactcttgg tgccggtatt gctgacgcca tcaaggctcg aactgggcga 840
cctgctgacg atgatgatga tgactggtaa ttatgtaagt aatgtgcaaa ctatgatacg 900
atggattgtc tattatagct atgaaaccca tagttgattt tttgcttgta ctgtgtatcg 960
tgagattgta ttgtagctac cgaccggtat gtactgtatc gtacttactc aagtacaaat 1020
aaatatcgat actaatacga gtacatcgta tcatactcgt ctgttgcaaa tgaaaattaa 1080
ggttgactta ctactgtact tgtagtacat actgtagttg gatgcggcta agcgagtgat 1140
gtatgaagag tatagatgag taatggcact cgtacttatg aacagaaata acacacacat 1200
gtatactatt acatctctga aactgaatgt catatgccta ttccttgtat ttgtagttgt 1260
agattcaaac accatcgaat cttgtccacc ctcgacgcgt cttccccaaa gttgaaggta 1320
aatgccggac gcgaagaaag gcatcacgcc caacagcata cacacacaac caagagcaca 1380
ctgccatacc agtgactttg agcaacagtg tacgcagtac tatagaggaa caattgcccc 1440
ggagaagacg gccaggccgc ctagatgaca aattcaacaa ctcacagctg actttctgcc 1500
attgccacta ggggggggcc tttttatatg gccaagccaa gctctccacg tcggttgggc 1560
tgcacccaac aataaatggg tagggttgca ccaacaaagg gatgggatgg ggggtagaag 1620
atacgaggat aacggggctc aatggcacaa ataagaacga atactgccat taagactcgt 1680
gatccagcga ctgacaccat tgcatcatct aagggcctca aaactacctc ggaactgctg 1740
cgctgatctg gacaccacag aggttccgag cactttaggt tgcaccaaat gtcccaccag 1800
gtgcaggcag aaaacgctgg aacagcgtgt acagtttgtc ttagcaaaaa gtgaaggcgc 1860
tgaggtcgag cagggtggtg tgacttgtta tagcctttag agctgcgaaa gcgcgtatgg 1920
atttggctca tcaggccaga ttgagggtct gtggacacat gtcatgttag tgtacttcaa 1980
tcgccccctg gatatagccc cgacaatagg ccgtggcctc atttttttgc cttccgcaca 2040
tttccattgc tcggtaccca caccttgctt ctcctgcact tgccaacctt aatactggtt 2100
tacattgacc aacatcttac aagcgggggg cttgtctagg gtatatataa acagtggctc 2160
tcccaatcgg ttgccagtct cttttttcct ttctttcccc acagattcga aatctaaact 2220
acacatcaca caatgcctgt tactgacgtc cttaagcgaa agtccggtgt catcgtcggc 2280
gacgatgtcc gagccgtgag tatccacgac aagatcagtg tcgagacgac gcgttttgtg 2340
taatgacaca atccgaaagt cgctagcaac acacactctc tacacaaact aacccaggga 2400
gaccggtctc ctaaaatgta catacaagat tatttataga aatgaatcgc gatcgaacaa 2460
agagtacgag tgtacgagta ggggatgatg ataaaagtgg aagaagttcc gcatctttgg 2520
atttatcaac gtgtaggacg atacttcctg taaaaatgca atgtctttac cataggttct 2580
gctgtagatg ttattaacta ccattaacat gtctacttgt acagttgcag accagttgga 2640
gtatagaatg gtacacttac caaaaagtgt tgatggttgt aactacgata tataaaactg 2700
ttgacgggat ccccgctgat atgcctaagg aacaatcaaa gaggaagatc ttccagtggt 2760
gcatgaacgc atgagaaagc ccccggaaga tcatcttccg ggggcttttt ttttggcgcg 2820
cgatacagac cggttcagac aggataaaga ggaacgcaga atgttagaca acacccgctt 2880
acgcatagct attcagaaat caggccgttt aagcgatgat tcacgagaat tgctggcccg 2940
ctgcggcata aaaattaatt tacacactca gcgcctgatt gcgatggcgg aaaacatgcc 3000
gattgatatc ctgcgcgtgc gtgatgatga cattccgggt ctggtaatgg atggcgtggt 3060
cgatctcggt attatcggcg aaaacgtgct ggaagaagag ctactcaacc gccgcgcaca 3120
gggcgaagat ccacgctatt taaccctgcg ccgtcttgac ttcggcggct gccgtttatc 3180
gctggcaaca ccggttgacg aagcctggga cggcccggcc gcgctggacg gtaaacgtat 3240
cgctacctca tatccgcacc tcctcaaacg ctacctcgac cagaaaggcg actcttttaa 3300
atcgtgtctg ttaaatggtt ctgtcgaagt cgcgccgcgc gcggggctgg ccgacgctat 3360
ctgcgatttg gactctaccg gcgcgacgct tgaagctaac ggcctgcgtg aagtcgaagt 3420
tatctaccgc tctaaagcct gtctgattca gcgcgacggt gagatggcac agagcaagca 3480
agagctgatc gataaattgc tgacccgtat tcagggcgtg attcaggcgc gcgaatcgaa 3540
atacatcatg atgcacgcgc caagtgaacg cctggaagag gttatcgccc tgctgccagg 3600
cgccgaaagg ccgacaattc tgccgctggc aggcgagcaa cagcgcgtgg cgatgcacat 3660
ggtcagcagc gaaacgttgt tctgggaaac catggagaaa ctgaaagcgc ttggcgccag 3720
ctcgattctg gtactgccga tcgagaagat gatggagtga tctgacgcct gatggcgctg 3780
cgcttatcag gcctacgtaa tgcgttgata ttttgggttc tgtaggccgg ataaggcgga 3840
accctgtgat ggagtaaaga ccatgagctt caataccctg attgactgga acagcggtgt 3900
gttctgtgga gcattctcac ttttggtaaa cgacattgct tcaagtgcag cggaatcaaa 3960
aagtataaag tgggcagcga gtatacctgt acagactgta ggcgataact caatccaatt 4020
accccccaca acatgactgg ccaaactgat ctcaagactt tattgaaatc agcaacaccg 4080
attctcaatg aaggcacata cttcttctgc aacattcact tgacgcctaa agttggtgag 4140
aaatggaccg acaagacata ttctgctatc cacggactgt tgcctgtgtc ggtggctaca 4200
atacgtgagt cagaagggct gacggtggtg gttcccaagg aaaaggtcga cgagtatctg 4260
tctgactcgt cattgccgcc tttggagtac gactccaact atgagtgtgc ttggatcact 4320
ttgacgatac attcttcgtt ggaggctgtg ggtctgacag ctgcgttttc ggcgcggttg 4380
gccgacaaca atatcagctg caacgtcatt gctggctttc atcatgatca catttttgtc 4440
ggcaaaggcg acgcccagag agccattgac gttctttcta atttggaccg atagccgtat 4500
agtccagtct atctataagt tcaactaact cgtaactatt accataacat atacttcact 4560
gccccagata aggttccgat aaaaagttct gcagactaaa tttatttcag tctcctcttc 4620
accaccaaaa tgccctccta cgaagctcga gctaacgtcc acaagtccgc ctttgccgct 4680
cgagtgctca agctcgtggc agccaagaaa accaacctgt gtgcttctct ggatgttacc 4740
accaccaagg agctcattga gcttgccgat aaggtcggac cttatgtgtg catgatcaag 4800
acccatatcg acatcattga cgacttcacc tacgccggca ctgtgctccc cctcaaggaa 4860
cttgctctta agcacggttt cttcctgttc gaggacagaa agttcgcaga tattggcaac 4920
actgtcaagc accagtacaa gaacggtgtc taccgaatcg ccgagtggtc cgatatcacc 4980
aacgcccacg gtgtacccgg aaccggaatc attgctggcc tgcgagctgg tgccgaggaa 5040
actgtctctg aacagaagaa ggaggatgtc tctgactacg agaactccca gtacaaggag 5100
ttcctggtcc cctctcccaa cgagaagctg gccagaggtc tgctcatgct ggccgagctg 5160
tcttgcaagg gctctctggc cactggcgag tactccaagc agaccattga gcttgcccga 5220
tccgaccccg agtttgtggt tggcttcatt gcccagaacc gacctaaggg cgactctgag 5280
gactggctta ttctgacccc cggggtgggt cttgacgaca agggtgacgc tctcggacag 5340
cagtaccgaa ctgttgagga tgtcatgtct accggaacgg atatcataat tgtcggccga 5400
ggtctgtacg gccagaaccg agatcctatt gaggaggcca agcgatacca gaaggctggc 5460
tgggaggctt accagaagat taactgttag aggttagact atggatatgt aatttaactg 5520
tgtatataga gagcgtgcaa gtatggagcg cttgttcagc ttgtatgatg gtcagacgac 5580
ctgtctgatc gagtatgtat gatactgcac aacctgtgta tccgcatgat ctgtccaatg 5640
gggcatgttg ttgtgtttct cgatacggag atgctgggta caagtagcta atacgattga 5700
actacttata cttatatgag gcttgaagaa agctgacttg tgtatgactt attctcaact 5760
acatccccag tcacaatacc accactgcac taccactaca ccgatcttcc agtggtgcat 5820
gaacgcatga gaaagccccc ggaagatcat cttccggggg cttttttttt ggcgcgcgat 5880
acagaccggt tcagacagga taaagaggaa cgcagaatgt tagacaacac ccgcttacgc 5940
atagctattc agaaatcagg ccgtttaagc gatgattcac gagaattgct ggcccgctgc 6000
ggcataaaaa ttaatttaca cactcagcgc ctgattgcga tggcggaaaa catgccgatt 6060
gatatcctgc gcgtgcgtga tgatgacatt ccgggtctgg taatggatgg cgtggtcgat 6120
ctcggtatta tcggcgaaaa cgtgctggaa gaagagctac tcaaccgccg cgcacagggc 6180
gaagatccac gctatttaac cctgcgccgt cttgacttcg gcggctgccg tttatcgctg 6240
gcaacaccgg ttgacgaagc ctgggacggc ccggccgcgc tggacggtaa acgtatcgct 6300
acctcatatc cgcacctcct caaacgctac ctcgaccaga aaggcgactc ttttaaatcg 6360
tgtctgttaa atggttctgt cgaagtcgcg ccgcgcgcgg ggctggccga cgctatctgc 6420
gatttggact ctaccggcgc gacgcttgaa gctaacggcc tgcgtgaagt cgaagttatc 6480
taccgctcta aagcctgtct gattcagcgc gacggtgaga tggcacagag caagcaagag 6540
ctgatcgata aattgctgac ccgtattcag ggcgtgattc aggcgcgcga atcgaaatac 6600
atcatgatgc acgcgccaag tgaacgcctg gaagaggtta tcgccctgct gccaggcgcc 6660
gaaaggccga caattctgcc gctggcaggc gagcaacagc gcgtggcgat gcacatggtc 6720
agcagcgaaa cgttgttctg ggaaaccatg gagaaactga aagcgcttgg cgccagctcg 6780
attctggtac tgccgatcga gaagatgatg gagtgatctg acgcctgatg gcgctgcgct 6840
tatcaggcct acgtaatgcg ttgatatttt gggttctgta ggccggataa ggcggaaccc 6900
tgtgatggag taaagaccat gagcttcaat accctgattg actggaacag cttaatatat 6960
atatacagta tatcgaaaac tcaccagaca aatgtttttg tcgtggatac atattggtga 7020
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gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 7740
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agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 8280
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 8340
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 8400
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caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 8580
aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 8640
aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 8700
ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaagc ccaatctgaa taatgttaca accaattaac 8760
caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 8820
attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 8880
gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 8940
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agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc 9060
aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 9120
tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 9180
aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 9240
atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgtttttccg gggatcgcag tggtgagtaa 9300
ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 9360
cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 9420
tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaag cgatagattg tcgcacctga 9480
ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 9540
taatcgcggc ctcgacgttt cccgttgaat atggctcata acaccccttg tattactgtt 9600
tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg caatgtaaca 9660
tcagagattt tgagacacgg gccagagctg ca 9692
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