通过超声空化从脂肪组织分离干细胞及使用方法
阅读说明：本技术 通过超声空化从脂肪组织分离干细胞及使用方法 (Isolation of stem cells from adipose tissue by ultrasonic cavitation and methods of use ) 是由 拉尔夫·布莱特 佩林·布莱特 布鲁斯·汉森 韦恩·托马斯 于 2013-06-26 设计创作，主要内容包括：在一个实施例中,本发明涉及用于从脂肪组织分离干细胞的非酶分离方法,其中方法包括用超声空化处理脂肪组织以破碎所述脂肪组织和溶解成熟的脂肪细胞,产生含有可存活的间质细胞/干细胞的间质血管成分。(In one embodiment, the invention relates to a non-enzymatic isolation method for isolating stem cells from adipose tissue, wherein the method comprises treating adipose tissue with ultrasonic cavitation to disrupt the adipose tissue and lyse mature adipocytes, producing a stromal vascular fraction containing viable stromal/stem cells.)
相关申请
本申请是申请日为2013年6月26日、申请号为201380044693.8(PCT/AU2013/000686)、发明名称为“通过超声空化从脂肪组织分离干细胞及使用方法”的分案申请。
本申请要求2012年6月26日提交的申请号为2012902719的澳大利亚临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及利用干细胞制品的方法。
开发本发明主要用于从脂肪组织非酶分离间质细胞/干细胞并且参考该应用在下文中进行描述。然而，应当理解的是本发明不限于该特定使用领域。
背景技术
在整个说明书中现有技术的任何讨论决不应被认为，承认这样的现有技术是广为人知的或形成本领域的公知常识的一部分。
脂肪组织，除了包含成熟的脂肪细胞之外，还包括能够分化为各种细胞谱系的干细胞(Zuk等Tissue Eng.2001；7:211-228；Hicok等Tissue Eng.2004；10:371-380；Erickson等Biochem Biophys Res Commun.2002；290:763-769；Cousin等Biochem BiophysRes Commun.2003；301:1016-1022；Safford等Biochem Biophys Res Commun.2002；294:371-379；Miranville等Circulation.2004；1 10:349-355；Planat-Benard等CircRes.2004；94:223-229；Planat-Benard等Circulation.2004；1 09:656-663)。干细胞是粘着的并且可以在培养物中增殖。相应地，从少量的脂肪组织中能够获得大量的干细胞。
现在，为了从脂肪组织分离干细胞，典型地使用酶类(诸如胶原酶)溶解将脂肪组织保持在一起的胶原中的键。(见例如，Zuk,等Mol Biol Cell.2002；13：4279-4295；Zuk,等Tissue Eng.2001；7：211-228)。虽然胶原酶是有效的，但其不适于制备干细胞，因为：
·酶处理导致高水平的细胞死亡，由此减少被分离的干细胞的数量和导致更多的细胞碎片；
·酶可以损伤和破坏独特的细胞类型；
·分离的干细胞被酶污染可以使它们不适于移植；以及
·监管机构可考虑在干细胞的分离中酶的使用导致需要药物批准的细胞产物。
本发明的目的在于克服或改善现有技术中的至少一个缺点，或提供一种有用的替代方案。
发明内容
令人惊讶地，本发明的发明人发现用超声空化处理脂肪组织可破碎脂肪组织和溶解成熟的脂肪细胞，产生包含可存活的干细胞/间质细胞的间质血管成分和细胞外基质。
一方面，本发明涉及从脂肪组织分离包括可存活的间质细胞/干细胞的间质血管成分和细胞外基质，方法包括用超声空化使用足以破碎组织和溶解成熟的脂肪细胞，同时保持间质细胞/干细胞的生存能力的时间、振幅和周期处理脂肪组织。
超声空化振幅和周期设置可以是可变的且取决于脂肪组织的量和工艺周期以便保持细胞生存能力。不应该超过细胞生存能力的温度范围。
另一方面，在超声空化期间，脂肪组织的温度保持在确保间质细胞/干细胞的生存能力的温度。
另一方面，脂肪组织的温度不超过约43℃至约45℃。
另一方面，用振幅设置为约20％至约75％及周期设置为约0.2至约0.9的超声设备用超声空化处理脂肪组织约10秒至约10分钟期间。
另一方面，在脂肪组织中放置超声空化设备探针，振幅设置为约50％，周期设置为约0.4秒至约0.5秒，并且穿过脂肪组织而升降探针约1分30秒至约1分40秒；并且，其中脂肪组织的温度保持在低于约43℃至约45℃的温度。
另一方面，本发明涉及根据本发明的方法分离的包括可存活的干细胞的间质血管成分。
另一方面，间质血管成分除了干细胞之外还包括可存活的细胞。
另一方面，本发明涉及根据本发明的方法分离的脂肪组织来源的干细胞。
另一方面，本发明涉及一种治疗受试者骨关节炎、关节相关的炎症性疾病、炎症性关节炎疾病、软组织损伤或撕裂、软骨障碍、骨病、自身免疫性疾病、肌营养不良、慢性疲劳、肺病症、肺炎症性疾病、神经系统失调、脊柱病症或神经障碍的方法，包括将根据本发明的脂肪组织来源的间质细胞/干细胞制剂给药至受试者。
另一方面，本发明涉及根据本发明的脂肪组织来源的间质细胞/干细胞制剂在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗骨关节炎、关节相关的炎症性疾病、炎症性关节炎疾病、软组织损伤或撕裂、软骨障碍、骨病、自身免疫性疾病、肌营养不良、慢性疲劳、肺病症、肺炎症性疾病、神经系统失调、脊柱病症或神经障碍。
另一方面，本发明涉及根据本发明的脂肪组织来源的间质细胞/干细胞制剂，所述制剂用于骨关节炎、关节相关的炎症性疾病、炎症性关节炎疾病、软组织损伤或撕裂、软骨障碍、骨病、自身免疫性疾病、肌营养不良、慢性疲劳、肺病症、肺炎症性疾病、神经系统失调、脊柱病症或神经障碍的治疗。
另一方面，本发明涉及一种从脂肪组织分离包括可存活的间质细胞/干细胞的间质血管成分的方法，包括用振幅和周期设置为确保脂肪组织的温度不超过约43℃至约45℃的超声设备用超声空化处理脂肪组织约1分30秒至约1分40秒。
另一方面，本发明涉及一种从脂肪组织分离包括可存活的间质细胞/干细胞的间质血管成分的方法，包括用振幅设置为约50％的超声设备处理脂肪组织，其中设备的周期和时间设置为确保脂肪组织温度不超过约43℃至约45℃。
另一方面，本发明涉及一种从脂肪组织分离包括可存活的间质细胞/干细胞的间质血管成分的方法，包括用周期设置为约0.4秒至约0.5秒的超声设备处理脂肪组织，其中设备的振幅和时间设置为确保脂肪组织的温度不超过约43℃至约45℃。
另一方面，本发明涉及一种从脂肪组织分离包括可存活的间质细胞/干细胞的间质血管成分的方法，包括用振幅设置为约50％和周期设置为约0.4秒至约0.5秒的超声探针用超声空化处理脂肪组织约1分30秒至约1分40秒。
另一方面，本发明涉及一种用于保持在通过超声空化从脂肪组织分离的间质血管成分中的间质细胞/干细胞的生存能力的方法，其中超声空化的时间、振幅和周期被选择为使得48小时的细胞培养之后间质细胞/干细胞可存活。
如本文中使用，术语“脂肪组织”是指任何的脂肪的组织。脂肪组织可以是褐色的脂肪组织或白色脂肪组织。优选地，脂肪组织为皮下白色脂肪组织。脂肪组织可来自任何具有脂肪组织的生物体。优选地，脂肪组织为哺乳动物的脂肪组织，更优选地，脂肪组织为人类的脂肪组织。人类脂肪组织的方便的来源为源于脂肪抽吸外科手术或其他外科手术的脂肪组织。然而，脂肪组织的来源或分离脂肪组织的方法对本发明不是关键的。
如本文中使用，术语“间质血管成分”是指来源于脂肪组织中发现的血管和外围组织的包括细胞的成分。成分可以包括不同细胞种类，包含，举例来说，间充质干细胞、早期间充质/间质前体细胞、脂肪组织来源的干细胞、Muse-AT细胞、造血细胞、造血干细胞、血小板、枯否细胞、破骨细胞、巨核细胞、粒细胞、NK细胞、内皮前体细胞或祖细胞、多能细胞、CD34+细胞、Stro-1+细胞、Stro-3+细胞、CD29+细胞、CD166+细胞、Thy-1+或CD90+干细胞、CD44+细胞、免疫细胞(诸如单核细胞、白细胞、淋巴细胞、Band T细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性白细胞、嗜中性粒细胞、中性粒细胞等等)。间质血管成分还包括本文中公开的表达任何标记物的细胞或其任何组合。如本文中使用，术语“间质血管成分”包括在它的范围的术语，诸如“间充质血管成分”、“间充质成分”、“间质成分”等等。
如本文中使用，术语“间充质干细胞”是指间质细胞或间充质细胞或早期间充质/间质前体或脂肪组织来源的间质细胞/干细胞，脂肪组织来源的间质细胞/干细胞是多能的并且能够作为各种不同细胞类型(诸如但不限于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉和神经元/神经胶质细胞谱系)的干细胞前体。
间充质干细胞组成来源于，例如，脂肪组织和骨髓的亚群。如本文中使用，术语“间充质干细胞”包括在它的范围的术语，诸如“间质干细胞”、“骨髓间质细胞”、“多能间质细胞”、“间充质前体细胞”、“Muse-AT”、脂肪组织来源的间质细胞/干细胞等等。
如本文中使用，术语“分化”是指细胞达到成熟的终态，使得细胞发育完全并且证明生物学特殊化和/或适于特殊环境和/或功能。典型地，分化细胞的特征为基因的表达，该基因在该细胞中编码了分化相关的蛋白质。例如，在白细胞中的GALC的表达是晚期分化的白细胞的典型的例子。
术语“前体细胞”、“祖细胞”和“干细胞”在本领域和本文中可互换地使用并且是指多能性、或谱系未定型的，祖细胞，其潜在地有无限数的有丝分裂的能力以更新它本身或产生分化为所需的细胞类型的后代细胞。相对于多能性干细胞，谱系定型的祖细胞通常被认为没有引起很多彼此表现型不同的细胞类型的能力。反而，祖细胞产生一种或者也许两种谱系定型的细胞类型。
如本文中使用，术语“多能的”、“多潜能”或“多潜能性”意指干细胞将分化为多于一种细胞类型的能力。
如本文中使用，术语“同种异体的”意指来源于同类的不同哺乳动物的任何物质。
如本文中使用，术语“自体的”意指来源于个体和再导入至个体的任何物质。
如本文中使用，术语“细胞制品”意指包括细胞但可以含有其他物质(诸如生长因子、细胞外基质等等)的制品。
除非上下文中明确要求其他，则整个说明书和权利要求书中词语“包括”、“包含”等等被解释为包括在内的意思，与排外或者穷举的意思相反，换句话说，是“包括，但不限于”的意思。
附图说明
图1：P-层。
图2：来自由超声空化处理的脂肪组织生长的间质血管成分的塑料粘附细胞的吉姆萨染色菌落。
图3：由超声空化处理的脂肪组织生长的间充质干细胞的细胞培养。
图4：超声空化振幅设置对脂肪组织温度的影响-将20克的脂肪组织用周期设置0.4秒来处理11/2分钟。
图5：超声空化周期设置对脂肪组织温度的影响-将20克的脂肪组织用振幅设置50％来处理11/2分钟。
图6：超声空化振幅对间质血管成分细胞生存能力的影响-将20克的脂肪组织用周期设置0.4秒来处理11/2分钟。
图7：从超声空化处理的脂肪组织获得的细胞的流式细胞仪分析-通过由超声空化分离的40克的脂肪组织的荧光细胞核来进行细胞计数。
具体实施方式
在一个实施例中，本发明的方法使用具有放置为与脂肪组织接触的探针的超声空化设备，以破除或溶解脂肪组织中的脂肪细胞并释放间质血管成分。使用特殊的超声空化设备对本发明而言是不是关键的。一个合适的选择是HIELSCHLER超声处理器，其为技术先进的高强度超声处理器。该设备能够安全地处理从微升至升的宽范围的有机物质和无机物质。其他可以使用的设备包括Vibra-CellTM设备(Sonics)、VASER(SoltaMedical)或QSonica超声处理器。
在另一个实施例中，可以将生物溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液或生理盐水溶液)中的脂肪组织放置于冷藏环境(组织/细胞不应低于约2℃)。将超声空化设备探针放置于脂肪组织中并且将振幅设置为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％，周期设置为约0.2秒、约0.3秒、约0.4秒、约0.5秒、约0.6秒、约0.7秒、约0.8秒、约0.9秒，时间设置为约10秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒、约60秒，约1分10秒、约1分20秒、约1分30秒、约1分40秒、约1分50秒、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟。优选地将振幅设置为约50％，周期设置为约0.4-0.5秒。在操作期间可以将探针调节于管内的不同的位置。在冷藏环境或室温下进行该过程，振幅、周期和时间调节为防止脂肪组织的温度上升至高于约43℃至约45℃，优选地，不上升至高于37℃。取决于脂肪组织的量，超声空化的持续可操作有序的时间段，例如，对于较大量的脂肪组织，在管的两个不同位置将探针升降约1分钟，然后约40秒，或者对于较少量的脂肪组织，在管的上部将探针升降约1分钟，然后约30秒，或者探针被插入至脂肪组织约30秒，停止约10秒，然后重复，然后上升至脂肪组织的上部约30秒。超声空化的顺序和计时(具体地，振幅、周期和应用时间)可以变化，但是被确定至通过防止脂肪组织的温度上升至高于理想的37℃或者不超过约43℃至约45℃而确保在间质血管成分中干细胞的最佳的细胞数量和生存能力的程度。通过简单的试错法能够容易地确定这些参数。典型地，振幅为约50％，周期为约0.4秒至约0.5秒并且时间为约1分30秒。如果振幅增加，周期或者时间能够因而减少(或者反之亦然)以确保脂肪组织的温度不会上升至约高于43℃至约45℃。如上所述，该处理不包括意欲分解胶原的胶原酶或等效酶的添加，因为细胞离解代替地通过超声空化实现。超声处理后，管中存在浓溶液(其不能被过滤或者容易分为间质血管成分)并可以用离心机分离该浓溶液。
离心作用导致3层-上部脂质层，含有细胞外基质、脂肪细胞和间质血管细胞的中间浮动层(称作P-层)，以及底部流体层。去除(当加入等渗的流体时脂质层的去除允许细胞的分离)并排出上部脂质层，并将管中剩下的内容物充分混合并向管中加入溶液，典型地，0.9％盐水、PBS或其他任何等渗溶液。进一步的离心作用带来细胞和细胞外基质沉降并在底部沉淀，剩下的脂肪细胞上升到管的上部。沉淀物含有细胞外基质和包括可存活的和功能的间质细胞/干细胞(包括间充质干细胞)的间质血管成分。沉淀物通过滤纸可以过滤以去除任何大的碎片。细胞溶液可以按原样来使用，或通过进一步的离心并且去除过量的流体而被进一步浓缩来使用。移开样品用于细胞计数。
细胞生存能力和功能性通过如那些本领域熟悉的细胞培养技术来确定。可以使用FAC仪器和荧光细胞核结合染料，即Guava PCA系统和Guava Viacount技术细胞。
典型地，使用这个方法的来源于20g的脂肪组织的细胞数在约4000万至2亿个细胞之间，即约200万至1000万细胞/克，其大于来自胶原酶的分离的细胞数(典型地产生约50万细胞/克脂肪组织)。
在另一个实施例中，方法包括以下步骤：
(a)将超声空化设备探针放置于约40g脂肪组织中并且将振幅设置为约50％和周期设置为约0.4秒至0.5秒；
(b)在脂肪组织的两个不同位置，穿过脂肪组织将探针升降约1分钟，然后约40秒；
(c)将脂肪组织在800g下离心5分钟；
(d)排出上部脂质层并且混合脂肪组织；
(e)加入等渗溶液并在800g下离心脂肪组织5分钟；
(f)得到的细胞沉淀物包括细胞外基质和包含可存活的干细胞的间质血管成分。
在另一个实施例中，方法包括以下步骤：
(a)将超声空化设备探针放置于约40g脂肪组织中并且将振幅设置为约50％和周期设置为约0.4秒至0.5秒；
(b)在脂肪组织的上部，穿过脂肪组织将探针升降约1分钟，然后约30秒；
(c)将脂肪组织在800g下离心5分钟；
(d)排出上部脂质层并且混合脂肪组织；
(e)加入等渗溶液并在800g下离心脂肪组织5分钟；
(f)得到的细胞沉淀物包括细胞外基质和包含可存活的干细胞的间质血管成分。
在另一个实施例中，干细胞是自体的或同种异体的。
间质血管成分或间质细胞/干细胞可以通过传统的给药途径，诸如静脉注射或关节内注射直接地注入于需要其的受试者中，或在给药之前能够进一步处理间质血管成分或间质细胞/干细胞以纯化(以及如果需要，在培养物中扩增)所需的细胞类型，诸如间充质干细胞、或STRO-1+细胞。
在一些实施例中，能够通过使用独特的细胞表面抗原和用于体外扩增的荧光激活细胞分选术(FACS)的分级分离，从间质血管成分分离、纯化或富集干细胞。
在一些实施例中，可以使用标准细胞培养技术在有分化或没分化的情况下培养间质血管成分或间质细胞/干细胞。可以将细胞培养至合适程度，且通过标准的方法对生存能力和收率进行评估。
在其他的实施例中，可以储存间质血管成分或间质细胞/干细胞用于以后的植入/注入(例如，通过低温保存的)。在细胞库中储存中期至长期也在本发明的范围内。
在处理的结束时，可以将间质血管成分或间质细胞/干细胞装在通过皮下、静脉内、肌肉内、或腹膜内技术给药至受体的递送装置，诸如注射器或静脉注射袋。换句话说，通过本领域的普通技术人员所知的任何方式将细胞放入至患者内，例如，细胞可以注射在血管中用于全身性或局部递送，注射在组织(例如，心肌、或者骨骼肌)内，注射在真皮(皮下的)内，注射在组织间隙(例如，心包或腹膜)，或注射在组织(例如，尿道周位置)内，或其他位置。优选的实施例包括通过针或导管放入，或与添加剂(诸如预制成的基质或脂肪组织来源的或间质来源的细胞外基质)结合通过外科植入放入。
间质血管成分或间质细胞/干细胞可以单独或者与其他细胞、组织、组织片断去矿物质骨、生长因子(诸如胰岛素)或药物(诸如噻格列酮(thiaglitazone)族的成员)、生物活性或惰性化合物、可吸收性塑料支架、脂肪来源的或者间质来源的格子和/或细胞外基质或其他用于提高细胞群的递送、效能、耐受性、或者功能的添加剂组合应用。在本发明的某些实施例中，将细胞给药至具有一种或者多种的细胞分化因子(诸如细胞因子类和生长因子)的患者。在其他实施例中，用富含血小板的血浆处理细胞。
在另一个实施例中，将间质血管成分或间质细胞/干细胞给药至受试者以治疗或防止受试者中的病症和疾病。
在另一个实施例中，病症或疾病为骨关节炎、关节相关的炎症性疾病、炎症性关节炎疾病、软组织损伤或撕裂、软骨障碍、骨病、自身免疫性疾病、肌营养不良、慢性疲劳、肺病症、肺炎症性疾病、神经系统失调、脊柱病症或神经障碍。
现在将参考描述了具体的组合物和使用方法的具体的但非限制性的示例来更详细地描述本发明。然而，应理解的是，包括具体的过程、组合物和方法的详细描述，仅仅用于举例说明本发明的目的。其不应该理解为，以任何方式对如以上陈述的本发明构思的广泛的描述的限制。
示例
示例1-通过脂肪抽吸制备脂肪组织
将过量的肿胀溶液(1升的生理盐水中，含有1mg肾上腺素，400mg至800mg利多卡因和10mL的8.4％碳酸氢钠溶液，该肿胀溶液超过在脂肪抽吸操作之前待吸出的脂肪抽吸的量)注入至皮下脂肪层(肿胀方法)内，然后使用具有例如2-3mm内径的套管(由金属制成，带抽吸器)用于脂肪抽吸操作。脂肪抽吸操作在本领域中是众所周知的，并且例如，能够参考BUNKODO，第429-469页出版的Biyo Seikei Shujutsu Practice 2(Cosmetic OperationPractice 2)，编辑Masanari ICHIDA、Ryusaburo TANINO和Yoshiaki HOSAKA，其通过参考全部合并到本文中。
用盐水洗涤吸出的脂肪。可以产生约50mL至10L的洗涤吸出物，并且得到的脂肪组织来源的细胞物质用于获得间质血管成分。
示例2-通过外科手术制备脂肪组织
通过外科手术，从给予了他们的知情同意的人受试者中获得脂肪组织。用本领域熟知的技术进行分离。简单地，从给予了他们的知情同意的人受试者抽出的脂肪组织中无菌分离人脂肪组织。得到的脂肪组织来源的细胞物质用于获得间质血管成分。
示例3–通过超声空化制备包含可存活的干细胞的间质血管成分(在振幅为40％和周期为0.5秒下超声空化1分40秒)
1)将来源于脂肪抽吸吸出物的脂肪组织45mL放置于50mL管中。
2)通过200g/2分钟离心去除过量的流体以分离出过量的流体和脂肪组织。将在管底部的过量的流体去除，典型地，剩下40mL的脂肪组织。
3)(任选的)将管放置在冷藏的环境中并且注意确保组织/细胞的温度不降到低于2℃。
4)将超声空化设备探针Hielschler UP200S放置于脂肪组织并将振幅设置为50％，周期设置为0.5秒。在管的两个不同位置(即，管的底部和上部)将探针升降1分钟，然后40秒，静止3分钟并且任选地重复该过程。注意防止脂肪组织温度上升到高于43℃，优选地不高于37℃。
5)超声处理之后，在管中观察到浓溶液并在300g下离心浓溶液5分钟。
6)离心后有3层-上部脂质层，含有细胞外基质和间质血管细胞的中间浮动层，以及底部流体层。
7)上部脂质层使用混合套管和注射器去除和排出(当加入等渗流体时脂质层的去除允许细胞的分离)，并且将管中的剩下的内容物充分混合以进一步破裂细胞外基质。
8)将等渗溶液(典型地0.9％盐水或PBS)加入到管至50mL并且将管在600g下离心5分钟，引发细胞和细胞外基质在底部沉降和沉淀。
9)在管的底部观察到大的沉淀物，大的沉淀物含有细胞外基质和含有可存活的和功能的干细胞的间质血管成分。然后使用混合套管和注射器使用大约15mL的流体去除沉淀物，并通过100um滤纸过滤沉淀物以去除任何大的碎片。
10)细胞溶液可以按原样来使用，或通过进一步的离心且去除过量的流体而被进一步浓缩来使用。
分离的间质血管成分的流式细胞仪分析显示可存活的细胞的存在(图1)。
示例4-通过超声空化制备包含可存活的干细胞的间质血管成分(在振幅为50％和周期为0.5秒下超声空化1分30秒)
1)将来源于脂肪抽吸吸出物的脂肪组织25mL放置于2x50mL离心管中。
2)通过200g/2分钟离心去除过量的流体以分离出过量的流体和脂肪组织。将在管底部的过量的流体去除，典型地，剩下20mL的脂肪组织。
3)(任选的)将管放置在冷藏的环境中或室温下并且注意确保组织/细胞的温度不降到低于2℃。
4)将超声空化设备探针Hielschler UP200S放置于脂肪组织并将振幅设置为50％，周期设置为0.5秒。在每个管的上部将探针升降1分钟，然后30秒。注意防止脂肪组织温度上升到高于43℃，优选地不高于37℃。
5)超声处理之后，在管中观察到浓溶液并在300g下离心浓溶液5分钟。
6)离心后有3层-上部脂质层，含有细胞外基质和间质血管细胞的中间浮动层，以及底部流体层。
7)上部脂质层使用混合套管和注射器去除和排出(当加入等渗流体时脂质层的去除允许细胞的分离)，并且将管中的剩下的内容物充分混合以进一步破裂细胞外基质。
8)将等渗溶液(典型地0.9％盐水或PBS)加入到管至50mL并且将管在600g下离心5分钟，引发细胞和细胞外基质在底部沉降和沉淀。
9)在管的底部观察到大的沉淀物，大的沉淀物含有细胞外基质和含有可存活的和功能的干细胞的间质血管成分。然后使用混合套管和注射器使用大约15mL的流体去除沉淀物，并通过100um滤纸过滤沉淀物以去除任何大的碎片。
10)细胞溶液可以按原样来使用，或通过进一步的离心并去除过量的流体而被进一步浓缩来使用。
示例5-通过超声空化制备包含可存活的干细胞的间质血管成分(在振幅为50％和周期为0.4秒下超声空化1分40秒)
1)将来源于脂肪抽吸吸出物的脂肪组织45mL放置于50mL管中。
2)通过200g/2分钟离心去除过量的流体以分离出过量的流体和脂肪组织。将在管底部的过量的流体去除，典型地，剩下40mL的脂肪组织。
3)将超声空化设备探针Hielschler UP200S放置于脂肪组织并将振幅设置为50％，周期设置为0.4秒。在管的两个不同位置(即，管的中间和上部)将探针升降1分钟，然后40秒，注意防止脂肪组织温度上升到高于43℃，优选地不高于37℃。
4)超声处理之后，在管中观察到浓溶液并在800g下离心浓溶液5分钟。
5)离心后有3层-上部脂质层，含有细胞外基质和间质血管细胞的中间浮动层，以及底部流体层。
6)上部脂质层使用混合套管和注射器去除和排出(当加入等渗流体时脂质层的去除允许细胞的分离)，并且将管中的剩下的内容物充分混合以进一步破裂细胞外基质。
7)将等渗溶液(典型地0.9％盐水或PBS)加入到管至50mL并将管在800g下离心5分钟，引发细胞和细胞外基质在底部沉降和沉淀。
8)在管的底部观察到大的沉淀物，大的沉淀物含有细胞外基质和含有可存活的和功能的干细胞的间质血管成分。然后使用混合套管和注射器使用大约15mL的流体去除沉淀物，并通过100um滤纸过滤沉淀物以去除任何大的碎片。
9)细胞溶液可以按原样来使用，或通过进一步的离心并去除过量的流体而被进一步浓缩来使用。
示例6-通过超声空化制备包含可存活的干细胞的间质血管成分(在振幅为50％和周期为0.4秒下超声空化1分30秒)
1)将来源于脂肪抽吸吸出物的脂肪组织25mL放置于2x50mL离心管中。
2)通过200g/2分钟离心去除过量的流体以分离出过量的流体和脂肪组织。将在管底部的过量的流体去除，典型地，剩下20mL的脂肪组织。
3)将超声空化设备探针Hielschler UP200S放置于脂肪组织并将振幅设置为50％，周期设置为0.4秒。在每个管的上部将探针升降1分钟，然后30秒。注意防止脂肪组织温度上升到高于43℃，优选地不高于37℃。
4)超声处理之后，在管中观察到浓溶液并在800g下离心浓溶液5分钟。
5)离心后有3层-上部脂质层，含有细胞外基质和间质血管细胞的中间浮动层，以及底部流体层。
6)上部脂质层使用混合套管和注射器去除和排出(当加入等渗流体时脂质层的去除允许细胞的分离)，并且将管中的剩下的内容物充分混合以进一步破裂细胞外基质。
7)将等渗溶液(典型地0.9％盐水或PBS)加入到管至50mL并将管在800g下离心5分钟，引发细胞和细胞外基质在底部沉降和沉淀。
8)在管的底部观察到大的沉淀物，大的沉淀物含有细胞外基质和含有可存活的和功能的干细胞的间质血管成分。然后使用混合套管和注射器使用大约15mL的流体去除沉淀物，并通过100um滤纸过滤沉淀物以去除任何大的碎片。
9)细胞溶液可以按原样来使用，或通过进一步的离心并去除过量的流体而被进一步浓缩来使用。
示例7–通过超声空化制备P-层
1)将来源于脂肪抽吸吸出物的脂肪组织25mL放置于2x50mL离心管中。
2)通过200g/2分钟离心去除过量的流体以分离出过量的流体和脂肪组织。将在管底部的过量的流体去除，典型地，剩下20mL的脂肪组织。
3)将超声空化设备探针Hielschler UP200S放置于脂肪组织并将振幅设置为50％，周期设置为0.4秒。在每个管的上部将探针升降1分钟，然后30秒。注意防止脂肪组织温度上升到高于43℃，优选地不高于37℃。
4)超声处理之后，在管中观察到浓溶液并在800g下离心浓溶液5分钟。
5)离心后有3层-上部脂质层，含有细胞外基质和间质血管细胞的中间浮动层(P层)，以及底部流体层(图1)。
9)将上部脂质层和底部流体层去除并使用混合套管收集中间P-层。
P-层溶液可以按原样来使用，或通过进一步的离心并去除过量的流体而被进一步浓缩或者用等渗溶液稀释来使用。
示例8-扩增的干细胞的制备
使用标准细胞培养基(例如，典型地用胎牛血清、人血清或无血清培养基补充的alphaMEM)没有分化地培养通过示例3或示例4的方法获得的细胞。初级培养物以1x106/100mm接种至平板并将在5％CO2或低氧环境下扩增细胞1-2传代。
来自示例3的分离的间质血管成分的培养显示可存活的细胞可以生长并且扩增(图2)，其具有间充质干细胞的形态(图3)。
示例9–超声空化振幅和周期对脂肪组织温度和细胞生存能力的影响
为了评估超声空化振幅和周期对脂肪组织温度的影响(图4和图5)，进行了实验。结果证明在以下情形下脂肪组织的温度上升至高于43℃：
·振幅高于50％(周期为0.4秒和时间为1分30秒)–见图4；和
·周期高于0.5秒(振幅为50％和时间为1分30秒)–见图5。
为了评估在紧接着空化后和48小时的培养之后超声空化振幅对细胞生存能力的影响，还进行了实验。虽然紧接着空化，增加的振幅没有显著地影响细胞生存能力(图6和图7)，但培养48小时的细胞的生存能力在超过50％的振幅下显著地降低(图6)。
示例10-富含血小板的血浆和富含生长因子的血浆的制备
1)麻醉之前采集血液。用2x9 mL柠檬酸葡萄糖(ACD-A)填充血液采集管(BDvacutainer)(真空压力)。使用18G或者更大的针抽血液以避免通过剪切激活血小板。通过将管换向3-4次混合血液管的内含物。
2)450gx10分钟离心ACD-A血液填充的管。
3)用相同的移液管从每个管去除血浆层(上部层)并且将血浆层放置于15ml的灭菌管中。血液不应受到干扰并且应消除静止在血液上的白细胞薄层。在红血细胞上最好留下5mm血浆层。含有富集血小板的血浆(PRP)可以按原样使用或者进行如下进一步处理。
4)2000g/10分钟离心含有血浆的管–在管的底部应形成血小板的小的沉淀物。
5)用移液管将上部贫血小板的血浆移除至1.5ml并排出。应使用同一移液管在剩下的1.5ml中再悬浮沉淀物。这是富含血小板的血浆(PRP)。
6)可以按原样使用PRP，或者如果需要，PRP与加入至PRP的150μl的葡萄糖酸钙(1mL注射器和针)粘在一起并充分混合。应将管放置在温水浴中(37℃-不摇动)或者留在室温更长时间段。PRP应形成固体凝胶。
7)固化之后，可以将PRP留在37℃(以加快过程)或者室温以在接下来的1-2小时(用于当准备将PRP加入到细胞时)被部分地溶解–这被称作富含生长因子的血浆(PRGF)。
示例11-用于注射的间质血管成分或P-层的制备
在注射前，可以用PRP或PRGE处理通过示例3至9的方法获得的细胞。在注射之前，典型地将PRGF 2.5mL直接加入到细胞沉淀物中。如示例12应用细胞和PRGF。如果PRP与间质细胞/干细胞(典型地5mL)一起使用，则PRP可以在注射之前与细胞一起加入，因为PRP可以开始引发固体凝胶，或者PRP可以在给药间质血管成分之后分别注射。
示例12-将脂肪组织的间质血管成分给药至带有骨关节炎的患者
广泛使用西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数(WOMAC)，由健康专家使用专有的标准化调查表以评价带有膝盖和髋部的骨关节炎(包括关节的疼痛、僵硬、和躯体功能)的患者的疾病。
在关节炎研究中，WOMAC是最广泛使用的评估。WOMAC测量用于疼痛(评分范围0–20)的五个项目，用于僵硬(评分范围0–8)的两个项目，以及用于功能限制(评分范围0–68)的17个项目。关节炎疼痛评分系统范围从0–无疼痛/残疾至96–最剧烈的疼痛/残疾。
WOMAC由分成3个子指标的24项目组成：
·疼痛(五个项目)：行走期间、使用楼梯、在床上、坐或躺、以及站立
·僵硬(2个项目)：第一次醒着之后和当天的晚些时候
·躯体功能(17个项目)：使用楼梯、从坐到起、站立、弯曲、行走、上车/下车、购物、穿上袜子/脱下袜子、起床、躺在床上、进浴室/出浴室、坐、进厕所/出厕所、重家务、轻家务
髋部功能障碍和骨关节炎结果评分(HOOS)包括测量质量以评价带有髋骨关节炎(OA)或全髋关节置换术(THR)的患者。HOOS意欲用于有骨关节炎(OA)或没有骨关节炎的髋部残疾。HOOS由5个子指标组成；疼痛、其他症状、日常生活中的功能(ADL)、运动和娱乐中的功能(运动/娱乐)、以及髋部相关的生活质量(QOL)。
患者1-髋部的骨关节炎
根据示例3制备脂肪组织的间质血管成分，用PRGF处理间质血管成分并通过关节内注射至每个髋部(84x106细胞)和静脉注射(130x106细胞)来给药间质血管成分。患者的治疗前HOOS分数为治疗前102，并且在5周治疗后，HOOS分数减少到23-77％的改善。
患者2-膝盖的骨关节炎
根据示例3制备脂肪组织的间质血管成分，用PRGF处理间质血管成分并通过关节内注射至每个膝盖(100x106细胞)和静脉注射(79x106细胞)来给药间质血管成分。患者的治疗前WOMAC分数为59，并且在4周治疗后，WOMAC分数减少到28-61％的改善。
患者3-膝盖的骨关节炎
除了振幅设置为90％和周期设置为0.9且时间为3分钟(用20℃的凝胶包冷却脂肪组织以防止温度上升至高于43℃)之外，根据示例3制备脂肪组织的间质血管成分，用PRGF处理间质血管成分并通过关节内注射至每个膝盖(100x106细胞)和静脉注射(236x106细胞)来给药间质血管成分。患者的治疗前WOMAC分数为37，并且在11周治疗后，WOMAC分数减少到7-81％的改善。
患者4–膝盖的骨关节炎
根据示例4制备脂肪组织的间质血管成分，用PRP处理间质血管成分并通过关节内注射至每个膝盖(86x106细胞)和静脉注射(86x106细胞)来给药间质血管成分。患者的治疗前WOMAC分数为39，并且6周治疗后，WOMAC分数减少到17-56％的改善。
患者5-膝盖的骨关节炎
根据示例6制备脂肪组织的间质血管成分，并通过关节内注射至每个膝盖(175x106细胞)和静脉注射(150x106细胞)来给药间质血管成分。患者的治疗前WOMAC分数为38，并且2个月治疗后，WOMAC分数减少到8-78％的改善。
患者6-膝盖的骨关节炎
根据示例5制备脂肪组织的间质血管成分，并通过关节内注射至每个膝盖(85x106细胞)和静脉注射(85x106细胞)来给药间质血管成分。患者的治疗前WOMAC分数为56，并且7个月治疗后，WOMAC分数减少到28-50％的改善。
示例13-将P-层给药至带有骨关节炎的患者
患者7-膝盖的骨关节炎
根据示例7制备P-层细胞(5ml)，并通过关节内注射至膝盖和静脉注射(170x109细胞)来给药P-层细胞。患者的治疗前WOMAC分数为58，并且3个月治疗后，WOMAC分数减少到10-82％的改善。
患者8-膝盖的骨关节炎
根据示例7制备P-层细胞(2.5ml)并通过关节内注射至左膝盖和静脉注射(200x106细胞)来给药P-层细胞。患者的治疗前WOMAC分数为37，并且2个月治疗后，WOMAC分数减少到2-94％的改善。
示例14–将脂肪组织的间质血管成分给药至带有其他病症的患者。
患者9-风湿症关节炎
根据示例5(伴随以下改变-振幅90％，周期0.2，4分钟)制备脂肪组织的间质血管成分并通过静脉注射(276x107细胞)给药间质血管成分。第一周患者感觉良好，但之后风湿症关节炎再次爆发。患者感觉更加警觉。
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