具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项(个)”，或，“a，b和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

本申请实施例第一方面提供一种医用钛植入物的制备方法，包括以下步骤：

S10.获取预处理后的钛基体；

S20.将钛基体分散在多巴胺溶液中进行聚合反应，得到表面结合有聚多巴胺层的复合钛基体；

S30.制备含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物和褪黑素的前驱液，将前驱液在复合钛基体表面进行纺丝处理，得到医用钛植入物。

本申请实施例第一方面提供的医用钛植入物的制备方法，首先将钛基体通过浸泡等方式分散在多巴胺溶液中，在钛基体表面修饰一层聚多巴胺层，既提高钛基体的生物相容性，又有利于后续在多巴胺预处理后的钛基体表面构建纳米纤维层，增强纳米纤维层与钛基体之间的粘附性，使其结合更加牢固、稳定。然后，将含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和褪黑素的前驱液，在聚多巴胺层表面进行纺丝处理制备纳米纤维层，该纳米纤维层具有极高的孔隙率和比表面积，利于骨原细胞与成骨细胞的黏附、增殖和分化，以及新生血管的生长，促使骨组织向孔隙内生长。本申请实施例制备的医用钛植入物中，纺丝制备的纳米纤维层中含有褪黑素，褪黑素具有抗氧化活性，同时含有碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、骨钙蛋白和骨保护素的基因表达，能促进新骨形成。同时抑制NF-kB(核因子激活的B细胞的k-轻链增强)配体的受体激活剂(RANKL)，从而抑制骨溶解。另外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物不但具有良好的生物相容性，而且能够通过纺丝形成均匀小直径纤维，使褪黑素稳定且均匀的分布在钛基体的纳米纤维层中；又具有合适的体内降解速率，能在1～2月内大致维持纳米纤维网络结构，使褪黑素具有持续且长效的药物缓释速率，从而使医用钛植入物发挥长效的促进骨形成的作用。体外实验表明，本申请实施例医用钛植入物，在糖尿病环境中能促进细胞中抗氧化酶的释放，减少氧化应激对细胞的伤害，促进成骨细胞的分化、附着和增殖，抑制破骨细胞的分化，能极大改善糖尿病环境中钛-骨界面的骨再生和骨整合效果。

在一些实施例中，上述步骤S10中，获取预处理后的钛基体步骤包括：对纯钛片进行抛光处理，出去钛基体表面的氧化层，使纯钛表面裸露出来，然后通过超声清洗1～3次除去表面杂质，干燥得到预处理后的钛基体。在一些具体实施例中，对纯钛片进行抛光处理后，超声清洗2次，每次10～20分钟。

在一些实施例中，上述步骤S20中，多巴胺溶液中，盐酸多巴胺的浓度为1～3mg/ml，溶液为pH值为7～9的Tris-HCl缓冲液。本申请实施例盐酸多巴胺在pH值为7～9的Tris-HCl缓冲液中溶解分散效果好，形成的多巴胺溶液稳定性好，浓度为1～3mg/ml的多巴胺溶液在钛基体表面有最佳的聚合成膜效果，通过聚多巴胺薄膜层保证纺丝纳米纤维层与钛基体的粘附性。若浓度过低，则难以在钛基体表面形成完整的聚盐酸多巴胺膜层；若浓度过高，则盐酸多巴胺容易自聚合，同样不利于在钛基体表面形成厚度均一，致密的聚盐酸多巴胺膜层。在一些具体实施例中，多巴胺溶液中，盐酸多巴胺的浓度为1～2mg/ml或者2～3mg/ml，溶液为pH值为7、8、8.5或9的Tris-HCl缓冲液。

在一些实施例中，聚合反应的步骤包括：将钛基体浸泡在多巴胺溶液中，反应12～48小时。本申请实施例将钛基体浸泡在多巴胺溶液中反应12～48小时，使盐酸多巴胺充分聚合在钛基体表面形成聚盐酸多巴胺膜层，得到复合钛基体。在一些具体实施例中，浸泡反应时间可以是12～24小时，或者24～48小时等。

在一些实施例中，上述步骤S30中，制备含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物和褪黑素的前驱液的步骤包括：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解在有机溶剂中后，添加褪黑素进行混合处理，得到前驱液。本申请实施例先将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解在有机溶剂中，形成分散均匀且稳定的聚合物浆料后，再将褪黑素分散在聚合物浆料中，通过混合处理，使褪黑素分散均匀，从而得到混合分散均匀的前驱液。

在一些实施例中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，乳酸和乙醇酸的质量比为(1～3):1。本申请实施例聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，聚乳酸(PLA)生物相容性好，材料拉伸强度较大，通过与羟基乙酸(乙醇酸)共聚，可改善其亲水性，增加聚乳酸-羟基乙酸共聚物的降解速率可调性与拉伸延长率，乙醇酸比例越高，PLGA的拉伸延长性能越好，但降解速率也会加快，会导致纺丝的纳米纤维网络结构易降解破坏，药物缓释和促成骨作用时间都会缩短。本申请实施例聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，乳酸和乙醇酸的质量比为(1～3):1，既确保了PLGA在纺丝过程中的拉伸性能，使其能够拉伸成足够细的纤维，有利于制备纳米纤维层，又使PLGA有适中的降解速率，能在1～2月中大致维持纤维网络结构，使褪黑素能够缓慢且持久的释放药物，促进新骨形成。在一些具体实施例中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，乳酸和乙醇酸的质量比可以是1:1、2:1或者3:1等。

在一些实施例中，前驱液中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量百分浓度为10～20％，该质量百分浓度的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，既确保了前驱液的纺丝效果，有利于形成纤维直径细小的纳米纤维层，具有极高的孔隙率和比表面积，利于骨原细胞与成骨细胞的黏附、增殖和分化，以及新生血管的生长，促使骨组织向孔隙内生长。聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度会影响前驱液的粘度，若聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度过低，则前驱液的粘度太低，在纺丝过程中会以雾状液滴而非连续纤维的形式喷出；若聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度过高，则难以形成泰勒锥，前驱液从针头流下而非以极细的射流形式喷出，同样不利于纺丝。在一些具体实施例中，前驱液中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量百分浓度可以是10～13％、13～16％、16～20％等。

在一些实施例中，前驱液中，褪黑素的质量为聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量的5～20％，即，前驱液中褪黑素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA的质量比为(0.05～0.2)：1；褪黑素的该浓度含量，有最佳的抗氧化活性，可显著促进新骨形成。若褪黑素含量过低，则促进新骨形成的效果不佳；若褪黑素含量过高，会使纺丝纤维轮廓不清晰，互相粘连融合，导致纺丝膜孔隙率降低，比表面积减小，不利于骨原细胞与成骨细胞的黏附、增殖和分化。在一些具体实施例中，前驱液中，褪黑素的质量可以是聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的5～10％、10～15％、15～20％等。

在一些实施例中，前驱液中，溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃中的至少一种，这些极性有机溶剂对PLGA和褪黑素均有较好的溶解分散效果。

在一些实施例中，前驱液中，溶剂包括体积比为(3～5)：(5～7)的N,N-二甲基甲酰胺和氯仿。PLGA在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和氯仿(三氯甲烷，TCM)中均能较好的溶解；褪黑素在DMF中溶解效果更好，但DMF沸点为152.8℃，不易挥发，后续纺丝要求溶剂挥发速率较高，否则纤维无法及时固化，易互相交融，孔隙结构减少，比表面积显著降低，因此，采用沸点为61.2℃的TCM与DMF混合使用，既确保溶剂对PLGA和褪黑素的溶解效果，又确保溶剂易挥发除去，改善后续纺丝的成丝效果。在一些具体实施例中，前驱液中溶剂包括体积比为3:7的N,N-二甲基甲酰胺和氯仿。

在一些实施例中，上述步骤S30中，纺丝处理的条件包括：在正电压为12～18kV，负电压为1～3kV，推料速率为0.001～0.002mm/s，针孔内径为0.5～0.8mm的条件下，在复合钛基体表面进行静电纺丝处理15～30分钟，在复合基体表面形成纳米纤维，通过真空干燥除去溶剂成分，在复合钛基体上形成纳米纤维层，得到医用钛植入物。本申请实施例中，采用静电纺丝处理，更有利于形成小直径均匀的纳米纤维层，且对纳米纤维的直径可灵活控制，纤维稳定性好。在静电纺丝过程中，静电纺丝的推料速度越快，针头与接收板间电场越小，纤维直径就会越大，比表面积随之减小。过小的比表面积不利于溶剂的及时挥发，使得薄膜的纤维结构易互相交融，则形成的纳米纤维层中比表面积和孔隙率降低，从而降低了骨原细胞与成骨细胞的黏附、增殖和分化和新生血管的生长效率。

在一些实施例中，纳米纤维层中纤维的直径为400～850nm，该直径大小的纤维既确保了医用钛植入物的具有较高的孔隙率和比表面积，同时确保了纤维有较长的降解速率以及褪黑素的持续释放速率。若纤维直径过细，会加快纳米纤维层中纤维降解和药物释放速率过快，钛植入物的涂层有效作用时间缩短。若纤维直径过大，则会降低纳米纤维层的孔隙率和比表面积，不利于骨原细胞与成骨细胞的黏附、增殖和分化和新生血管的生长，从而不利于骨组织向孔隙内生长。在一些具体实施例中，纳米纤维层中纤维的直径可以是400～450nm、450～500nm、500～550nm、550～600nm、600～700nm、700～800nm、800～850nm等。

在一些实施例中，纳米纤维层的厚度为5～10μm，若纳米纤维层过薄，则载药量不足，作用时间缩短，且骨组织黏附长入的空间不足；若纳米纤维层过厚，则纳米纤维层易脱落形成碎屑，造成炎症隐患。在一些具体实施例中，纳米纤维层的厚度可以是5～6μm、6～7μm、7～8μm、8～10μm等。

本申请实施例第二方面提供一种医用钛植入物，包括钛基体，结合在钛基体表面的聚多巴胺层，结合在聚多巴胺层背离钛基体表面的纳米纤维层，纳米纤维层中包含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物和褪黑素。

本申请实施例第二方面提供的医用钛植入物，包括钛基体，结合在钛基体表面的聚多巴胺层，结合在聚多巴胺层背离钛基体表面的纳米纤维层；其中，聚多巴胺层不但可提高生物相容性，而且可以提高纳米纤维层与钛基体的粘附性能，提高结合稳定性。纳米纤维层中包含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物和褪黑素，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有良好的生物相容性，合适的体内降解速率，而且具有优异的拉伸延长性能，使褪黑素稳定且均匀的分布在纳米纤维层中；褪黑素具有抗氧化活性，并能促进新骨形成。本申请实施例医用钛植入物，具有极高的孔隙率和比表面积，利于骨原细胞与成骨细胞的黏附、增殖和分化，以及新生血管的生长，促使骨组织向孔隙内生长。

在一些实施例中，纳米纤维层的厚度为5～10μm，若纳米纤维层过薄，则载药量不足，作用时间缩短，且骨组织黏附长入的空间不足；若纳米纤维层过厚，则纳米纤维层易脱落形成碎屑，造成炎症隐患。

在一些实施例中，纳米纤维层中纤维的直径为400～600nm，该直径大小的纤维既确保了医用钛植入物的具有较高的孔隙率和比表面积，同时确保了纤维有较长的降解速率以及褪黑素的持续释放速率。

在一些实施例中，纳米纤维层中，聚乳酸-乙醇酸和褪黑素的质量比为1：(0.05～0.2)，纳米纤维层中聚乳酸-乙醇酸和褪黑素质量比，同时确保了纳米纤维层的孔隙、比表面积、新骨促进效果。

本申请实施例医用钛植入物可通过上述实施例方法制得。

本申请实施例第三方面提供一种医用钛植入物的应用，将上述方法制备的医用钛植入物，或者上述的医用钛植入物应用到糖尿病环境中。

本申请第三方面将上述实施例提供的医用钛植入物，应用到糖尿病环境中，通过研究表明，本申请上述实施例医用钛植入物在糖尿病环境中能促进细胞中抗氧化酶的释放，减少氧化应激对细胞的伤害，促进成骨细胞的分化、附着和增殖，抑制破骨细胞的分化，能极大改善糖尿病环境中钛-骨界面的骨再生和骨整合效果。

为使本申请上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本申请实施例医用钛植入物及其制备方法和应用的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。

实施例1

一种医用钛植入物，其制备包括步骤：

①纯钛基体表面预处理：将抛光的钛片超声清洗两次，每次20分钟。

②聚多巴胺表面修饰：将抛光清洗后的钛片浸泡在用Tris-HCl缓冲液(10mmol，pH＝8.5)配置的多巴胺溶液(2mg/ml)中，反应24小时后取出，用去离子水超声清洗3次，每次10分钟，然后在27℃下真空干燥24小时，制得表面具有聚多巴胺薄膜的钛片(PDA-Ti)。

③静电纺PLGA纳米纤维薄膜修饰：用TCM/DMF(7/3,v/v)混合溶剂溶解PLGA，浓度为16％(m/v)，随后分别加入一定量的褪黑素，配置浓度为5％的褪黑素，得到褪黑素-PLGA溶液并搅拌两小时，得到前驱液。将前驱液装入5ml的注射器，使用20G针头在正压16kV，负压2kV，推料速度0.0016mm/s的条件下进行静电纺丝。PDA-Ti作为接收基底，电纺20分钟后放入真空干燥箱烘干24小时，即得医用钛植入物5％[email protected]样品。

实施例2

一种医用钛植入物，其与实施例1的区别在于：步骤③中褪黑素的浓度为10％，得到10％[email protected]。

实施例3

一种医用钛植入物，其与实施例1的区别在于：步骤③中褪黑素的浓度为15％，得到15％[email protected]。

实施例4

一种医用钛植入物，其与实施例1的区别在于：步骤③中褪黑素的浓度为20％，得到20％[email protected]。

对比例1

一种医用钛植入物，其与实施例1的区别在于：不进行步骤②和③处理，得到纯Ti。

对比例2

一种医用钛植入物，其与实施例1的区别在于：步骤③中褪黑素的浓度为0％，得到0％[email protected]。

进一步的，为了验证本申请实施例医用钛植入物的进步性，对实施例1～4和对比例1～2制备的医用钛植入物进行如下性能测试。

1、表面形貌检测：采用扫描电镜(FEI，NanoSEM 450)对喷金后的实施例1制备的医用钛植入物的形貌进行观测。

测试结果：如附图1中A和B所示，纤维丝交错分布在钛片上形成了致密的高孔隙率纳米纤维网状结构，极大的比表面积有利于骨细胞的黏附与生长。

2、体外实验：使用高糖培养基模拟一型糖尿病细胞培养环境，将MC3T3细胞系(小鼠成骨细胞系)分别接种于处理后的实施例1～4和对比例1～2医用钛植入物的表面，分别做三组，构建糖尿病环境“钛-骨”界面体外模型。

3、医用钛植入物的褪黑素载药率的测试：

实验方法：用DMF溶解褪黑素制备褪黑素标准溶液，使用紫外分光光度计测量上述标准溶液在褪黑素最大吸收波长的吸光度(A)，以褪黑素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，用线性回归分析绘制出褪黑素含量的标准曲线。取4种不同褪黑素浓度(5％、10％、15％、20％)的载药纳米纤维薄膜各100mg，分别放入500mL的DMF中搅拌至完全溶解，测量四组溶液在褪黑素最大吸收波长处的吸光度，根据标准曲线计算褪黑素的浓度。四种浓度的纳米纤维涂层样品的褪黑素载药率可由以下公式计算：

褪黑素载药率(％)＝(涂层中褪黑素实际含量(m₁))/(纤维涂层质量(m₂))

将4种样品各取40mg分别浸泡在40mL的PBS缓冲液里，密封后置于恒温水浴振动筛中(T＝37.0±0.5℃，振动速度120r/min)。随后在不同时间点周期性地取每组溶液3ml，测量吸光度后倒回。每5天更换新的PBS缓冲液。用测量的吸光度通过标准曲线来计算PBS缓冲液中褪黑素的含量，最后计算累计数据绘制体外褪黑素缓释曲线。

测试结果：如附图2所示，实施例1～4搭载不同浓度褪黑素的医用钛植入物中褪黑素包覆率均在70％以上，说明褪黑素被有效搭载到医用钛植入物的纳米纤维涂层内。如附图3所示，实施例1～4搭载不同浓度褪黑素的医用钛植入物中褪黑素在1～15天期间释放较快(80％左右)，后15～35天释放速度虽减缓，但依然持续释放着，表明PLGA纳米纤维层是一种良好的药物缓释载体。

4、利用CCK8法检测细胞存活和生长情况：在第1、第4、第7天使用CCK8法检测细胞增殖状况。

将覆盖MC3T3的医用钛植入物用胰蛋白酶消化，在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)，向每孔加入10μl CCK溶液，将培养板在培养箱内孵育2-3小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

测试结果：如附图4所示，与对比例2(0％@PLGA)和对比例1(纯Ti，对照组)相比，实施例1～实施例3在第四天时，附着在褪黑素浓度为15％的医用钛植入物的纳米纤维涂层的MC3T3细胞数量显著增加。另外，在第七天附着在褪黑素浓度为10％(实施例2)，15％(实施例3)的纳米纤维涂层的MC3T3细胞增殖活力有增强，尤其是在褪黑素浓度为15％(实施例3)的纳米纤维涂层的MC3T3细胞增殖活力显著增强。

结果分析：相对于对比例2的0％@PLGA和对比例1的纯钛片，本申请实施例1～3医用钛植入物中钛表面复合褪黑素PLGA静电纺纳米纤维层对MC3T3细胞有更好的促进增殖的效果。

5、成骨分化相关关键因子表达：实时定量PCR检测成骨相关细胞因子mRNA表达水平：Runx2、ALP、OPN，GAPDH作为管家基因进行对照。

测试结果：如附图5(以对比例1作为比较)，附图6(以对比例2作为比较)所示，与对比例2(0％@PLGA)、对比例1(纯Ti，对照组)相比，糖尿病环境下，附着在褪黑素浓度分别为5％(实施例1)，10％(实施例2)，15％(实施例3)，20％(实施例4)的医用钛植入物上的MC3T3细胞的成骨相关因子表达显著上调，说明本申请实施例1～4的医用钛植入物中钛表面复合褪黑素PLGA静电纺纳米纤维层，对糖尿病环境下“钛-骨”界面成骨细胞的成骨分化的抑制有明显改善作用。

6、实时定量PCR检测细胞内抗氧化酶相关基因的mRNA表达水平：SOD(超氧化物歧化酶)，SIRT1(去乙酰化酶)，CAT(过氧化氢酶)，GAPDH作为管家基因进行对照。

测试结果：如附图7(以对比例1作为比较)，附图8(以对比例2作为比较)所示，与对比例2(0％@PLGA)、对比例1(纯Ti，对照组)相比，糖尿病环境下，附着在褪黑素浓度分别为5％(实施例1)，10％(实施例2)，15％(实施例3)的医用钛植入物上的MC3T3细胞内CAT，SOD，SIRT1基因表达均显著增强。实验结果表明本申请实施例1～4的医用钛植入物中钛表面复合褪黑素PLGA静电纺纳米纤维层，促进糖尿病环境下“钛-骨”界面的成骨细胞抗氧化酶的释放，减弱了细胞内的氧化应激。

7、分别对实施例1～实施例4制备的医用钛植入物中纳米纤维纺丝的直径分布情况进行了测量，其中，实施例1纤维直径如附图9所示，直径分布为400～700nm；实施例2纤维直径如附图10所示，直径分布为550～750nm；实施例3纤维直径如附图11所示，直径分布为550～800nm；实施例4纤维直径如附图12所示，直径分布为550～850nm。从附图可知，本申请实施例1～4制备的医用钛植入物中纳米纤维的直径小且分布较均匀。

8、利用台阶仪分别对实施例1～实施例4与对比例1(0％@PLGA)制备的医用钛植入物中纳米纤维纺丝的薄膜厚度采用KLAP-7探针式表面轮廓仪进行了测量，结果如下表1所示。其中，实施例1薄膜厚度为6.98μm，实施例2薄膜厚度为7.55μm，实施例3薄膜厚度为6.15μm，实施例4薄膜厚度为6.39μm，对比例1薄膜厚度为6.12μm。从附图可知，本申请实例1～4制备的医用钛植入物中纳米纤维层的厚度均匀，范围为6～7μm。

表1

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。