具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

本申请中，CCK-8法检测细胞活力的方法为：

将包被后的细胞加入10(V/V)％RPMI培养基(2mM L-谷氨酰胺，10％FCS/FBS和100U/mL青霉素/链霉素)接种在96孔板中(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养12小时(37℃，5％CO2)。取出培养板，向每孔加入10μl CCK8溶液，将培养板在培养箱内孵育，在孵育的4小时内用酶标仪测定在450nm处的吸光度。其中，mM表示毫摩尔/L。

本申请中，统计方法采用GraphPad Prism软件进行分析，数据以均值±标准差表示，两组间和多组间显著性检验分别采用T检验和单因素方差分析。表示P<0.05为有统计学意义。

本申请中，流式细胞术的检测样品制备为：数据中所标记的CD3、CD4、CD8、CD45.2、H2Kb、CD69以及CD107a均为膜蛋白。细胞处理计数后，用细胞洗涤液(含2％BSA的PBS)重悬细胞，使细胞浓度为1×10⁷/mL。空白对照管不加抗体，待测样本管分别加入说明书用量的靶标抗体，充分混匀，至4℃孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应。加入适量细胞洗涤液，1500rpm离心5min，弃上清，反复洗涤2次。使用200μL细胞洗液重悬细胞。十色流式细胞仪上机检测。

实施例1

①PBMC的制取：无菌条件下，取正常C57BL/6小鼠脾脏。在35mm无菌培养皿中放入4-5mL淋巴细胞分离液。小鼠脾脏置于无菌培养皿中，在200目细胞筛网上用5mL注射器针芯轻轻研磨过滤。把悬有脾脏细胞的滤液立即转移到15mL离心管中，覆盖200-500μL的RPMI培养基(保持液面分界明显)。室温，800g离心30min。吸出淋巴细胞层，再加入10mL RPMI培养基，颠倒洗涤。室温，250g离心10min收集细胞。无血清的RPMI重悬计数，调节成所需细胞数备用；台盼蓝染色，计数活细胞数。得到外周血单个核细胞即PBMC。

②磁珠分选：将①制取的PBMC经磁珠分选(每10⁷个细胞中加入100μL MACS缓冲液(用于细胞分选的磁珠))重悬，与CD3 T细胞阴性分选的磁珠孵育15分钟，洗涤(300g/10min)后用分离缓冲液重悬，标记的细胞悬液加入分选柱，再以缓冲液洗脱3次，标记的细胞被分离，收集未标记的T细胞。得到原代T细胞。

③小鼠T细胞体外扩增培养:将②得到的原代T细胞以1×10⁶mL种植到10(V/V)％RPMI培养基(2mM L-谷氨酰胺，10％FCS/FBS和100U/mL青霉素/链霉素)内。添加小鼠T细胞-活化剂CD3/CD28(3μg/mL)。加入30U/mL rIL-2，在37℃的CO₂培养箱中培养。观察细胞大小和形状。当细胞密度超过2.5×10⁶细胞/mL或培养基变成黄色时，将培养液分装到含有30U/mL rIL-2的培养基中，密度恢复为0.5-1×10⁶细胞/mL。得扩增培养的T细胞悬液。

实施例2明胶材料的改性-羧基化学转换为氨基

取2mL乙二胺(EDA)、1.0g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和50mL的2wt％的A型明胶溶液，将EDA、EDC加入A型明胶溶液中，用5M HCl调pH至5.0，边反应边搅拌，反应温度为37℃，反应时间18小时。反应后，将反应混合物用透析袋透析，纯水作为透析液，每6h更换一次透析液。冷冻干燥透析袋内的溶液，得到改性后的阳离子明胶。

本实施例中，A型明胶等电点为Sigma-Aldrich，USA，A型明胶溶液为磷酸盐缓冲液体系的明胶溶液。

实施例3

取实施例2制取的改性后的阳离子明胶，常温下用生理盐水配制不同浓度的阳离子明胶溶液，调PH到7.3-7.5。不同浓度的阳离子明胶溶液如下表1，配制用的生理盐水为0.9wt％氯化钠无菌水溶液。

表1不同浓度的阳离子明胶溶液表

配制后的阳离子明胶溶液用0.22μm滤膜过滤除菌后待用。

常温下用生理盐水配制不同浓度的海藻酸钠溶液，调PH到7.3-7.5。不同浓度的海藻酸钠溶液见下表2，配制用的生理盐水为0.9wt％的生理盐水。

表2不同浓度的海藻酸钠溶液表

表2配制的海藻酸钠溶液用0.22μm滤膜过滤除菌后待用。

用异硫氰酸荧光素(FITC)标记海藻酸钠，标记方法为：将1.8％，w/v海藻酸钠溶解在2-N-嘛啉基乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic，MES)缓冲液中，调节pH值至4.7，与9mM的1-乙基-3[3-二甲氨丙基]碳二盐酸盐(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride，EDC)和9mM的-羟基磺酸琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide，Sulfo-NHS)混合，活化海藻酸钠的羰基。在室温下搅拌2小时后，加入2mM异硫氰酸荧光素，室温下避光搅拌18小时。最后溶液用1M氯化钠溶液和蒸馏水分别避光透析24小时，然后冷冻干燥。标记FITC后的海藻酸钠溶液按照表2的对应浓度比例配制，见下表3。

表3不同浓度的标记海藻酸钠溶液表

实施例4

将实施例1制得的扩增培养的T细胞悬液用DPBS缓冲液洗涤，去除残存蛋白。再用DPBS缓冲液离心洗涤(1500rpm，5min)，计数后重悬为1×10⁶个/mL的单细胞悬液，取1mL加入6孔板中，再加入1mL的表1任一的胶液，轻轻混匀，多次轻吹保证均匀分散，然后置于恒温摇床培养箱摇晃混匀(200rpm)3min，再继续孵育10min(每隔2min轻微振荡一次)，使胶液中的改性后的阳离子明胶吸附在带负电的细胞表面。孵育后的细胞悬液转移至15mL离心管，离心(2000rpm,5min)，洗去多余的改性后的阳离子明胶，再加入5mLDPBS洗涤，去除未吸附的明胶。反复洗涤2次。随后向细胞悬液中加入1mL表2任一的海藻酸钠溶液，按照如上方法同样包被、离心和洗涤。两种包被步骤各重复一次，即形成细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

实施例5

将实施例1制得的扩增培养的T细胞悬液用DPBS缓冲液洗涤(1500rpm，5min)，去除残存蛋白。再计数后用DPBS缓冲液重悬为1×10⁶个/mL的单细胞悬液，取1mL加入6孔板中，再加入1mL的表1任一的胶液，轻轻混匀，多次轻吹保证均匀分散，然后置于恒温摇床培养箱摇晃混匀(200rpm)3min，再继续孵育10min(每隔2min轻微振荡一次)，使胶液中的改性后的阳离子明胶吸附在带负电的细胞表面。孵育后的细胞悬液转移至15mL离心管，离心(2000rpm,5min)，洗去多余的改性阳离子明胶，再加入5mLDPBS洗涤，去除未吸附的明胶。反复洗涤2次。随后向细胞悬液中加入1mL海藻酸钠溶液，按照如上方法同样包被、离心和洗涤。两种包被步骤各重复一次，即形成细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-标记海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

本实施例中，包被时，最外一层的海藻酸钠采用的1mL海藻酸钠溶液采用的为表3任一的标记海藻酸钠溶液，其余层的海藻酸钠采用的1mL海藻酸钠溶液采用的为表2任一的海藻酸钠溶液。

包被后的单细胞GA-T产品用流式细胞术检测FITC荧光的比例来确定包被效率，结果见下表4和图1。

表4不同浓度的阳离子明胶和海藻酸钠包封效果表(单位：％)

从表4和图1可以看出，用不同浓度的明胶(0.1％，0.2％，0.3％，0.4％)与海藻酸钠(0.15％，0.2％，0.25％，0.3％，0.4％)包被后的单细胞包被GA-T产品，从包被率来看，0.2％明胶、0.25％海藻酸钠溶液取得的包被率较高，包被效率高达90％以上。

实施例6

将实施例1制得的扩增培养的T细胞悬液用DPBS缓冲液洗涤(1500rpm，5min)，去除残存蛋白。再计数后用DPBS缓冲液重悬为1×10⁶个/mL的单细胞悬液，取1mL加入6孔板中，再加入1mL的表1的胶液2(0.2％)，轻轻混匀，多次轻吹保证均匀分散，然后置于恒温摇床培养箱摇晃混匀(200rpm)3min，再继续孵育，使胶液中的改性后的阳离子明胶吸附在带负电的细胞表面。孵育后的细胞悬液转移至15mL离心管，离心(2000rpm,5min)，洗去多余的改性阳离子明胶，再加入5mLDPBS洗涤，去除未吸附的明胶。反复洗涤2次。随后向细胞悬液中加入1mL表2的海藻酸钠溶液3(0.25％)，按照如上方法同样包被、离心和洗涤。两种包被步骤各重复一次，即形成细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

本实施例中，继续孵育的孵育时间分别为5min、10min、20min或30min，其中，每一―再继续孵育”时间中，每隔2min轻微振荡一次。

将包被的单细胞包被GA-T产品用CCK-8法检测细胞活力，结果见图2。

图2显示，孵育10min细胞活力最佳，孵育20min以后细胞活力明显下降*p<0.05,**p<0.01

实施例7Hoechst-PI染色检测GA-T细胞存活

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

收集单细胞包被GA-T，细胞数量在1×10⁶个以内，用PBS洗涤细胞两次。用1mL染色缓冲液将细胞重悬，加入10μL Hoechst33342染色液，轻轻混匀后4℃避光孵育10分钟。加入5-10μL避光孵育PI染色液，轻轻混匀后4℃避光孵育5-10分钟，用PBS洗涤重悬细胞。用荧光显微镜观察，流式细胞仪在激发波长350nm和460nm处检测Hoechst和PI的表达比例，分析包被后GA-T的存活情况，常规的非包被T细胞作为对照。结果见图3。

图3中，Hoechst-PI染色，蓝色表示为正常细胞，红色表示坏死细胞。通过荧光显微镜观察以及流式细胞术检测，GA-T与常规非包被T细胞的存活率相近，没有显著差异。

实施例8扫描电镜观察GA-T表面形态

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

将单细胞包被GA-T离心洗涤弃上清，加入5(V/V)％戊二醛(0.1MPBS稀释)固定30min，按照35(V/V)％，50(V/V)％，75(V/V)％，95(V/V)％，100(V/V)％的乙醇梯度脱水，其中95(V/V)％和100(V/V)％乙醇脱水两次。脱水后的样品转移至六甲基二硅氮烷HMDS：100(V/V)％乙醇为1：2的溶液中，静置20min，再转移到六甲基二硅氮烷HMDS：100(V/V)％乙醇为2：1的新鲜溶液中静置20min。最后将样品转移到100(V/V)％HMDS中20min，通风处内过夜。用离子溅射仪对待测包被的GA-T细胞进行喷金处理镀膜，通过扫描电子显微镜观察待测包被的GA-T细胞的表面形态，常规的非包被T细胞作为对照。

结果见图4，图4显示，常规T细胞表面有许多微绒毛，GA-T外层形成相对光滑的囊壳。

实施例9酶联免疫吸附测定(ELISA)细胞因子分泌水平

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

收集单细胞包被GA-T，加入10(V/V)％RPMI培养基接种在96孔板中(1×10⁵个/孔)，在37℃，5(V/V)％的CO2的培养箱中培养，于48h、96h收集细胞上清样本。将样本和标准品(100μL/孔)加入抗体包被的ELISA夹心孔内，加入生物素化抗体工作液(50μL/孔)，用微量震荡仪充分混匀，封板胶纸封住反应孔，室温孵育120min。每孔加入350μL洗涤液，静置30s后甩干液体，洗涤4次。加入酶结合工作液(100μL/孔)，封板室温孵育30min。洗板四次后加入显色剂100μL/孔，避光室温孵育10-20min。加入终止液100μL/孔，混匀后即刻测量450nm处的OD值。常规的非包被T细胞作对照。

结果见图5，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测显示，经CD3/CD28刺激后，GA-T包被不影响96h内TNF-α，IL-2和IFN-γ的分泌水平

实施例10电位检测

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

取包被前的细胞样品以及每层包被后的样品：细胞，细胞-明胶，细胞-明胶-海藻酸钠，细胞-明胶-海藻酸钠-明胶，细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠。用马尔文纳米粒度电位仪测量整个包被过程中GA-T表面电位变化情况，结果见图6。

从图6可知，四层包被后，GA-T表面电位与包被前(即正常T细胞)相比没有显著变化

实施例11CFSE检测GA-T的增殖能力

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

将GA-T或常规的非包被T细胞用染色工作液重悬，至细胞浓度大约10⁷/mL。在37℃培养箱中孵育20分钟，离心后去上清，用PBS洗涤细胞1-2次，加入10(V/V)％RPMI培养基，将细胞接种在24孔板内(1×10⁶个/孔)，添加小鼠T细胞-活化剂CD3/CD28(3μg/mL)。加入30U/mL rIL-2，在37℃培养箱中培养48h。收集细胞，用Anti-CD3-PE孵育30min，标记T细胞，离心洗涤，用流式细胞仪检测CD3和CFSE的表达情况(收集培养前0h的细胞，标记CD3作为空白对照)。结果见图7。

图7显示，经CD3/CD28刺激后，CFSE检测CD3+GA-T与常规CD3+T细胞增殖能力没有显著差异。

实施例12流式检测GA-T的抗体结合能力

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

将GA-T或常规的非包被T细胞加入含10(V/V)％RPMI培养基的6孔板内(1×10⁶个/ml)预培养6h，吸取细胞离心洗涤，加入ANTI-CD3标记CD3，4℃孵育30min，离心洗涤后流式细胞仪上机检测。结果见图8

图8显示，GA-T与普通T细胞具有相同的anti-CD3结合能力

实施例13测试GA-T细胞的物理应力

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

收集包被GA-T或常规的非包被T细胞加入1.5mL的EP管内(约1×10⁶)，采用不同的离心速度(1000rpm，1500rpm，2000rpm，3000rpm，4000rpm)产生的不同物理应力处理样本，反复六次。再用10(V/V)％RPMI培养基重悬细胞，接种到96孔板中(10μL/孔)，在37℃培养箱中培养12h，CCK-8法检测各组的细胞活力。结果见图9。

图9显示，用不同的离心速度(1000rpm，1500rpm，2000rpm，3000rpm，4000rpm)产生的不同物理应力处理常规T细胞与GA-T，每次离心5min，反复6次。通过CCK-8法检测细胞活力，与常规T细胞相比，GA-T具备一定的机械强度，能够显著减轻2000-4000rpm产生的物理破坏力。*p<0.05,****p<0.01

实施例14激光共聚焦与微分干涉

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例5中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-标记FITC海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

标记FITC的包被GA-T离心分离，洗涤缓冲液(50mL PBS+50μl Tween)洗涤后计数，吸取约1×10⁶个GA-T离心弃上清，加入固定液室温固定15min，离心洗涤弃上清，再加入100μL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色液，室温避光孵育30min。用洗涤缓冲液(500μl/管)洗涤；重悬离心后，吸弃上清，每管留20-30μl的上清，将细胞吹匀后，滴于载玻片上，涂抹均匀后，自然风干；再滴上一小滴防淬灭封片剂，小心取出盖玻片，细胞朝下，轻轻叩于封片剂上。在激光共聚焦显微镜下观察细胞的表面荧光(激发波长358nm和488nm)。微分干涉显微镜拍摄不同视野的图像，使用ImageJ软件分析GA-T包被膜的厚度，常规的非包被T细胞作为对照。

激光共聚焦显微镜观察结果见图10，图10中a-e的结果显示，包被后的GA-T细胞表面荧光。

微分干涉显微镜见图11，图11显示，使用ImageJ软件分析GA-T细胞的微分干涉显微镜图像，测量包被膜厚度在500nm范围内。

实施例15荧光显微镜观察包被材料的降解

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例5中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-标记FITC海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

标记FITC的包被GA-T以1×10⁶mL种植到含10(V/V)％RPMI培养基的培养瓶内，加入30U/mL rIL-2，在37℃的CO₂培养箱中培养。于0h、24h、48h和96h取出培养瓶，荧光显微镜在激发波长495nm处观察荧光材料的表达情况，任取5个视野并拍照。结果见图12。

图12显示，GA-T最外层海藻酸钠在96h内的降解。

实施例16GVHD模型

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

8-10周SPF级近交系C57BL/6作为供体鼠，8-10周SPF级近交系Balb/C作为受体鼠。

本实施例中制备GA-T所需的T细胞均来源于C57BL/6供体鼠。

受体鼠于移植前4-7天腹腔注射白消安25mg/kg，移植前2-3天腹腔注射环磷酰胺120mg/kg。饲养期间饮用含硫酸庆大霉素(3.2×10⁵U/L)与红霉素(250mg/L)的灭菌水。

移植当天，颈椎脱位法处死C57BL/6供鼠，0.1(V/V)％新洁尔灭浸泡3min，在超净台内无菌条件下从供体鼠中取出骨髓细胞：剪去股骨、胫骨干骺端，用1mL注射器抽取RPMI培养液反复冲洗骨髓腔制备单细胞悬液；再采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，预冷的无菌PBS洗涤2次，无血清的RPMI重悬计数，调成所需细胞数备用；台盼蓝染色，计数活细胞数。

GA-T与常规T细胞来源表达CD45.2的普通C57BL/6，移植的骨髓细胞来源于表达CD45.1的突变型C57BL/6。

将GA-T联合骨髓细胞进行尾静脉移植(骨髓：1×10⁷，脾细胞：2×10⁷)，骨髓移植组和正常组(注射PBS)作为对照。尾静脉移植的终体积控制在200μL左右。每隔3天(从移植前一周开始，直至小鼠死亡)，称重，统计体重变化，结果见图14。观察小鼠有无体重下降、腹泻和脱毛，有无弓背、耸毛、活动度差等精神表现，计算生存时间和存活率，结果见图15。按照下表5进行GVHD临床评分，结果见图13。

表5GVHD临床症状严重度等级评分标准

图13显示，接受GA-T移植组的小鼠的GVHD评分显著降低。#p<0.05,##p<0.01,

###P<0.001 vs Non-encap

图14显示，接受GA-T移植组的小鼠在27d后体重逐渐恢复至正常水平。#p<0.05,

##p<0.01,###P<0.001 vs Non-encap

图15显示，接受GA-T移植组的小鼠生存率显著提高。****P<0.001 vs Non-encap

实施例17

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

AML联合GVHD模型建立：

使用荧光素酶转染的WEHI-3B细胞(WEHI-3B-luc)来观察肿瘤在受体Balb/c小鼠体内的进展。

8-10周SPF近交系C57BL/6作为供体鼠，8-10周SPF近交系Balb/C作为受体鼠。

受体鼠于移植前4-7天腹腔注射白消安25mg/kg，移植前2-3天腹腔注射环磷酰胺120mg/kg。饲养期间饮用含硫酸庆大霉素(3.2×10⁵U/L)与红霉素(250mg/L)的灭菌水。

移植前一天每只Balb/c受体鼠尾静脉注射3×10⁵个WEHI-3B-luc细胞。

移植当天，颈椎脱位法处死C57BL/6供鼠，0.1(V/V)％新洁尔灭浸泡3min，在超净台内无菌条件下从供体鼠中取出骨髓细胞：剪去股骨、胫骨干骺端，用1mL注射器抽取RPMI培养液反复冲洗骨髓腔制备单细胞悬液；再采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，预冷的无菌PBS洗涤2次，无血清的RPMI重悬计数，调成所需细胞数备用；台盼蓝染色，计数活细胞数。

GA-T与常规T细胞来源表达CD45.2的普通C57BL/6，移植的骨髓细胞来源于表达CD45.1的突变型C57BL/6。

将GA-T联合骨髓细胞进行尾静脉移植(骨髓：1×10⁷，脾细胞：2×10⁷)，骨髓移植组和正常组(注射PBS)作为对照。尾静脉移植的终体积控制在200μL左右。

每隔3天(从移植前一周开始，直至小鼠死亡)，观察小鼠临床表现并拍照，结果如图16，按照表5进行GVHD临床评分，结果如图17，计算生存时间和存活率，结果如图18。

取濒死的小鼠的肝、肠和皮肤组织，用4％多聚甲醛固定液固定，石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察结果如图19。

图16显示，接受常规移植的T细胞组即模型组小鼠出现掉毛，皮肤脱落，活动力下降等表现，接受GA-T移植小鼠无显著的病理改变。

图17显示接受GA-T移植组的AML小鼠的GVHD评分显著降低。###P<0.001 vs Non-encap+WEHI3B

图18显示接受GA-T移植组的AML小鼠生存率显著提高。**P<0.01 vs Non-encap+WEHI3B

图19显示，常规T细胞与GA-T两组小鼠的肝脏、结肠以及皮肤的病理图片。HE染色可见模型组小鼠肝脏汇管区和肝血窦内有大量淋巴细胞浸润，血管之间形成纤维间隔，肝血窦有扩张及淤血。结肠黏膜上皮细胞排列紊乱，部分细胞破裂损伤甚至脱落，大量炎性细胞浸润，隐窝结构消失。皮肤角质层出现过度角化，颗粒层和棘层增厚，棘突过度延长并伴有大量炎性细胞浸润。

动物活体成像：

各组受体小鼠移植后使用异氟烷麻醉。荧光素底物(D-luciferin，150mg/kg体重，PBS中含5mg/mL)腹腔内注射，15分钟后进行成像，观察全身发光信号强度。每周测定一次。数据以单位面积光子计数显示和分析，结果如图20。

图20显示，动物活体荧光成像追踪荧光标记的WEHI-3B髓样单核白血病细胞，GA-T移植组保持与T细胞移植相同的肿瘤杀伤效果。

实施例18

取实施例17中移植后第7天的各组小鼠，每组任意3只，处死后获得脾脏，按照实施例1中―PBMC的制取”获得PBMC。标记CD45.2与H2Kb，4℃孵育30min后离心洗涤，流式细胞仪上机检测，结果如图21。

图21显示，GA-T与模型组的脾脏中均表现出相近的CD45.2+T细胞比例。

实施例19

取实施例17中濒死受体小鼠的脾脏，按照实施例1中―PBMC的制取”获得PBMC。用EDTA抗凝管收集外周血，外周血中加入3-5倍体积的红细胞裂解液，常温避光孵育10分钟，加入PBS洗涤两次(1500rpm,5min)，得到外周血PBMC。分别标记CD3与CD4、CD8，4℃孵育30min后离心洗涤，流式细胞仪上机检测，结果如图22。

图22显示了外周血与脾脏淋巴细胞亚群变化情况。GA-T组CD4/CD8的比例显著低于接受常规T细胞移植的模型组。#p<0.05,##p<0.01,vs Non-encap

实施例20混合淋巴细胞反应

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

收集包被的GA-T细胞或常规的非包被T细胞(1×10⁵个细胞/孔)接种到96孔板，加入经放射线照射(30Gy)的异体Balb/c小鼠的脾细胞(1×10⁴个细胞/孔)，在37℃，5(V/V)％CO₂，分别孵育24h，48h，72h和96h。培养最后2h，加入10μL CCK-8，四小时以内用酶标仪450nm波长读出OD值。细胞生存能力以OD值表达。每个实验设3个复孔。

结果如图23显示，将GA-T或常规T细胞与异种Balb/C来源的脾细胞共培养，GA-T显著降低了72h以后的混合淋巴细胞反应。#p<0.05,vs Non-encap

实施例21GA-T对肿瘤细胞的细胞毒作用

本实施例的包被的GA-T细胞来源于实施例6中胶液2(0.2％)、海藻酸钠溶液3(0.25％)、孵育时间10min制取的细胞-明胶-海藻酸钠-明胶-海藻酸钠的单细胞包被GA-T。

常规T细胞、包被的GA-T细胞和WEHI-3B肿瘤细胞于37℃，5％的CO2的培养箱中培养24h，将常规T细胞或GA-T细胞接种到Transwell小室(0.4μm)的上室中，WEHI-3B肿瘤细胞接种到下室进行共培养。共培养6h、12h、24h、48h之后，51Cr释放法检测GA-T细胞和常规T细胞对WEHI-3B髓样单核白血病细胞的细胞毒作用。收集共培养24h的GA-T细胞和常规T细胞，流式细胞术检测CD69和CD107a的表达。结果如图24和25。

图24显示，GA-T在共培养48h后对WEHI-3B的细胞毒作用与常规T细胞无显著差异

图25显示，与WEHI-3B共培养24h后，GA-T细胞CD69的表达略低于常规T细胞，CD107a的表达无显著差异。

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