一种5-ala缀合物制备方法及其用途
阅读说明：本技术 一种5-ala缀合物制备方法及其用途 (Preparation method and application of 5-ALA conjugate ) 是由 鲁光英 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种5-ALA缀合物制备方法及其用途,制备方法包括5-((2-氨基乙基)氨基)-4-氧代戊酸乙酯合成和5-ALA缀合物合成步骤,所得到5-ALA缀合物应用于医药用途,包括抗肿瘤药物制备,本发明将原本用于活血化瘀、利水消肿益母草碱与5-ALA合成,制备得到5-ALA缀合物,通过初步药理活性测试,结果表明,其在细胞水平上,对肿瘤的清除率,比5-ALA及其酯化物肿瘤清除率提高了20％以上。(The invention provides a preparation method of 5-ALA conjugate and application thereof, wherein the preparation method comprises the steps of synthesizing 5- ((2-aminoethyl) amino) -4-oxopentanoic acid ethyl ester and synthesizing 5-ALA conjugate, the obtained 5-ALA conjugate is applied to medical application, and the preparation method comprises the preparation of antitumor drugs.)
技术领域
本发明涉及有机物合成制药技术领域，更具体地说，尤其涉及农药方面的一种5-ALA缀合物制备方法及其用途。
背景技术
5-氨基酮戊酸(5-ALA)是生物内源性物质，是动物血红蛋白和植物叶绿素生物合成的前体物质，广泛应用于医药领域，做为光敏剂可用于各种癌症的治疗，还可用于制作杀虫剂和除草剂等。由于5-氨基酮戊酸结构不稳定及渗透性有限，上世纪90年代起，陆续有多种酯化物成药的上市，如甲酯和乙酯等。
益母草碱，化学名为3,5-二甲氧基-4-羟基-苯甲酸(4-胍基)-1-丁酯，广泛存在于细叶益母草的叶或益母草及艾蒿益母草全草中，具有活血化瘀、利水消肿等多种作用。具体地，益母草碱的药理作用主要有五个方面：1)对多种动物的子宫呈兴奋作用，益母草碱的子宫收缩作用可持续几小时，但冲洗后可恢复；2)对循环系统的作用小剂量益母草碱对离体蛙心有增强收缩作用，使用大量时反呈抑制现象，益母草碱对温血动物的血管呈明显的扩张现象，有抗肾上腺素的作用；3)益母草碱对呼吸中枢有直接兴奋作用；4)益母草碱能使兔离体肠管紧张性弛缓，振幅扩大，多量则振幅变小，而频率增加；5)益母草是具有改善血液循环、活血祛瘀功效的传统妇科用药，相关研究表明益母草碱的降总胆固醇和甘油三酯的效果均优于或者接近他汀药物，但毒性反应远低于他汀类药物。不仅如此，益母草碱还具有抗氧化性和杀菌抗炎的效果，能够很快清除自由基，抵抗真菌和霉菌。
针对5-ALA存在的问题，现有技术中，已经有各种解决方案，如CN 111840574专利中报道了一种5-ALA与喜树碱小分子前药的制备和应用，以增强5-ALA的抗癌作用，但是由于喜树碱有较大副作用，容易导致血尿等症状，该缀合物的应用受到较大限制。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明提供一种5-ALA缀合物制备方法及其用途。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种5-ALA缀合物制备方法，步骤为：
步骤A，5-((2-氨基乙基)氨基)-4-氧代戊酸乙酯合成，将2-(甲硫基)乙胺的氨基部分用Boc保护，之后与5-ALA或其酯化物缩合，用TFA去除其氨基保护，得到5-((2-氨基乙基)氨基)-4-氧代戊酸乙酯；
步骤B，5-ALA缀合物合成，将益母草碱与丙二酸缩合后，与5-((2-氨基乙基)氨基)-4-氧代戊酸乙酯缩合，得到5-ALA缀合物。
上述技术方案中，所述步骤B的缩合采用脱水剂加热条件下失水完成，所述脱水剂包括五氧化二磷、乙酸酐。
上述技术方案中，所述5-ALA包括5-ALA、5-ALA甲酯、5-ALA乙酯。
本发明得到的一种5-ALA缀合物用途，应用于医药用途，包括抗肿瘤药物制备。
本发明将原本用于活血化瘀、利水消肿益母草碱与5-ALA合成，制备得到5-ALA缀合物，通过初步药理活性测试，结果表明，其在细胞水平上，对肿瘤的清除率，比5-ALA及其酯化物肿瘤清除率提高了20％以上。
附图说明
图1是益母草碱、化合物A、化合物B和5-ALA与HepG2和MCF-7细胞作用24小时后对细胞活性的影响的试验数据图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
作为实施例所示的一种5-ALA缀合物，根据5-ALA采用5-ALA、5-ALA甲酯、5-ALA乙酯的不同，合成化合物A、化合物B、化合物C，以合成化合物A为案例，具体合成路线为：
种新的5-ALA缀合物(化合物A)，其结构如下：
该化合物由5-ALA乙酯和益母草碱通过2-(甲硫基)乙胺与丙二醇缩合而来，该化合物并非最终结构，其中5-ALA甲酯或者5-ALA也能通过以上方式和益母草碱缩合制备成化合物A类似物化合物B、化合物C，而产生相同或相似的药理作用。且本发明将原本用于活血化瘀、利水消肿，与5-ALA及其酯化物的光动力治疗作用没有任何关联性益母草碱，将两者缀合成一个化合物后，会提高5-ALA光敏剂的疗效，这个技术方案是本领域技术人员不可能预见的方案。
具体合成制备方法：
步骤A，5-((2-氨基乙基)氨基)-4-氧代戊酸乙酯的合成
将2-(甲硫基)乙胺10g溶于60ml水中，加入三乙胺15ml，搅拌溶解后，缓慢滴加(Boc)2O溶液(取(Boc)2O 30g溶于15ml四氢呋喃中，搅拌既得)，滴毕，加0.1gDMAP，搅拌均匀，升温至40℃，保温90小时，TLC监测反应进度，反应完毕，过滤，滤液浓缩至小体积，加DCM30ml溶解后，用水萃取2次，收集DCM层浓缩，硅胶柱层析纯化，石油醚：乙酸乙酯(36:1)洗脱，得Boc保护的S-2-(甲硫基)乙胺(5.8g)。
将Boc保护的S-2-(甲硫基)乙胺16g溶于50ml DMF中，搅拌溶解后，降温至-10℃，加入5-ALA乙酯8g，搅拌30min，升温至20℃，保温搅拌3h，TLC检测反应进度，待反应完毕，浓缩反应液至小体积，加30ml DCM搅拌溶解，用水萃取两次，加无水氯化镁15g，搅拌半小时后静置过夜，过滤，浓缩滤液至小体积，加二氯甲烷溶解20ml，降温至-5℃，搅拌状态下滴加TFA 15ml，低温搅拌过夜，TLC检测反应至终点，减压浓缩至小体积，加入40ml乙醚(室温)，搅拌均匀，降温至-5℃，析出固体(12g)。
步骤B，5-ALA缀合物化合物A的合成
在反应容器中，加入30ml二氯甲烷作，加入加4g丙二酸，DPTs8g和DIC 1.4g，搅拌1h后加入8g益母草碱，搅拌下反应过夜，TLC监控反应终点，过滤，取滤液浓缩至小体积，加20ml甲醇，升温搅拌溶解后，静置析晶，即得。
将40ml二氯甲烷至于反应容器中，加入上步所得产物10g与5-((2-氨基乙基)氨基)-4-氧代戊酸乙酯8g，搅拌溶解后，缓慢滴加乙酸酐20ml，TLC控制反应终点，反应毕，加水萃取三次，将有机相浓缩至小体积，加甲醇20ml加热搅拌均匀后，降温析晶即得化合物A8.6g。
同理，将上述合成路线中的5-ALA乙酯替换为5-ALA或者5-ALA甲酯，得到化合物B和化合物C。
采用药理学研究中常用的HepG2人肝癌细胞和MCF-7人乳腺癌细胞进行细胞活性试验研究。细胞培养基选用DMEM高糖培养基，并加入抗生素和10％胎牛血清制备而成，培养基于细胞培养箱中培养，试验时配以适当的光照。
图1为益母草碱、化合物A、化合物B和5-ALA与HepG2和MCF-7细胞作用24小时后对细胞活性的影响。
结果可以看出，益母草碱处理组的细胞存活率均高于90％，说明益母草碱对两种肿瘤细胞无明显抑制作用。样品浓度为1.0ug/mL时，化合物A、化合物B和5-ALA处理组的HepG2细胞的存活率分别为85.48％、55.39％和7.24％；MCF-7细胞的存活率分别为88.82％、72.11％和67.01％。化合物A、化合物B和5-ALA对HepG2细胞的抑制增殖效果高于其对MCF-7细胞的抑制效果，说明化合物A、化合物B和5-ALA对两种肿瘤细胞具有选择性抑制作用。随着供试品浓度变大，两种癌细胞的存活率也明显降低，说明化合物A和化合物B对两种癌细胞增殖的抑制具有剂量依赖性。此外，化合物A和化合物B对两种癌细胞的抗癌效果明显高于5-ALA，可以证明5-ALA缀合物对两种癌细胞的抑制增殖效果明显高于单独使用5-ALA，同时，化合物A的抗肿瘤活性高于化合物B。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
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