一种基于核酸恒温扩增反应阻塞流动的微流控目视现场快速检验装置及其检测方法
阅读说明：本技术 一种基于核酸恒温扩增反应阻塞流动的微流控目视现场快速检验装置及其检测方法 (Micro-fluidic visual field rapid inspection device based on nucleic acid isothermal amplification reaction blocking flow and detection method thereof ) 是由 李彪 陈以铖 张馨予 李雯曦 李禹克 马晟利 聂桓 葛文玉 李慧 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于核酸恒温扩增反应阻塞流动的微流控目视现场快速检验装置及其检测方法。步骤1：对待测样本进行扩增；步骤2：将步骤1中扩增后的反应体系与含乙醇溶液混合,扩增的阳性样本与扩增的阴性样本呈现出不同的核酸沉淀效果；步骤3：对步骤2中的核酸沉淀通过阻塞微珠堆积出的多孔介质微通道的效果,分辨核酸沉淀的差异；步骤4：通过微通道显色针对步骤3中沉淀的差异,供目视辨识反应的阴性和阳性结果。本发明针对病毒核酸检测,可在感染初期得出准确结果,无需复杂的核酸检验设备。(The invention discloses a micro-fluidic visual field rapid inspection device based on nucleic acid isothermal amplification reaction blocking flow and a detection method thereof. Step 1: amplifying a sample to be detected; step 2: mixing the reaction system amplified in the step 1 with an ethanol-containing solution, wherein the amplified positive sample and the amplified negative sample show different nucleic acid precipitation effects; and step 3: distinguishing the difference of the nucleic acid precipitates by the effect of blocking the micro-channels of the porous medium accumulated by the microbeads on the nucleic acid precipitates in the step 2; and 4, step 4: the difference in the precipitation in step 3 was visualized by microchannel visualization for visual identification of negative and positive results of the reaction. The invention aims at virus nucleic acid detection, can obtain accurate results at the initial stage of infection, and does not need complex nucleic acid detection equipment.)
技术领域
本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种基于核酸恒温扩增反应阻塞流动的微流控目视现场快速检验装置及其检测方法。
背景技术
目前核酸检测已被广泛应于临床医学领域，它相较于检测病人抗体的胶体金显色检测方法，具备在感染初期检出的能力，应用在防疫检测中可以获得宝贵的时间提前量。由于待检测样本中的核酸含量十分有限，所以需要对微量核酸进行扩增。最早提出的核酸扩增方法是聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，也是目前应用最广泛的核酸扩増方法。但是，PCR需要受过专业训练的工作人员操作精密的温度循环仪器来实现核酸的变性、退火和延伸，这限制了其便捷应用的可能性。随着一系列核酸等温扩增方法的产生，降低了仪器复杂性，反应过程简单高效，有利于检测设备小型化和现场布置。但是，对于核酸的现场快速检验(Point-of-Care Testing,POCT)依然有较大挑战。
如何在全球范围内推广核酸检测，特别是发展中地区和欠发达地区，面临着如何克服污染、降低费用、去除复杂仪器、简化操作等一系列问题。微流控芯片提供了解决方案，将多个反应步骤整合于几平方厘米的微流控芯片内，实现检测仪器的微型化，样品预处理的简单化，实验操作的高效化和精确化，检测成本的经济化。
目前市场中使用的核酸检测系统，主要有基于PCR和恒温扩增方法的检测技术，多数使用荧光检测，需要专业检测设备进行结果判读，而且由于有背景荧光，阴性样本判读时间长；还有的在非实验室环境扩增后的开盖操作易造成气溶胶污染；有的是检测结果目视辨识度不高，有的是检测试剂易干扰中断扩增反应。这些均给POCT高效准确、简单快速的要求造成挑战。
发明内容
本发明提供了一种基于核酸恒温扩增反应阻塞流动的微流控目视现场快速检验装置及其检测方法，针对病毒核酸检测，可在感染初期得出准确结果，无需复杂的温度控制系统以及核酸检验设备，全过程负压且使用酒精灭活保证安全性，只需将样本试剂在所使用的恒温扩增试剂工作温度下封闭加热，并在室温下给予负压驱动，即可通过芯片的显色效果目视判断检测结果。
本发明通过以下技术方案实现：
一种基于核酸恒温扩增反应阻塞流动的微流控目视现场快速检验装置，所述检验装置包括进口段、混合段、至少一个阻塞通道9与显色腔7，所述阻塞通道9与显色腔7相连通。
进一步的，所述进口段包括2个进口1和支管2，每个所述进口1均与一个支管2相连通，2个所述支管2连通到混合弯曲通道3，所述混合弯曲通道3与阻塞通道9连通。
进一步的，所述阻塞通道9包括防回流机构4、预装配进口5和阻塞起始结构6，每个所述阻塞通道9在与混合弯曲通道3连接端的起始端通道内部设置一个防回流机构4，每个所述阻塞通道9与显色腔7连接端的通道内部设置一个阻塞起始结构6，所述的防回流机构4与阻塞起始结构6之间的阻塞通道9上设置预装配进口5，每个所述阻塞通道9与显色腔7连通。
进一步的，所述显色腔7上设置气压出口8，所述气压出口8连接负压装置。
进一步的，所述阻塞通道(9)为多孔介质通道。
进一步的，所述的沉淀阻塞段6内填装颗粒物质的直径为5-30μm。
进一步的，所述负压装置为注射器和实验室微量注射泵。
一种基于核酸恒温扩增反应阻塞流动的微流控目视现场快速检验装置的检验方法，所述检验方法是按下述步骤进行的：
步骤1：对阳性样本或阴性样本进行扩增并通过一个进口(1)注入检验装置；
步骤2：含乙醇的溶液通过另一个进口(1)注入检验装置；
步骤3：使扩增后的样本与含乙醇的溶液在混合段进行混合，使扩增的阳性样本与扩增的阴性样本呈现出不同的核酸沉淀效果；
步骤4：通过预装配进口(5)向阻塞通道(9)内注射微粒，使阻塞起始结构(6)与预装配进口(5)之间形成多孔介质微通道，对步骤3中的核酸沉淀通过阻塞微珠堆积出的多孔介质微通道，分辨核酸沉淀的差异；
步骤5：通过多孔介质微通道显色针对步骤4中沉淀的差异供目视辨识反应的阴性和阳性结果。
本发明的有益效果是：
1.本发明针对病毒核酸检测，可在感染初期得出准确结果，无需复杂的温度控制系统以及核酸检验设备，全过程只需将样本试剂在所使用的恒温扩增试剂工作温度下封闭加热，并在室温下给予负压驱动，即可通过芯片的显色效果目视判断检测结果。
2.本发明在一定时间内，该装置在全程闭盖状态下，可以完成目视判别的现场即时定性核酸检测。特别地，相较其它已有方法额外需要使用高温或紫外光照射方法灭活，本发明在检测过程中使用高浓度乙醇溶液直接灭活试剂，保证了扩增反应现场测试过程中更好的安全性，以及后续的无污染处理。
3.本发明附加使用装置简单，主要有检测使用的200μL标准试管，以及提供负压的普通医用注射器。
附图说明
附图1本发明结构示意图。
附图2本发明两条阻塞通道结构示意图。
附图3本发明一条阻塞通道结构示意图。
附图4本发明实施方式示意图。
附图5本发明检测实验图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
PDMS基底的芯片：使用软光刻的加工制造方式，使用PDMS通过匀胶、曝光、显影、浇筑、剥离、打孔，最后与玻璃键合制作完成。
PMMA基底的芯片：使用热模压法的加工制造方式，以铬版玻璃通过曝光、显影、定影、水漂、后烘、腐蚀铬、腐蚀玻璃、去胶、去铬的步骤制作模板，把处理好的PMMA基片和模板放到压片机的工作台上进行模压，最后与PMMA盖片键合制作完成。
阻塞通道设计为细长结构以方便阻塞，通道断面宽度总和不大于500μm，高度不小于30μm。阻塞通道后半部分即为阻塞段(以阻塞起始结构6开始)，从阻塞段中的装配口填入直径为5-30μm的微小颗粒，实现通道阻塞段的预填装，微球排列紧凑后封闭该装配口，完成检测通道的装配。此时该通道可允许水和阴性样本的扩增反应后溶液通过，而阳性样本的扩增反应后溶液因大结构的核酸沉淀阻塞而难以通过。
如图1-3所示，一种基于核酸恒温扩增反应阻塞流动的微流控目视现场快速检验装置，所述检验装置包括进口段、混合段、至少一个阻塞通道9、以及显色腔7，所述阻塞通道9与显色腔7相连通。
如图1-3所示，进一步的，所述进口段包括2个进口1和支管2，每个所述进口1均与一个支管2相连通，2个所述支管2连通到混合弯曲通道3，所述混合弯曲通道3与阻塞通道9连通。所述阻塞通道9包括防回流机构4、预装配进口5和阻塞起始结构6，每个所述阻塞通道9在与混合弯曲通道3连接端的起始端通道内部设置一个防回流机构4，每个所述阻塞通道9与显色腔7连接端的通道内部设置一个阻塞起始结构6，所述的防回流机构4与阻塞起始结构6之间的阻塞通道9上设置预装配进口5，每个所述阻塞通道9与显色腔7连通。
如图1-3所示，进一步的，颗粒从预装配进口5注射进去后，被阻塞起始结构6阻挡，装配在预装配进口5和阻塞起始结构6之间靠近阻塞起始结构6的位置，阻塞起始结构6的间隙尺寸大于颗粒直径，但在核酸沉淀不足以形成阻塞时可以通过液体，所以阴性情况时，指示剂可以正常通过颗粒装配段使显色腔7处显示肉眼可见颜色。
进一步的，所述阻塞通道9可以是基于微通道阻塞的阻塞段可以是直接制备的多孔介质通道，也可以通过装配颗粒物到通道内形成多孔介质通道。
进一步，所述的所有阻塞通道9的断面总宽度不大于500μm，高不小于30μm。
如图1-3所示，进一步的，所述显色腔7上设置气压出口8，所述气压出口8连接负压装置。
如图4所示，进一步的，所述负压装置为注射器或机械微量注射泵等。
一种基于核酸恒温扩增反应阻塞流动的微流控目视现场快速检验装置的检验方法，所述检验方法是按下述步骤进行的：
步骤1：对待检测样本进行扩增，反应后溶液通过导管与进口1中的一个口连接至芯片装置；
步骤2：含乙醇的溶液通过导管与进口1另一个口连接至芯片装置；
步骤3：在入口1的两口加等值正压，同时在气压出口8加负压，驱动扩增后的样本与含乙醇的溶液进入通道，两溶液会在混合段发生被动(或振动作用的主动)混合，发生核酸沉淀；
步骤4：步骤3中的核酸沉淀在通过预装配进口5与阻塞起始结构6之间的多孔介质微通道时，不同总量和结构尺寸的核酸沉淀会使多孔介质微通道发生阻塞，从而分辨核酸沉淀的差异。通过显色腔7的显色，目视辨识样本检测的阴性或阳性结果。
具体操作如下，将待测样本与扩增反应溶液共20μL装入200μL检测试管内，旋涡混合30s，用100μL注射器连接供液管A的前端(如图4)，先吸取20μL油性有色指示液，再吸入10μL空气，最后吸入20μL反应体系溶液，油性指示液除指示外，还起到了封闭反应体系的作用，之后将供液管尾端与芯片连接，断开前端注射器。将芯片连同供液管一同没入恒温水浴加热，保证全部没入水面之下，开始扩增，于恒温水浴63℃中加热20min。完成后，室温冷却1min，用100μL注射器连接供液管B的前端(如图4)，依次吸取20μL油性有色指示液+10μL空气+30μL酒精，之后将供液管尾端与芯片连接，断开前端注射器。在显色腔出口处使用普通医用注射器加8mL体积负压，驱动芯片内液体流动。由于LAMP核酸扩增的反应过程中会产生大量的焦磷酸镁沉淀，这些沉淀的直径在2～7μm区间内。同时，乙醇与扩增反应后溶液混合会形成核酸沉淀，且沉淀直径较大，可以显著加强阳性检测结果的阻塞。特别地，在通入乙醇后，对混合段区域内的液体实施超声震荡或震动混合，加速乙醇与反应体系的快速混合，从而加强核酸沉淀。当混合乙醇的反应体系流经阻塞通道段时，阳性样本反应液在乙醇作用下产生许多核酸沉淀，堆积在通道内的颗粒上，使通道内流速显著下降，而阴性样本的有色油性流体会快速地通过阻塞段并进入显色腔。最后，依靠上游的油性有色指示液是否到达显色腔来判断检测结果，可以通过目视观察作出准确判断。以上设计结果，可以控制阴性样本在5分钟内流过通道显色，而阳性样本不通过且不显色的时间长不低于10分钟，从而实现30分钟内目视判读核酸检测结果。
本发明检测设备和操作简单，易于现场实施。扩增可以在供液管或检测试管中进行，芯片内流动的驱动力可以使用上述负压操作，也可以使用在供液管前端正压驱动流动。且在检测过程中全程负压环境并使用高浓度乙醇溶液直接灭活试剂，充分保证了扩增反应现场测试过程的安全性，方便后续的现场无害处理。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种数字PCR装置、制备方法、设备及介质