一种乳酸菌冻干粉、制备方法及其冻干保护剂
阅读说明：本技术 一种乳酸菌冻干粉、制备方法及其冻干保护剂 (Lactobacillus freeze-dried powder, preparation method and freeze-drying protective agent thereof ) 是由 韩梅 唐静 刘思婕 高敏 白晨 崔琳琳 于 2021-07-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物制剂领域,具体涉及一种乳酸菌冻干粉、制备方法及其冻干保护剂。本发明通过抗逆性诱导和冻干保护剂两方面协同提高乳酸菌冻干粉的活菌数、存活率及保存时限,对不同的乳酸菌具有普适性,可以将乳酸菌的冻干过程存活率提高到90％以上,将乳酸菌货架期内的稳定性比优化前提高20％以上,延长乳酸菌的保存时限,为乳酸菌的应用提供了技术支撑。(The invention belongs to the field of microbial preparations, and particularly relates to lactic acid bacteria freeze-dried powder, a preparation method and a freeze-drying protective agent thereof. The stress resistance induction and the freeze-drying protective agent are used for synergistically improving the viable count, the survival rate and the storage time limit of the lactobacillus freeze-dried powder, the freeze-drying protective agent has universality for different lactobacillus, the survival rate of the lactobacillus in the freeze-drying process can be improved to more than 90%, the stability of the lactobacillus in the shelf life is improved by more than 20% compared with that before optimization, the storage time limit of the lactobacillus is prolonged, and a technical support is provided for the application of the lactobacillus.)
技术领域
本发明属于微生物制剂领域，具体涉及一种乳酸菌冻干粉、制备方法及其冻干保护剂。
背景技术
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。人体或动物体内有益的细菌或真菌主要有酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳酸菌、放线菌等。
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)，是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关，可以说，如果乳酸菌停止生长，人体或动物体就很难健康生存。也正因为如此，乳酸菌被广泛应用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业。
乳酸菌在应用过程中要保持高活性，所以工业上常制备成高浓度冻干型乳酸菌制品。一方面可作为直投式发酵剂用于乳制品、发酵食品的生产，另一方面可直接调配成固体饮料直接食用。乳酸菌应用的过程中最核心的问题是要保证其在货架期内的活菌数，降低其衰减速率。然而对现有的乳酸菌冻干菌粉进行研究发现，其放置在＜10℃的低温环境中衰减速率较低，两年存活率可以大于80％，但是当存放在常温环境25℃，或者较高温环境37℃时乳酸菌衰减剧烈，2年存活率一般＜50％，这大大降低了乳酸菌产品的功效。
对于微生物制剂的保藏，专利CN111647510A提供了一种婴儿双歧杆菌冻干粉、制备方法及其所用复合保护剂，所述的复合保护剂包括10-30％脱脂奶粉、0.1-5.0％氨基酸及其盐、3-25％二糖或/和多糖、1-5％小分子多元醇、余量的磷酸盐缓冲液，且复合保护剂的pH为6.5-8.5，所述的婴儿双歧杆菌冻干粉能显著提高菌种的冻干存活率及菌粉活菌数，延长其保存期限；专利CN103041383B则提供了一种活疫苗的耐热冻干保护剂、活疫苗冻干粉及其制备方法，所述耐热冻干保护剂包括低聚糖46-90％、氨基酸1-9％、明胶1-9％、酪蛋白水解物1-9％、聚乙烯基吡咯烷酮1-9％、甘油1-9％、普鲁尼克68 1-9％，所述病毒活疫苗在37℃和20℃条件下的保存期限延长。这表明，选择合适的微生物冻干保护剂，能够明显延长微生物的保存期限。
因此，亟需提供一种乳酸菌冻干保护剂及其冻干粉，进一步提高其冻干存活率及保存时限。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种乳酸菌冻干粉、制备方法及其冻干保护剂。通过本发明所述的抗逆性诱导和冻干保护剂配比来提高乳酸菌存活率及保存期限，能够显著提高乳酸菌的活菌数。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种乳酸菌冻干保护剂，所述的冻干保护剂包括含量为100-400g/L的小分子多元醇和/或糖类，含量为5-20g/L的游离氨基酸或其盐类物质，含量为5-30g/L的维生素C或其盐类物质，含量为10-100g/L的高分子保护剂，含量为5-30g/L的缓冲盐。
具体地，所述的冻干保护剂的pH为5.0-6.5。
具体地，所述的小分子多元醇和/或糖类与游离氨基酸或其盐类物质的含量比为5-80:1。
进一步具体地，所述的小分子多元醇和/或糖类与游离氨基酸或其盐类物质的含量比为10-30:1。
优选地，所述的小分子多元醇和/或糖类与游离氨基酸或其盐类物质的含量比为20:1。
具体地，所述的小分子多元醇和/或糖类包括甘油、甘露醇、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糊精中的一种或多种。
具体地，所述的游离氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸中的一种或者多种。
具体地，所述的高分子保护剂包括牛奶蛋白、阿拉伯胶、魔芋胶、羧甲基纤维素钠中的一种或者多种。
具体地，所述的缓冲盐包括磷酸盐。
进一步具体地，所述的缓冲盐为磷酸二氢钾/钠和磷酸氢二钾/钠，通过缓冲盐的添加将混合液的pH控制在5.0-6.5，防止随着干燥浓缩的进行氢离子对菌体的损伤。
具体地，所述的冻干保护剂能够降低在冻干过程中冰晶形成对菌体的破坏作用，及脱水干燥对菌体和酶活性的损伤。
另一方面，本发明提供了一种抗逆性诱导提高乳酸菌存活率的培养方法，所述的培养方法包括以下步骤：在发酵残糖剩余0.5-1％时，开始降温，使发酵液温度降低到10-25℃，同时停止控碱，使培养基pH随着残糖的消耗降低至4-5，整个过程持续3-5h。
又一方面，本发明提供了一种乳酸菌冻干粉的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)将乳酸菌培养及发酵后，进行上述抗逆性诱导的培养方法；
(2)将上述步骤(1)培养得到的乳酸菌菌液离心，收集菌泥；
(3)将上述步骤(2)离心得到的菌泥与上述冻干保护剂混合，得到混合液，将混合液进行冷冻干燥，得到乳酸菌冻干粉。
具体地，所述的步骤(1)中乳酸菌培养及发酵为将乳酸菌接种至培养基中进行培养与发酵。本发明对乳酸菌培养及发酵和乳酸菌培养及发酵所用的培养基不做特别限制，可以为本领域技术人员熟知的乳酸菌培养基发酵步骤和培养基成分。
具体地，所述的步骤(3)中菌泥与冻干保护剂的质量比为1:1-2。
具体地，所述的步骤(3)中冷冻干燥在冷冻干燥机内完成，包括预冻、一次干燥和二次干燥；所述的预冻为控制层板1h内降温至-45到-50℃，保持3-4h；所述一次干燥为控制层板2h升温至-25到-30℃，保持至一次干燥终点；所述二次干燥为控制层板1h升温至22-30℃，保持至二次干燥终点。
具体地，所述的乳酸菌冻干粉初始活菌数为1×1011-1×1012CFU/g。
具体地，所述的乳酸菌包括但不限于嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillusbreris)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、双歧杆菌(Bifidobacterium species)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过抗逆性诱导和冻干保护剂两方面协同提高乳酸菌冻干粉的活菌数、存活率及保存时限。
(2)本发明所述的冻干保护剂及冻干粉制备方法对不同的乳酸菌具有普适性，可以将乳酸菌的冻干过程存活率提高到90％以上，将乳酸菌货架期内的稳定性比优化前提高20％以上，延长乳酸菌的保存时限，为乳酸菌的应用提供了技术支撑。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
菌种来源说明：实验中涉及的乳酸菌来自江苏微康生物有限公司、丹尼斯克或者汉森，菌株均市售可得。
实施例1乳双歧杆菌的冻干菌粉制备
1.试剂
(1)种子培养基：MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠0.5g/L、酵母粉10g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温-80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
(2)发酵培养基：MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖40g/L、乙酸钠0.5g/L、酵母粉10g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温-80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
(3)冻干保护剂：海藻糖150g/L和麦芽糊精50g/L，游离氨基酸或者盐包括谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸各2g/L，维生素C盐10g/L，牛奶蛋白20g/L、阿拉伯胶10g/L，磷酸氢二钾5g/L，磷酸二氢钾5g/L。
2.实验方法：
取乳双歧杆菌保藏甘油管按照2％的接种量接种摇瓶种子培养基，37℃恒温培养16h，得到种子液；将种子液按2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中培养，补氢氧化钠控制发酵过程的pH为5.5，37℃恒温培养至残糖剩余0.5％，停止补加氢氧化钠，由于乳双歧杆菌继续产酸，培养基的pH继续降低，同时开通冷水降低发酵罐的温度至10℃，整个低pH、低温环境持续时间4h，离心获得菌泥；将菌泥与保护剂1:1(w/w)混合均匀，重悬液的pH调节至5.5，进行冷冻干燥。包括预冻、一次干燥和二次干燥，预冻为控制层板1h内降温至-45℃，保持4h，一次干燥为控制层板1.3h升温至-25℃，保持30h，二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h，即得到乳双歧杆菌冻干粉。检测其活菌数并计算存活率。将制备得到的冻干粉分别在25℃保存6个月，37℃保存6个月后，检测其活菌数并计算存活率。
实施例2
本实施例2与实施例1相比，区别在于，本实施例乳双歧杆菌经发酵培养，残糖剩余0.5％时，不进行降温降pH的操作，直接离心获得菌泥，其余操作步骤与实施例1一致。
实施例3
本实施例3与实施例1相比，区别在于，本实施例冻干保护剂成分为：海藻糖50g/L和麦芽糊精50g/L，游离氨基酸或者盐包括谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸各4g/L，维生素C盐30g/L，牛奶蛋白40g/L，磷酸氢二钠15g/L，磷酸二氢钾15g/L，其余操作步骤与实施例1一致。
实施例4
本实施例4与实施例1相比，区别在于，本实施例冻干保护剂成分为：海藻糖150g/L和麦芽糊精250g/L，游离氨基酸或者盐包括谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸各1g/L，维生素C盐5g/L，阿拉伯胶10g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，磷酸二氢钠2.5g/L，其余操作步骤与实施例1一致。
实施例5
本实施例5与实施例1相比，区别在于，本实施例冻干保护剂成分为：海藻糖25g/L和麦芽糊精25g/L，游离氨基酸或者盐包括谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸各0.5g/L，维生素C盐4g/L，牛奶蛋白2.5g/L、阿拉伯胶1g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钠1g/L，其余操作步骤与实施例1一致。
实施例6
本实施例6与实施例1相比，区别在于，本实施例冻干保护剂成分为：海藻糖100g/L和麦芽糊精100g/L，游离氨基酸或者盐包括谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸各15g/L，维生素C盐40g/L，牛奶蛋白20g/L、阿拉伯胶20g/L，磷酸氢二钾10g/L，磷酸二氢钾10g/L，其余操作步骤与实施例1一致。
实施例7
本实施例7与实施例1相比，区别在于，本实施例冻干保护剂成分为：海藻糖250g/L和麦芽糊精150g/L，游离氨基酸或者盐包括谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸各0.5g/L，维生素C盐10g/L，牛奶蛋白20g/L、阿拉伯胶10g/L，磷酸氢二钾5g/L，磷酸二氢钾5g/L，其余操作步骤与实施例1一致。
实施例8嗜热链球菌的冻干菌粉制备
1.试剂
(1)种子培养基：MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠0.5g/L、酵母粉10g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温-80 1mL/L。
(2)发酵培养基：MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖40g/L、乙酸钠0.5g/L、酵母粉10g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温-80 1mL/L。
(3)冻干保护剂：甘油20g/L、蔗糖80g/L和麦芽糊精60g/L，游离氨基酸或者盐包括谷氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸各2g/L，维生素C盐20g/L，奶粉100g/L，磷酸氢二钾15g/L，磷酸二氢钾15g/L。
2.实验方法：
取嗜热链球菌保藏甘油管按照2％的接种量接种摇瓶种子培养基，37℃恒温培养16h，得到种子液；将种子液按2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中培养，补氨水控制发酵过程的pH为5.5，37℃恒温培养至残糖剩余1％，停止补加氨水，由于嗜热链球菌继续产酸，培养基的pH继续降低，同时开通冷水降低发酵罐的温度至15℃，整个低pH、低温环境持续时间3h，离心获得菌泥；将菌泥与保护剂1:2(w/w)混合均匀，重悬液的pH调节至5.8，进行冷冻干燥。包括预冻、一次干燥和二次干燥，预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持3h，一次干燥为控制层板2h升温至-25℃，保持30h，二次干燥为控制层板1h升温至30℃，保持至二次干燥终点，即得到嗜热链球菌冻干粉。检测其活菌数并计算存活率。将制备得到的冻干粉分别在25℃保存6个月，37℃保存6个月后，检测其活菌数并计算存活率。
实施例9
本实施例9与实施例8相比，区别在于，本实施例嗜热链球菌经发酵培养，残糖剩余1％时，不进行降温降pH的操作，直接离心获得菌泥，其余操作步骤与实施例8一致。
实施例10嗜酸乳杆菌的冻干菌粉制备
1.试剂
(1)种子培养基：MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠0.5g/L、酵母粉10g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温-80 1mL/L。
(2)发酵培养基MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖40g/L、乙酸钠0.5g/L、酵母粉10g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温-80 1mL/L。
(3)冻干保护剂：蔗糖20g/L、半乳糖20g/L和麦芽糊精180g/L，游离氨基酸或者盐包括谷氨酸、缬氨酸、脯氨酸、精氨酸各2g/L，维生素C盐5g/L，阿拉伯胶2g/L，磷酸氢二钾10g/L，磷酸二氢钾10g/L。
2.实验方法：
取嗜酸乳杆菌保藏甘油管按照2％的接种量接种摇瓶种子培养基，37℃恒温培养16h，得到种子液；将种子液按2％(v/v)的接种量接种至发酵罐中培养，补氨水控制发酵过程的pH为5.5，37℃恒温培养至残糖剩余1％，停止补加氨水，由于嗜酸乳杆菌继续产酸，培养基的pH继续降低，同时开通冷水降低发酵罐的温度至15℃，整个低pH、低温环境持续时间5h，离心获得菌泥；将菌泥与保护剂1:1(w/w)混合均匀，重悬液的pH调节至6.0，进行冷冻干燥。包括预冻、一次干燥和二次干燥，预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持3h，一次干燥为控制层板2h升温至-25℃，保持30h，二次干燥为控制层板1h升温至30℃，保持至二次干燥终点，即得到嗜酸乳杆菌冻干粉。检测其活菌数并计算存活率。将制备得到的冻干粉分别在25℃保存6个月，37℃保存6个月后，检测其活菌数并计算存活率。
实施例11
本实施例11与实施例10相比，区别在于，本实施例嗜酸乳杆菌经发酵培养，残糖剩余1％时，不进行降温降pH的操作，直接离心获得菌泥，其余操作步骤与实施例10一致。
实验例1存活率检测
1.冻干菌粉活菌数检测：称量1g冻干菌粉加入9mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至9mL生理盐水中进行梯度稀释，取100μL稀释液涂布于MRS固体培养基中，涂布3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数。
2.菌泥乳化液活菌数检测：
称量1g菌泥乳化液加入9mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至9mL生理盐水中进行梯度稀释，取100μL稀释液涂布于MRS固体培养基中，涂布3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，再乘以菌泥重量，得冻干前总活菌数；冻干后按上述步骤1对菌粉计数。
3.泥水分含量测定：
取10g菌泥，烘箱里105℃烘干至恒重，计算水分含量。
冻干存活率＝冻干后每克菌粉的活菌数/每克菌泥活菌数/菌泥水分含量；
货架期存活率＝货架期每克菌粉的活菌数/冻干后每克菌粉的活菌数；
货架期活菌数：将冻干菌粉分别放置于25℃和37℃6个月的培养箱中检测的活菌数。
技术方法：GB 4789.35-2016食品安全国家标准，食品微生物学检验，乳酸菌检验。
具体检测结果如下表1所示。
表1乳酸菌存活情况
以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。