一种大鼠原代生精细胞体外分离的方法
阅读说明：本技术 一种大鼠原代生精细胞体外分离的方法 (Method for in-vitro separation of primary rat sperm cells ) 是由 周党侠 葛攀 张健 杨妍琪 吕茉琦 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种大鼠原代生精细胞体外分离的方法,采用的方案包括：1)取新鲜离体大鼠双侧睾丸,剥除被膜及血管,获得睾丸组织；2)将睾丸组织消化处理制备单细胞悬液；3)将单细胞悬液培养直至非生精细胞贴壁后,吸出未贴壁的悬浮细胞,对悬浮细胞采用Percoll法分离获得生精细胞。本发明为体外研究大鼠睾丸生殖功能奠定基础,该方法实现了体外分离和培养大鼠睾丸生精细胞,并证实这种方法分离和培养的生精细胞体外存活率高,且存活时间较长。利用该方法能获得正常的大鼠睾丸生精细胞,花费少,操作简单,可重复度高,能满足多种实验需求,值得大范围推广。(The invention discloses a method for separating primary rat sperm cells in vitro, which adopts the following scheme: 1) taking fresh in-vitro rat bilateral testicles, and stripping tunica capsularis and blood vessels to obtain testicular tissues; 2) digesting testis tissue to prepare single cell suspension; 3) culturing the single cell suspension until the non-spermatogenic cells are attached to the wall, sucking the non-attached suspension cells out, and separating the suspension cells by adopting a Percoll method to obtain the spermatogenic cells. The invention lays a foundation for in vitro research of the reproductive function of the testis of the rat, realizes the in vitro separation and culture of the spermatogenic cells of the testis of the rat, and proves that the spermatogenic cells separated and cultured by the method have high in vitro survival rate and longer survival time. The method can be used for obtaining normal rat testicular spermatogenic cells, is low in cost, simple to operate, high in repeatability, capable of meeting various experimental requirements and worthy of being popularized in a large range.)
技术领域
本发明属于细胞培养分离技术领域，涉及一种大鼠原代生精细胞体外分离的方法。
背景技术
世界范围内近10％-15％的育龄夫妇被不孕不育困扰，其中男性因素引起的不育约占50％左右。多项研究表明，尽管存在地区和人种的差异，但是在过去几十年里，人类精子浓度大幅下降，精子质量和生育能力明显降低。多项研究显示相关的遗传物质紊乱失调可能是引起精子生成障碍的主要原因。因此，研究精子发生异常的相关遗传分子机制将为阐明特发性男性不育的病因以及促进相关诊疗技术的发展奠定基础。
精子发生是一个复杂的独特的细胞分化过程，整个过程大致可以分为三个阶段：首先，生精细胞进入有丝分裂阶段，此阶段精原细胞分化为初级精母细胞；然后进入减数分裂阶段，这个阶段中初级精母细胞进行染色体复制，继而同源染色体联会、分离，经历了第一次减数分裂后形成两个次级精母细胞，随后次级精母细胞进入第二次减数分裂，姐妹染色体分离，形成单倍体的圆形精子细胞；最后，精子形成阶段，圆形精子细胞在进行了复杂的形态学变化，核蛋白转型和修饰等一系列复杂过程后形成成熟的精子。在精子发生过程中，任何一个环节受到干扰和影响都有可能会导致精子发生障碍，因此研究精子发生可能的分子机制也是当前生殖医学领域中的一个研究热点。
由于目前市场上成熟的动物生精细胞系品类单一，难以满足所有实验要求，因此当前关于精子发生的相关研究多集中在动物体内水平，很难延展至体外细胞水平开展相关的实验研究。尽管已经有大鼠生精细胞体外培养方法，但大多数提取大鼠生精细胞的方法多局限于使用单种酶消化法。使用这种提取方法单次实验得到的生精细胞数量少，难以满足实验需求，费时费力。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种大鼠原代生精细胞体外分离的方法，该方法分离出的生精细胞数量多且体外存活率高，存活时间也较长，能够满足实验需求。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种大鼠原代生精细胞体外分离的方法，包括以下步骤：
1)取新鲜离体大鼠双侧睾丸，剥除被膜及血管，获得睾丸组织；
2)将睾丸组织消化处理制备单细胞悬液；
3)将单细胞悬液培养直至非生精细胞贴壁后，吸出未贴壁的悬浮细胞，对悬浮细胞采用Percoll法分离获得生精细胞。
优选地，步骤3)中，采用Percoll法分离获得生精细胞，具体操作如下：
用质量浓度为8.5％NaCl将Percoll细胞分离液分别稀释成体积分数为10％、25％、35％、50％的Percoll梯度液；
由高浓度到低浓度，向离心管中依次加入等体积的上述Percoll梯度液，在最上层的Percoll梯度液中缓慢加入培养后的细胞悬液，离心处理后，分层收集细胞。
进一步优选地，离心处理是在1200-1600r/min条件下离心处理15～30min。
优选地，分层收集细胞时，收集体积分数为25％Percoll梯度液和体积分数为35％Percoll梯度液界面之间的细胞，获得生精细胞。
优选地，步骤2)中，消化处理是将睾丸组织剪碎至糜状，加入其10倍体积的浓度为1mg/ml的Ⅳ型胶原酶溶液，于37℃恒温水浴箱震荡消化处理20min，然后在900r/min离心8min，弃上清，沉淀加入复合酶消化液，并于37℃水浴震荡消化处理30min，最后加入10％胎牛血清FBS终止消化。
进一步优选地，消化处理后过400目筛网，收集滤液，在900r/min下离心处理8min，弃上清，然后加入高糖DMEM完全培养基重悬，获得单细胞悬液。
优选地，高糖DMEM完全培养基为含10％FBS高糖DMEM培养基。
优选地，步骤3)中，对单细胞悬液培养的处理是在37℃、5％CO2的培养箱中培养2h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以大鼠模型，提供了其原代生精细胞体外分离的方法，为体外研究大鼠睾丸生殖功能奠定基础，该方法实现了体外分离大鼠睾丸生精细胞，并证实这种方法单次分离和培养的生精细胞数目可超过1×108个/ml，且通过Giemsa染色观察细胞形态和台盼蓝计数细胞活率发现，生精细胞至少可以存活5天，且第五天细胞活率可达75％，同时细胞形态呈圆形、边缘光晕明显。利用该方法能获得正常的大鼠睾丸生精细胞，花费少，操作简单，可重复度高，能满足多种实验需求，值得大范围推广。
附图说明
图1为未加甲醛刺激的原代大鼠生精细胞；其中，A为体外培养24小时的镜下原代大鼠各级生精活细胞；B为体外培养24小时的原代大鼠生精细胞吉姆萨染色；C为体外培养72小时的原代大鼠生精细胞吉姆萨染色；D为体外培养96小时的原代大鼠生精细胞吉姆萨染色。(比例尺＝50μm)
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
1.实验动物
来自西安交通大学实验动物中心的性成熟期(6-10周龄)SD雄性大鼠一只。
2.分离睾丸组织
SD大鼠处死后，在75％酒精中浸泡10分钟；在超净台中分离双侧睾丸，仔细剥除睾丸被膜及组织上的血管，无菌HBSS液洗涤3次。
3.消化组织块
将睾丸组织剪碎至糜状，加入10倍体积的1mg/ml的Ⅳ型胶原酶(厂家：DIYIBio，批号：10312)溶液(Hank’s平衡盐溶液(厂家：上海源培生物，批号：F40508)配制)，37℃恒温水浴箱震荡消化20min；900r/min离心8min，弃上清。加入5ml复合蛋白酶消化液(厂家：Solarbio，批号：606F031)，37℃水浴震荡消化30min，加入5ml 10％胎牛血清(FBS)(厂家：四季青，批号：20050503)终止消化。
4.制备单细胞悬液
经400目的筛网过滤后，收集滤液；900r/min离心8min，弃上清。加入含10％FBS的高糖DMEM培养基(厂家：BasalMedia，批号：J210803)重悬，获得单细胞悬液。
5.去除非生精细胞
将细胞悬液转移入10cm培养皿中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养2h，待其他非生精细胞贴壁后，小心吸出未贴壁的悬浮细胞。
6.分离生精细胞
用8.5％NaCl将Percoll细胞分离液(厂家：Gentihold，批号：P1068-100ml)分别稀释成10％、25％、35％、50％梯度液，从离心管底部开始用缓慢依次从高到低浓度加入梯度液各2ml，在Percoll分离液最上层缓慢加入新收集的细胞悬液，400g离心30min后，分层收集细胞。根据以往实验结果，在25％-35％Percoll界面上的细胞主要为生精细胞；加入含10％FBS高糖DMEM培养基重悬收集的细胞后，于37℃、5％CO2的培养箱中培养，用于后续实验。
检测结果：
参见图1，图1中A：镜下原代大鼠各级生精活细胞；图1中B：体外培养24小时的原代大鼠生精细胞，细胞涂片后Giemsa染色，光镜下可见各级生精细胞及细胞聚团现象；图1中C：体外培养72小时的原代大鼠生精细胞吉姆萨染色；图1中D：体外培养96小时的原代大鼠生精细胞吉姆萨染色。从吉姆萨染色可以清晰看出，不同时间体外培养的原代大鼠生精细胞中，多数细胞的细胞核结构完整，细胞形态正常，说明多数细胞没有明显损伤或死亡。(比例尺＝50μm)
同时，本发明方法单次分离和培养的生精细胞数目可超过1×108个/ml，且通过Giemsa染色观察细胞形态和台盼蓝计数细胞活率发现，生精细胞至少可以存活5天，且第五天细胞活率可达75％，同时细胞形态呈圆形、边缘光晕明显。
而对比现有技术，麦选诚等.大鼠精原细胞的培养、分离与纯化.山东大学学报(医学版).2014.52(z1):8,23的文献报道显示，采用单一酶消化法得到的生精细胞总数仅有1×106个/ml，且死细胞数目能达到1×105个/ml。
因此，可以说明本发明成功构建了大鼠原代生精细胞模型。在未进行任何干预的情况下，按照本发明方法培养的大鼠原代生精细胞至少可存活96小时。以上充分说明，本发明提供的大鼠原代生精细胞分离和培养的方法是可行的，对在体外水平研究大鼠睾丸生殖功能意义重大。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
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