一种棒状杆菌质粒复制子的改造方法及其产品

文档序号：1841916 发布日期：2021-11-16 浏览：11次 >En<

阅读说明：本技术 一种棒状杆菌质粒复制子的改造方法及其产品 (Transformation method of corynebacterium plasmid replicon and product thereof ) 是由刘秀霞黄丹妮余心宇杨艳坤白仲虎于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明基于pEC-XK99E中的pGA1棒杆菌复制子这一在谷氨酸棒杆菌中拷贝数约为30的低拷贝质粒复制子,将复制蛋白Rep的325位异亮氨酸突变为苏氨酸、398位编码丝氨酸的氨基酸变为同义密码子,成功获得了一种可以提高棒杆菌质粒拷贝数的复制子pGA1-Rep-I325T/S398。将该复制子用于高拷贝质粒的构建,携带有pGA1-Rep-I325T/S398复制子的质粒pEC-XK99E-Rep-T/S在谷氨酸棒杆菌中复制后,通过质粒体外抽提证实增加了菌体中质粒的数量。构建pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S质粒,通过测定不同菌体量下的荧光值,与为突变质粒相比荧光量增加三倍即改造后的质粒提高了蛋白的表达量。同时通过荧光定量PCR手段,测定突变后拷贝数为野生型复制子的质粒的8倍约为245。(The invention is based on pGA1 corynebacterium replicon in pEC-XK99E, namely a low copy plasmid replicon with copy number of about 30 in Corynebacterium glutamicum, and successfully obtains a replicon pGA1-Rep-I325T/S398 capable of improving the copy number of corynebacterium plasmid by mutating isoleucine at position 325 of replication protein Rep into threonine and changing amino acid coding serine at position 398 into synonymous codon. The replicon is used for constructing high-copy plasmids, and after the plasmid pEC-XK99E-Rep-T/S carrying pGA1-Rep-I325T/S398 replicon replicates in Corynebacterium glutamicum, plasmid in-vitro extraction proves that the number of plasmids in thalli is increased. pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S plasmids are constructed, and the fluorescence quantity is increased by three times compared with that of mutant plasmids by measuring the fluorescence values under different bacterial quantities, namely the modified plasmids improve the expression quantity of proteins. Meanwhile, the copy number after mutation is determined to be about 8 times of that of the wild replicon plasmid by a fluorescent quantitative PCR method, and the copy number is about 245.)

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种改造的棒状杆菌质粒复制子及其产品。

背景技术

谷氨酸棒杆菌如今常使用的质粒均为棒状杆菌/大肠杆菌的穿梭质粒，其在大肠杆菌中的质粒拷贝数是在谷氨酸棒杆菌中5-6倍。所以外源蛋白通过穿梭质粒在谷氨酸棒杆菌的表达仍有较大的进步空间，构建一个高拷贝的可以在谷氨酸棒杆菌中使用的穿梭质粒很有意义。

目前已经从谷氨酸棒杆菌分离出的内源质粒根据复制方式和复制蛋白的相似性,它们被分类成多个棒杆菌质粒家族:pBL1、pCG1、pSR1以及pGA1家族均采用滚环复制。已有专利报道改造pXMJ19质粒的pBL1复制子可以提高其在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数，但该质粒有复制分离不稳定的情况存在。pEC-XK99E质粒拥有pGA1复制子在谷氨酸棒杆菌中采用滚环复制，拷贝数为30左右。在大多数情况下，革兰氏阳性菌中小的滚环复制的质粒的稳定维持是通过其高拷贝数实现的，并且不需要特定的分配机制。然而，当质粒拷贝数较小的情况下会出现分离不稳定，证明质粒拷贝数与分离稳定性呈正相关。pEC-XK99E中的per(positive effector of replication)蛋白可以调控细胞获得最佳数量的质粒拷贝，研究表明per对pGA1拷贝数的正效应可能是由于它与ctRNA相互作用，从而降低了ctRNA对pGA1基因表达的负面影响。并有实验表明，当pEC-XK99E与pXMJ19在同一菌中表达时可以增加pXMJ19的拷贝数。因此，提高pEC-XK99E质粒的拷贝数对提高谷氨酸棒杆菌外源蛋白表达，稳定穿梭质粒具有正向意义。

在本发明中，使用棒状杆菌/大肠杆菌穿梭质粒pEC-XK99E为基础，对其棒状杆菌复制子pGA1中的复制蛋白(Rep)进行定点突变，并使用报告基因验证了改造后质粒在复制、转录水平对异源蛋白表达的提高。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供了一种改造的棒状杆菌复制子及其产品。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种改造的棒状杆菌复制子，其特征在于：包括，

所述棒状杆菌质粒复制子，以SEQ ID No.1所示Corynebacterium glutamicumLP-6(谷氨酸棒杆菌LP-6)中野生型棒杆菌质粒pGA1的最小复制子氨基酸序列，即片段1，为出发序列，将复制蛋白Rep的325位异亮氨酸突变为苏氨酸、398位丝氨酸变为同义密码子，通过构建重组菌、表达纯化，即得所述改造的棒状杆菌质粒复制子pGA1-Rep-I325T/S398。

作为本发明改造的棒状杆菌质粒复制子的一种优选方案，其中：所述棒状杆菌质粒复制子，包括，

以SEQ ID No.1所示氨基酸序列为出发序列，将复制蛋白Rep的325位异亮氨酸突变为苏氨酸ACC、398位丝氨酸变为同义密码子丝氨酸CAU。

作为本发明改造的棒状杆菌质粒复制子的一种优选方案，其中：所述棒状杆菌质粒复制子pGA1-Rep-I325T/S398其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

作为本发明所述棒状杆菌质粒复制子的改造方法的一种优选方案，其中：所述所述改造方法，包括，

以质粒pEC-XK99E为模版，设计引物Replicon_F、Replicon_R，通过PCR得到pEC-XK99E质粒中的棒状杆菌pGA1最小复制子区(1696bp)，即片段1；将片段1做琼脂糖凝胶电泳，回收正确分子量的琼脂糖凝胶条带，测定浓度后备用；

将片段1设计引物Replicon_F、355_R、355_F、575_R、575_F、Replicon_R，进行突变，将355位点由G突变为A得到片段2，355位点由G突变为A且575位点由T突变为C得到片段3，355位点由G突变为A得到片段4，片段2～4序列为SEQ ID NO.9～11；

将片段2、3进行重叠PCR，引物为Replicon_F、575_R，得到片段5，序列为SEQ IDNO.12；

将片段4、5进行重叠PCR，引物为Replicon_F、Replicon_R，得到片段6，序列为SEQID NO.13；

以pEC-XK99E质粒为模版，通过PCR获得除pGA1复制子外的线性载体，且与该复制子有25bp及以上的同源序列。设计引物为Plasmid_F和Plasmid_R，核苷酸序列如SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16所示；获得的线性载体片段19(5322bp)，序列如SEQ ID NO.19所示；

片段19与片段6进行同源重组，连接产物转化大肠杆菌JM109，转接培养后获得带有目的突变复制子的组成质粒：改造棒状杆菌质粒复制子pEC-XK99E-Rep-T/S。

作为本发明所述棒状杆菌质粒复制子的改造方法的一种优选方案，其中：所述设计引物Replicon_F、Replicon_R，其中，所述引物Replicon_F、Replicon_R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

作为本发明所述棒状杆菌质粒复制子的改造方法的一种优选方案，其中：所述琼脂糖凝胶电泳条件为170v，电泳时间为10～15min。

作为本发明所述棒状杆菌质粒复制子的改造方法的一种优选方案，其中：所述回收正确分子量，所述分子量即最小复制子的分子量1696bp。

作为本发明所述棒状杆菌质粒复制子的改造方法的一种优选方案，其中：所述设计引物Replicon_F、355_R、355_F、575_R、575_F、Replicon_R，其中，引物355_R、355_F、575_R、575_F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.11所示；所述设计引物Plasmid_F和Plasmid_R，其中，引物Plasmid_F和Plasmid_R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16所示。

作为本发明所述棒状杆菌质粒复制子的改造方法的一种优选方案，其中：所述同源重组，重组条件为片段19与片段6的浓度比例为1:3，50℃反应30min。

作为本发明所述棒状杆菌质粒复制子的改造方法所制得的产品，改造棒状杆菌质粒复制子pEC-XK99E-Rep-T/S，其特征在于：所述改造棒状杆菌质粒复制子pEC-XK99E-Rep-T/S，图谱如图3所示，其突变后拷贝数为野生型复制子的质粒的8倍。

本发明有益效果：

本发明公开了一种改造的棒状杆菌复制子及其应用。本发明提供的质粒复制子是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum LP-6)中棒杆菌质粒pGA1的最小复制子的Rep蛋白的325位异亮氨酸突变为苏氨酸、398位丝氨酸突变为同义密码子。携带本发明的人工改造的质粒复制子pGA1-Rep-I325T/S398的质粒pEC-XK99E-Rep-T/S，在谷氨酸棒杆菌中复制后质粒拷贝数为携带原始未突变复制子质粒(pEC-XK99E)的8倍。pEC-XK99E在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数约为30，pEC-XK99E-Rep-T/S的拷贝数为245。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明所得人工改造的质粒复制子pGA1-Rep-I325T/S398的结构示意图。

图2为携带野生型pGA1复制子的质粒pEC-XK99E-EGFP的图谱。

图3为携带pGA1-Rep-I325T/S398复制子的质粒pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S的图谱。

图4为实施例1中PCR扩增后产物的电泳图，L1、2、3为生物学平行样本。

图5为实施例1中制备的片段6的测序验证结果图。

图6为性能测试中单位荧光值用Prism 9绘制的柱状图，CONTROL代表未改造前的质粒的荧光/OD值。其中，2-4、2-6、3-1、3-2、3-3为拥有定点突变复制子的质粒的平行样本。

图7为性能测试中RT-PCR测试的拷贝数的结果，CONTROL代表未改造前的质粒拷贝数。其中，2-4、2-6、3-1、3-2、3-3为拥有定点突变复制子的质粒的平行样本。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明的目的在于设计一种具有能够提高棒状杆菌质粒拷贝数的复制子，并构建高拷贝的棒状杆菌质粒。

本发明使用产物柱购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司，型号为DNA Clean-up Kit；本发明所使用引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

所使用其他原料，若无特殊说明，均为市售。

实施例1

体外改造pGA1棒杆菌复制子：

本实验的目的是获得一个高拷贝的pGA1-Rep-I325S/T398突变体。其步骤如下：

(1)以质粒pEC-XK99E为模版，设计引物，通过PCR获得pEC-XK99E质粒中的棒状杆菌pGA1最小复制子区(1696bp)即片段1，所述引物为Replicon_F、Replicon_R且其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。由苏州金唯智生物科技有限公司合成。所述PCR反应条件为：预变性94℃反应3min；变性94℃反应30s，退火温度55℃反应30s，延伸温度72℃延伸2min，进行34个循环；最后72℃保持5min。所述PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR反应体系

将PCR扩增后的产物做琼脂糖凝胶电泳，回收最小复制子的分子量1696bp的琼脂糖凝胶条带，测定浓度后备用；其PCR扩增后产物的电泳图如附图4所示。

(2)片段1设计引物进行突变，将575位点由T突变为C，355位点由G突变为A。引物为Replicon_F、355_R、355_F、555_R、555_F、Replicon_R，核苷酸序列依次如：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.4。得到片段2、3、4，序列为：SEQ ID NO.9～11。

(3)将片段2、3进行重叠PCR。以片段2和3为模版等比例加入体系，引物为Replicon_F、575_R，得到片段5，序列如SEQ ID NO.12。

(4)将片段4和5为模版等比例加入体系进行重叠PCR，引物为Replicon_F、Replicon_R得到片段6，序列如SEQ ID NO.13所示。

步骤(3)、(4)重叠PCR中使用PrimeSTAR聚合酶，反应条件为：预变性98℃反应3min，变性98℃反应15s，退火温度55℃反应15s，延伸温度72℃，延伸速度为6～10kb/min，进行30个循环；最后72℃保持5min。

(5)将实施例1制备的片段6送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，结果如图5所示，证明即为目的pGA1-Rep-I325S/T398复制子。

实施例2

带有突变Rep基因的质粒构建：

本实施例为了更好检测产品性能，提供一种组成型表达EGFP蛋白的pEC-XK99E-Rep-T/S的质粒的构建，包括以下步骤：

(1)以pEC-XK99E质粒为基础，切除lacIq启动子、lacI、lac操纵子等的基因原件，构建包涵组成型tac启动子的pEC-XK99E-Ptac。

(2)使用引物EcoRI-EGFP_F和BamHI-EGFP_R扩增EGFP即片段7。扩增方法为PCR使用PrimeSTAR聚合酶反应，反应条件为：预变性98℃反应3min；变性98℃反应15s，退火温度55℃反应15s，延伸温度72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃保持5min。

(3)通过酶切位点EcoRI和BamHI对片段7进行双酶切，先在体系中加入酶1QuickCut^TMBamHI，30℃反应30min，再加入酶2QuickCut^TM EcoRI，37℃反应30min。酶切产物进行柱回收得到片段8，产物柱购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司，型号为DNAClean-up Kit。双酶切体系如表2所示。

表2酶切体系

(4)通过酶切位点EcoRI和BamHI对pEC-XK99E-Ptac进行双酶切，反应条件与步骤(3)相同，核酸电泳分离胶回收大片段(5494bp)即片段9。

(5)片段9和片段8在摩尔比例为1:3下进行连接，使用Ligation mix，反应温度16℃，过夜连接。所述酶联体系如表3所示。连接产物转化大肠杆菌JM109，涂布LBB(Kan⁺)平板，37℃过夜培养，即可获得转化子。挑取转化子单菌落，在Kan抗性的LBB液体培养基中37℃过夜培养，提取质粒，即得到pEC-XK99E-EGFP质粒，序列如SEQ ID NO.14所示。

表3酶连体系

(6)以pEC-XK99E-EGFP质粒为模版，通过PCR获得除pGA1复制子外的线性载体，且与该复制子有25bp及以上的同源序列。设计引物为Plasmid_F和Plasmid_R，核苷酸序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示。获得的线性载体片段10(5494bp)，序列如SEQ ID NO.17所示。PCR反应使用PFX聚合酶，反应条件为：预变性94℃反应3min；变性94℃反应30s，退火温度55℃反应30s，延伸温度72℃延伸1min，进行34个循环；最后72℃保持5min。

(7)片段10与片段6进行同源重组，要求浓度比例为1:3，56℃反应30min。同源重组体系如表4所示。连接产物转化大肠杆菌JM109，转接培养后获得带有目的突变复制子的组成型表达EGFP的质粒pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S，图谱如图3所示。

表4同源重组体系

实施例3

质粒pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S在谷氨酸棒杆菌中的拷贝能力测试：

取pEC-XK99E-EGFP和pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S质粒，分别转入谷氨酸棒杆菌BZH001野生型菌株，步骤如下：(1)取5μl pEC-XK99E-EGFP和pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S质粒加入100μl谷氨酸棒杆菌BZH001感受态细胞中，冰浴10min后转入冷冻的电转杯中；(2)1800Kv电击两次；(3)立即加入已预热的46℃LBHIS恢复培养基中，46℃水浴6min，转入30℃摇床中恢复培养2h；(4)涂布于30μg/ml卡那霉素抗性的LBHIS固体培养基中，于30℃培养箱中24h培养。

检测菌株的荧光值反应拷贝数，步骤如下：

(1)定初始OD为0.2时对含有pEC-XK99E-EGFP和pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S质粒的谷氨酸棒杆菌BZH001菌在10mL LBB(Kan⁺)培养基中进行发酵。(2)30℃摇床培养12h和24h定点取样，测量其荧光/OD₆₀₀，结果如图6所示。图6为性能测试中单位荧光值用Prism 9绘制的柱状图，CONTROL代表未改造前的质粒的荧光/OD值，2-4、2-6、3-1、3-2、3-3为拥有定点突变复制子的质粒的平行样本。由图可读出含pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S质粒的菌株的单位荧光强度为含pEC-XK99E-EGFP菌株的3～3.5倍，表明该质粒在蛋白水平反映出拷贝数的增加，侧面反映出质粒的拷贝数增加并验证该质粒可用于生产蛋白。

体外抽提谷氨酸棒杆菌质粒，步骤如下：

(1)取1OD的带有pEC-XK99E-EGFP和pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S质粒的BZH001菌液，12000rpm/min离心1min，弃上清，用PBS重悬，清洗三遍。(2)加入20μL溶菌酶(10mg/mL)37℃预处理一小时。(3)按照江苏康为世纪生物科技股份有限公司的质粒提取说明书进行质粒抽提。(4)质粒产量对比，对比数据如表5所示。

表5质粒产量对比数据表

含pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S的菌株在定OD600条件下体外抽提获得的质粒是含pEC-XK99E-EGFP菌株的3.9倍，证明该突变质粒在质粒水平及表现出拷贝数的增加。

按照江苏康为世纪生物科技股份有限公司说明书提取谷氨酸棒杆菌BZH001总DNA。

以荧光定量PCR法测定质粒相对复制能力，步骤如下：

(1)选择以下引物进行荧光定量PCR测定pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S相对pEC-XK99E-EGFP的质粒拷贝数增加。所选计引物为：

测定谷氨酸棒杆菌内源DNA的引物：

DNA_F:GGTCGATGACATCCAGTTCC

DNA_R:GCTTATCTGCCTGGTGCAAT

测定质粒DNA的引物：

Rep_F:TGGCATCTTTTAGGCGCTCA

Rep_R:TGCGAGTGCTCTGGACAAAT

(2)配置反应液，反应液内容物如表6所示。每个样品设立三个平行样，计算DNA加入体积不超过总反应体积的1/10，配置体系时应尽量避免强光照射。PCR反应条件为：预变性95℃反应20s；变性95℃反应10s，退火温度60℃反应30s，延伸温度72℃延伸20s，进行40个循环。溶解曲线测量：72℃2min；95℃15s；60℃30s；95℃15s。

表6反应液内容物

(3)RT-PCR结果如图7所示，CONTROL代表未改造前的质粒拷贝数，2-4、2-6、3-1、3-2、3-3为拥有定点突变复制子的质粒的平行样本。StepOne^TM Real-Time PCR System软件计算出各组之间的差异倍数，通过与pEC-XK99E-EGFP的拷贝数相比较得到pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S的相对拷贝质粒数为8倍，说明该突变后质粒在转录水平表现出拷贝数的差异。通过文献报道，pEC-XK99E在谷氨酸棒杆菌中的质粒拷贝数为30～35，计算得pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S的拷贝数约为245。

本发明基于pEC-XK99E中的pGA1棒杆菌复制子这一在谷氨酸棒杆菌中拷贝数约为30的低拷贝质粒复制子，将复制蛋白Rep的325位异亮氨酸突变为苏氨酸、398位编码丝氨酸的氨基酸变为同义密码子，成功获得了一种可以提高棒杆菌质粒拷贝数的复制子pGA1-Rep-I325T/S398。将该复制子用于高拷贝质粒的构建，携带有pGA1-Rep-I325T/S398复制子的质粒pEC-XK99E-Rep-T/S在谷氨酸棒杆菌中复制后，通过质粒体外抽提证实增加了菌体中质粒的数量。构建pEC-XK99E-EGFP-Rep-T/S质粒，通过测定不同菌体量下的荧光值，与为突变质粒相比荧光量增加三倍即改造后的质粒提高了蛋白的表达量。同时通过荧光定量PCR手段，测定突变后拷贝数为野生型复制子的质粒的8倍约为245。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种棒状杆菌复制子的改造方法及其产品

<141> 2021-08-22

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1696

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccatcaatcc tgcctatttg ccacgtttaa caaggtagtt aagcgttcat ttacgaagaa 60

aacacgataa gctgcacaaa tacctgaaaa agttgaacgc cccgtgagcg ggaactcaca 120

gggcgtcggc taacccccag tcatcagctg ggagaaagca ctcaagacat gactctagcc 180

gatccgcagg acacagtcac agctagcgcg tggaaatttt ccgccgatct gttcgacacc 240

caccccgaac tagcgctgcg ctcacgcggc tggacggcag aagatcgccg cgaactgctc 300

gctcacctgg gacgcgaaag cttccagggc agcaagacaa gagatttcgc gagcgcctgg 360

attaaaaacc cggataccgg cgaaacccaa ccaaagctct accgggctgg ctcaaaagcg 420

ctgacgcggt gccagtacgt tgcgctgacg cacgcgcaac atgccgcggt gatcgtgctt 480

gacatcgatg tgcccagcca ccaggccggc gggaagattg agcacgtaaa cccgcaggtc 540

tacgcgattt tagagaaatg ggcacgccta gaaaaagcgc cggcttggat cggcgtgaat 600

ccgctgagcg ggaaatgcca gctcatctgg ctcattgacc cggtgtatgc cgcagcaggt 660

aaaaccagcc caaatatgcg cctgctggct gcaacgacgg aagaaatgac tcgtgttttc 720

ggcgctgacc aggctttttc gcataggctg agccggtggc cgctgcacgt ctcagacgat 780

ccgacagcct ataaatggca ctgccagcat gatcgtgtgg atcggctggc cgacctaatg 840

gagattgctc gaacgatgac cggatcacag aagccgaaaa agtacattga gcaggacttt 900

tccagcggac gcgcccgcat tgaagcggca caacgcgcca ccgcagaagc caaggcgcta 960

gcgattttgg acgcgagcct gccgagcgcc ctggacgcgt ccggcgacct gatcgacggc 1020

gtgcgagtgc tctggacaaa tccagagcgc gcagcgcgcg acgagaccgc gtttcgccac 1080

gcgttgaccg tgggatacca gctcaaagct gctggtgagc gcctaaaaga tgccaagatc 1140

atcgacgcgt atgaagtggc gtacaacgtt gcccaggcgg tcggtgcaga cggccgggag 1200

ccggatcttc ccgccatgcg tgatcgcctg acgatggcgc gtcgtgtgcg cggctacgtg 1260

gctaaaggcc agccagtcgt ccctgctcgt cgggtggaaa cgcagagcag ccgagggcgg 1320

aaagctctag cgacgatggg gcgacggggc gcagctacat cgaatgcacg cagatgggct 1380

gacccagaaa gtaagtatgc gcaggagacg cgacagcgat tagcggaagc aaacaaacgc 1440

cgagaaatga caggcgagtt gctcgaactt cgcgtcaaaa ctgcgatcct ggatgcccgt 1500

tctcaatcgg ttgctgatcc ctcgactcgt gagcttgcag gcgaactagg tgtcagtgaa 1560

aggcgcatcc aacaagtcag aaaggcactt ggaatggaag ctaaacgcgg ccgtccacgg 1620

gctgaaaact aataaacgaa acaccgtcag cagaaaacgg ttcccccctt taggggtccc 1680

gtccttgctc tggctc 1696

<210> 2

<211> 1696

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ccatcaatcc tgcctatttg ccacgtttaa caaggtagtt aagcgttcat ttacgaagaa 60

aacacgataa gctgcacaaa tacctgaaaa agttgaacgc cccgtgagcg ggaactcaca 120

gggcgtcggc taacccccag tcatcagctg ggagaaagca ctcaagacat gactctagcc 180

gatccgcagg acacagtcac agctagcgcg tggaaattgt ccgccgatct gttcgacacc 240

caccccgaag ctatgcgctg cggctcacgc ggctggacgg cagaagatcg ccgcgaactg 300

ctcgctcacc tgggacgcga aagcttccag ggcagcaaga caagagattt cgcgagcgcc 360

tggattaaaa acccggatac cggcgaaacc caaccaaagc tctaccgggc tggctcaaaa 420

gcgctgacgc ggtgccagta cgttgcgctg acgcacgcgc aacatgccgc ggtgatcgtg 480

cttgacatcg atgtgcccag ccaccaggcc ggcgggaaga ttgagcacgt aaacccgcag 540

gtctacgcga ttttagagaa atgggcacgc ctagaaaaag cgccggcttg gatcggcgtg 600

aatccgctga gcgggaaatg ccagctcatc tggctcattg acccggtgta tgccgcagca 660

ggtaaaacca gcccaaatat gcgcctgctg gctgcaacga cggaagaaat gactcgtgtt 720

ttcggcgctg accaggcttt ttcgcatagg ctgagccggt ggccgctgca cgtctcagac 780

gatccgacag cctataaatg gcactgccag catgatcgtg tggatcggct ggccgaccta 840

atggagattg ctcgaacgat gaccggatca cagaagccga aaaagtacat tgagcaggac 900

ttttccagcg gacgcgcccg cattgaagcg gcacaacgcg ccaccgcaga agccaaggcg 960

ctagcgattt tggacgcgag cctgccgagc gccctggacg cgtccggcga cctgatcgac 1020

ggcgtgcgag tgctctggac aaatccagag cgagcgcgcg acgagaccgc gtttcgccac 1080

gcgttgaccg tgggatacca gctcaaagct gctggtgagc gcctaaaaga tgccaagatc 1140

accgacgcgt atgaagtggc gtacaacgtt gcccaggcgg tcggtgcaga cggccgggag 1200

ccggatcttc ccgccatgcg tgatcgcctg acgatggcgc gtcgtgtgcg cggctacgtg 1260

gctaaaggcc agccagtcgt ccctgctcgt cgggtggaaa cgcagagcag ccgagggcgg 1320

aaagctctag cgacgatggg gcgacggggc gcagctacat caaatgcacg cagatgggct 1380

gacccagaaa gtaagtatgc gcaggagacg cgacagcgat tagcggaagc aaacaaacgc 1440

cgagaaatga caggcgagtt gctcgaactt cgcgtcaaaa ctgcgatcct ggatgcccgt 1500

tctcaatcgg ttgctgatcc ctcgactcgt gagcttgcag gcgaactagg tgtcagtgaa 1560

aggcgcatcc aacaagtcag aaaggcactt ggaatggaag ctaaacgcgg ccgtccacgg 1620

gctgaaaact aataaacgaa acaccgtcag cagaaaacgg ttcccccctt taggggtccc 1680

gtccttgctc tggctc 1696

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cggagggtga gggcaagtga 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cggcagcgtg aagctagatc c 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cgcagctaca tcaaatgcac gcagat 26

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atctgcgtgc atttgatgta gctgc 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atgccaagat caccgacgcg tatgaa 26

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tcatacgcgt cggtgatctt ggcat 25

<210> 9

<211> 367

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cggagggtga gggcaagtga gagccagagc aaggacggga cccctaaagg ggggaaccgt 60

tttctgctga cggtgtttcg tttattagtt ttcagcccgt ggacggccgc gtttagcttc 120

cattccaagt gcctttctga cttgttggat gcgcctttca ctgacaccta gttcgcctgc 180

aagctcacga gtcgagggat cagcaaccga ttgagaacgg gcatccagga tcgcagtttt 240

gacgcgaagt tcgagcaact cgcctgtcat ttctcggcgt ttgtttgctt ccgctaatcg 300

ctgtcgcgtc tcctgcgcat acttactttc tgggtcagcc catctgcgtg catttgatgt 360

agctgcg 367

<210> 10

<211> 246

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atctgcgtgc atttgatgta gctgcgcccc gtcgccccat cgtcgctaga gctttccgcc 60

ctcggctgct ctgcgtttcc acccgacgag cagggacgac tggctggcct ttagccacgt 120

agccgcgcac acgacgcgcc atcgtcaggc gatcacgcat ggcgggaaga tccggctccc 180

ggccgtctgc accgaccgcc tgggcaacgt tgtacgccac ttcatacgcg tcggtgatct 240

tggcat 246

<210> 11

<211> 1175

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tcatacgcgt cggtgatctt ggcatctttt aggcgctcac cagcagcttt gagctggtat 60

cccacggtca acgcgtggcg aaacgcggtc tcgtcgcgcg ctcgctctgg atttgtccag 120

agcactcgca cgccgtcgat caggtcgccg gacgcgtcca gggcgctcgg caggctcgcg 180

tccaaaatcg ctagcgcctt ggcttctgcg gtggcgcgtt gtgccgcttc aatgcgggcg 240

cgtccgctgg aaaagtcctg ctcaatgtac tttttcggct tctgtgatcc ggtcatcgtt 300

cgagcaatct ccattaggtc ggccagccga tccacacgat catgctggca gtgccattta 360

taggctgtcg gatcgtctga gacgtgcagc ggccaccggc tcagcctatg cgaaaaagcc 420

tggtcagcgc cgaaaacacg agtcatttct tccgtcgttg cagccagcag gcgcatattt 480

gggctggttt tacctgctgc ggcatacacc gggtcaatga gccagatgag ctggcatttc 540

ccgctcagcg gattcacgcc gatccaagcc ggcgcttttt ctaggcgtgc ccatttctct 600

aaaatcgcgt agacctgcgg gtttacgtgc tcaatcttcc cgccggcctg gtggctgggc 660

acatcgatgt caagcacgat caccgcggca tgttgcgcgt gcgtcagcgc aacgtactgg 720

caccgcgtca gcgcttttga gccagcccgg tagagctttg gttgggtttc gccggtatcc 780

gggtttttaa tccaggcgct cgcgaaatct cttgtcttgc tgccctggaa gctttcgcgt 840

cccaggtgag cgagcagttc gcggcgatct tctgccgtcc agccgcgtga gccgcagcgc 900

atagcttcgg ggtgggtgtc gaacagatcg gcggacaatt tccacgcgct agctgtgact 960

gtgtcctgcg gatcggctag agtcatgtct tgagtgcttt ctcccagctg atgactgggg 1020

gttagccgac gccctgtgag ttcccgctca cggggcgttc aactttttca ggtatttgtg 1080

cagcttatcg tgttttcttc gtaaatgaac gcttaactac cttgttaaac gtggcaaata 1140

ggcaggattg atggggatct agcttcacgc tgccg 1175

<210> 12

<211> 587

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cggagggtga gggcaagtga gagccagagc aaggacggga cccctaaagg ggggaaccgt 60

tttctgctga cggtgtttcg tttattagtt ttcagcccgt ggacggccgc gtttagcttc 120

cattccaagt gcctttctga cttgttggat gcgcctttca ctgacaccta gttcgcctgc 180

aagctcacga gtcgagggat cagcaaccga ttgagaacgg gcatccagga tcgcagtttt 240

gacgcgaagt tcgagcaact cgcctgtcat ttctcggcgt ttgtttgctt ccgctaatcg 300

ctgtcgcgtc tcctgcgcat acttactttc tgggtcagcc catctgcgtg catttgatgt 360

agctgcgccc cgtcgcccca tcgtcgctag agctttccgc cctcggctgc tctgcgtttc 420

cacccgacga gcagggacga ctggctggcc tttagccacg tagccgcgca cacgacgcgc 480

catcgtcagg cgatcacgca tggcgggaag atccggctcc cggccgtctg caccgaccgc 540

ctgggcaacg ttgtacgcca cttcatacgc gtcggtgatc ttggcat 587

<210> 13

<211> 1737

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13