一种具有缓解结肠炎作用的富含酰基的羽衣甘蓝黄酮纯化方法及其应用
阅读说明：本技术 一种具有缓解结肠炎作用的富含酰基的羽衣甘蓝黄酮纯化方法及其应用 (Purification method and application of acyl-rich collard flavone with colitis relieving effect ) 是由 聂少平 王辉 陈晓敏 黄晓君 殷军艺 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有缓解结肠炎作用的富含酰基的羽衣甘蓝黄酮纯化方法及其应用。本发明利用醇提法获取羽衣甘蓝黄酮提取物,采用NKA-9大孔树脂分离纯化获得羽衣甘蓝总黄酮,再经含有重复酰胺基团的热塑性树脂纯化,分离获得可定向到达结肠的酰基黄酮组分。本发明大孔树脂分离纯化所得羽衣甘蓝总黄酮纯度达到31.16％,回收率高达85.64％,吸附量可达15.93mg每克树脂；再经含有重复酰胺基团的热塑性树脂纯化的羽衣甘蓝黄酮纯度高达37.02％,其具有定向到达结肠能力的酰基黄酮是大孔树脂分离纯化黄酮的5.02倍。本发明提供的富含酰基的羽衣甘蓝总黄酮能够有效地缓解溃疡性结肠炎,安全且治疗效果好,能够在制备缓解结肠炎的功能性食品添加剂中应用。(The invention discloses a method for purifying collard flavone rich in acyl group and having the function of relieving colitis and application thereof. The method comprises the steps of obtaining a collard flavone extract by an alcohol extraction method, separating and purifying by NKA-9 macroporous resin to obtain collard total flavone, purifying by thermoplastic resin containing repeated amide groups, and separating to obtain an acyl flavone component which can directionally reach the colon. The purity of the collard total flavonoids obtained by macroporous resin separation and purification reaches 31.16 percent, the recovery rate reaches 85.64 percent, and the adsorption capacity can reach 15.93mg per gram of resin; the purity of the kale flavone purified by the thermoplastic resin containing the repeated amide groups is up to 37.02 percent, and the acyl flavone with the capability of directionally reaching colon is 5.02 times of that of the flavone separated and purified by the macroporous resin. The acyl-rich kale total flavonoids provided by the invention can effectively relieve ulcerative colitis, are safe and good in treatment effect, and can be applied to preparation of a functional food additive for relieving colitis.)
技术领域
本发明属于黄酮的分离纯化技术领域，具体涉及一种具有缓解结肠炎作用的富含酰基的羽衣甘蓝黄酮纯化方法及其应用。
背景技术
羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.sabellica)是二年生的芸苔科植物，是中欧、北欧和北美等地广泛栽培的蔬菜。羽衣甘蓝每次每株可采收3-5片叶，留下未成熟的嫩叶继续生长，陆续采收。在早春或晚秋，羽衣甘蓝的叶片质地脆嫩、风味好。夏季高温时，叶片较坚硬，纤较多，风味差。在夏季以及未能及时采收的老叶被废弃，造成了资源的极大浪费。研究表明，羽衣甘蓝中富含黄酮类物质且种类繁多，一些品种中黄酮种类甚至多达70多种。黄酮类化合物是广泛分布于植物体内的次生代谢产物。黄酮类化合物具有很强的抗氧化作用，能清除生物体内的自由基；还可以有效抗衰老、抗癌、抗病毒、抗过敏、抗糖尿病，然而杂质和较低的纯度限制了黄酮类化合物功能活性的发挥。
溃疡性结肠炎是一种慢性和复发性肠道炎症性疾病，具有发生结肠癌的高风险，病变累及全结肠和末端回肠，临床上表现为腹泻、腹痛和便血。溃疡性结肠炎患者会发生严重的肠道炎症，饮食受限，从而导致体重下降，严重影响患者生活质量。据统计，世界上有数百万人患有溃疡性结肠炎，特别是在北欧和美洲，这对人类健康构成了巨大的威胁。溃疡性结肠炎的病因与遗传、免疫和环境因素有关。此外，溃疡性结肠炎的发病位置为结肠，许多常规的口服药物因在小肠中被直接吸收使得病灶位的有效浓度过低而限制疗效。因此，能直接到达结肠靶向给药能大幅提高对溃疡性结肠炎的治疗效果。
大孔树脂法是广泛使用的一种纯化方法，相比于大孔树脂法，溶剂萃取法需要使用大量有害的有机溶剂，存在环境保护和健康问题。微波、超声波、酶提取法等也无法提高黄酮的纯度。相比而言大孔树脂法具有容量大、得率高、纯度高、操作简单、无毒和无污染等优点。但不同来源的黄酮类化合物种类差异巨大，不同黄酮需要匹配不同的大孔树脂，尤其如羽衣甘蓝中种类如此之多，且化学性质差异巨大的植物，对其中的黄酮进行纯化存在较大难度。因此，开发一种可以有效分离纯化酰基化羽衣甘蓝黄酮的方法和针对缓解溃疡性结肠炎的应用十分有必要。
发明内容
针对背景技术中提及的问题，本发明提供了一种具有缓解结肠炎作用的富含酰基的羽衣甘蓝黄酮纯化方法及其应用，具体是通过如下技术方法实现的：
一种具有缓解结肠炎作用的富含酰基的羽衣甘蓝黄酮纯化方法，包括以下步骤：
1)羽衣甘蓝黄酮浸膏的制备：
利用乙醇水溶液对羽衣甘蓝粉末进行搅拌加热提取，4800rpm/min离心10min后取上清液，真空旋转蒸发浓缩至脂溶性成分析出，4800rpm/min离心10min去除脂溶性成分后取上清液，进一步浓缩至浸膏状备用；
2)羽衣甘蓝总黄酮的纯化：
取步骤1)所得浸膏用蒸馏水稀释得到黄酮溶液，调节溶液pH后倒入装有大孔树脂的容器中搅拌吸附，收集大孔树脂用蒸馏水淋洗至无色，然后以乙醇水溶液为洗脱剂搅拌洗脱，收集洗脱液真空旋转蒸发浓缩后冻干得到纯化后的羽衣甘蓝总黄酮，检测计算黄酮的吸附率、解吸率、回收率和解吸量；
3)可定向到达结肠的酰基羽衣甘蓝黄酮组分的纯化：
取步骤2)所得纯化后的羽衣甘蓝总黄酮，用低碳醇将黄酮溶解，再加入吸附填料搅拌均匀，挥干后装于层析柱中，用浓度递增的洗脱剂依次对层析柱洗脱，分别收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩后冻干，得到可定向到达结肠的酰基羽衣甘蓝黄酮组分，检测计算黄酮含量，并鉴定黄酮成分。
进一步地，步骤1)所述乙醇水溶液的体积分数为60％-80％，其与羽衣甘蓝粉末的料液比为1：10-30(g/mL)；加热温度为45-60℃。
进一步地，步骤2)所述大孔树脂为D101、NKA-9、HPD-400、HPD-500、AB-8、HPD-450或XDA-1。
进一步地，步骤2)所述稀释得到的黄酮溶液浓度为0.1-2mg/mL，所述黄酮溶液调节pH后pH值为2-8。
进一步地，步骤2)所述乙醇水溶液的体积分数为30％-95％。
进一步地，步骤2)、3)所述黄酮含量检测均以芦丁作为标准品，采用三氯化铝比色法进行定量。
进一步地，步骤2)计算测定液中的黄酮浓度，吸附率(％)＝(吸附前溶液中的黄酮总量－吸附后溶液中的黄酮总量)/吸附前溶液中的黄酮总量×100％；解吸率(％)＝洗脱后洗脱液中的黄酮总量/(吸附前溶液中的黄酮总量－吸附后溶液中的黄酮总量)×100％；和回收率(％)＝吸附率(％)×解吸率(％)×100％；解吸量为洗脱后洗脱液中的黄酮总量。
进一步地，步骤3)所述吸附填料为含有重复酰胺基团的热塑性树脂、硅胶或硅藻土。
进一步地，步骤3)所述洗脱其流速为0.5-2BV/h。
进一步地，步骤3)所述浓度递增的洗脱剂依次为：梯度1洗脱剂为10％-25％的低碳醇水溶液，用量为2-5BV；梯度2洗脱剂为30％-45％的低碳醇水溶液，用量为2-5BV；梯度3洗脱剂为50％-65％的低碳醇水溶液，用量为2-5BV；梯度4洗脱剂为70％-90％的低碳醇水溶液，用量为2-5BV；所述低碳醇为乙醇和/或甲醇。
进一步地，步骤3)所述黄酮鉴定方法采用超高效液相-离子阱-串联质谱(ABSCIEX Q-Ttap 4500)进行负离子检测，并以Quercetin-3-O-D-glucoside和Kaempferol-3-O-D-glucoside作为标准品进行相对定量。
进一步地，步骤3)所得可定向到达结肠的酰基羽衣甘蓝黄酮组分中酰基化黄酮含量为步骤2)所得纯化后的羽衣甘蓝总黄酮中的5.02倍。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明采用NKA-9大孔树脂对羽衣甘蓝黄酮进行纯化，所得羽衣甘蓝总黄酮纯度达到31.16％，回收率高达85.64％，吸附量可达15.93mg每克树脂，为所选大孔树脂中羽衣甘蓝黄酮纯度和回收率最优。与纯化前羽衣甘蓝黄酮浸膏黄酮纯度3.8％相比，纯度提升8.2倍；后续再经含有重复酰胺基团的热塑性树脂纯化后羽衣甘蓝黄酮纯度高达37.02％，具有定向到达结肠特征和潜在的靶向药用价值。
2.本发明提供的分离纯化富含酰基的羽衣甘蓝黄酮的方法操作简单，回收率高、纯度高，提高了羽衣甘蓝的经济价值，适合企业和规模化生产。
3.本发明分离纯化方法得到的富含酰基的羽衣甘蓝黄酮能够有效地缓解溃疡性结肠炎，安全且治疗效果好，能够在制备缓解结肠炎的功能性食品添加剂中应用。
附图说明
图1是可定向到达结肠的羽衣甘蓝黄酮与羽衣甘蓝总黄酮的Q-trap质谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例所使用的D101、NKA-9、HPD-400、HPD-500、AB-8、HPD-450、XDA-1大孔树脂均购于上海摩速科学器材有限公司，含有重复酰胺基团的热塑性树脂购于中国国药集团有限公司，硅胶购于美国默克公司，硅藻土购于天津三厂。
羽衣甘蓝总黄酮的纯化
实施例1
步骤1、羽衣甘蓝黄酮浸膏的制备
准确称取一定量烘干的羽衣甘蓝粉于1L烧杯中，加入料液比为1：20(g/mL)的80％的乙醇，于50℃加热搅拌提取60min，4800rpm/min离心10min取上清液，真空旋转蒸发浓缩至脂溶性成分析出，4800rpm/min离心10min去除脂溶性成分后取上清液，进一步浓缩至至浸膏状，备用；
步骤2、羽衣甘蓝总黄酮的纯化
将羽衣甘蓝黄酮浸膏用蒸馏水稀释为0.15mg/mL黄酮的水溶液，调节黄酮溶液pH为4，将10mL黄酮溶液倒入装有1g预处理的NKA-9大孔树脂的烧杯中，搅拌吸附12h；收集大孔树脂，用蒸馏水淋洗大孔树脂至无色；收集大孔树脂，以25mL 95％的乙醇水溶液作为洗脱剂，搅拌洗脱12h；收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩后冻干获得棕黄色粉末。检测计算黄酮的吸附率、解吸率和回收率。
实施例2
步骤1、羽衣甘蓝黄酮浸膏的制备
准确称取一定量烘干的羽衣甘蓝粉于1L烧杯中，加入料液比为1：20(g/mL)的80％的乙醇，于50℃加热搅拌提取60min，4800rpm/min离心10min取上清液，真空旋转蒸发浓缩至脂溶性成分析出，4800rpm/min离心10min去除脂溶性成分后取上清液，进一步浓缩至至浸膏状，备用；
步骤2、羽衣甘蓝总黄酮的纯化
将羽衣甘蓝黄酮浸膏用蒸馏水稀释为2mg/mL黄酮的水溶液，调节黄酮溶液pH为4，将10mL黄酮溶液倒入装有1g预处理的NKA-9大孔树脂的烧杯中，搅拌吸附12h；收集大孔树脂，用蒸馏水淋洗大孔树脂至无色；收集大孔树脂，以25mL 80％的乙醇水溶液作为洗脱剂，搅拌洗脱12h；收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩后冻干获得棕黄色粉末。检测计算黄酮吸附率和解吸量。
对比例1
对比例1与实施例1的不同之处在于大孔树脂的型号不同，具体见表1，其所测得的吸附和解吸性能见表1。
对比例2
对比例2与实施例1的不同之处在于稀释后的黄酮溶液pH不同，分别为2-8，其所测的吸附性能见表2。
对比例3
对比例3与实施例2的不同之处在于洗脱剂的乙醇浓度不同，分别为30％-90％，其所测的解吸性能见表3。
吸附率(％)＝(吸附前溶液中的黄酮总量－吸附后溶液中的黄酮总量)/吸附前溶液中的黄酮总量×100％；解吸率(％)＝洗脱后洗脱液中的黄酮总量/(吸附前溶液中的黄酮总量－吸附后溶液中的黄酮总量)×100％；和回收率(％)＝吸附率(％)×解吸率(％)×100％；解吸量为洗脱后洗脱液中的黄酮总量。
表1不同树脂对羽衣甘蓝总黄酮的吸附量和解吸量
表2NKA-9树脂对不同pH羽衣甘蓝黄酮溶液的吸附率
表3不同乙醇浓度对NKA-9树脂解吸量的影响
实施例1、2与对比例1-3的实验结果：
表1显示，NKA-9树脂的回收率最高，达到85.64％±4.4％，故优选NKA-9大孔树脂为纯化羽衣甘蓝黄酮的树脂。
表2显示，羽衣甘蓝黄酮水溶液的pH为3-5时，NKA-9树脂对黄酮的吸附能力较高，大多在95％以上；当pH的达到6-8时，NKA-9树脂对黄酮的吸附能力降低，由93.9±1.14％降低至79.81％±1.85％。
表3显示，乙醇浓度为30％-80％时，羽衣甘蓝黄酮的解吸量逐渐升高，从4.57mg±0.1mg升高至15.93mg±0.33mg；而当乙醇浓度达到90％时，羽衣甘蓝黄酮的解吸量降低为14.35mg±0.1mg；该结果也表明NKA-9对羽衣甘蓝黄酮的饱和吸附量可达15.93mg每克树脂。经优选的条件下羽衣甘蓝黄酮水溶液的pH为4-5，洗脱溶液乙醇浓度为80％，羽衣甘蓝总黄酮黄酮纯度高达31.16％，与纯化前羽衣甘蓝黄酮中3.8％的纯度相比，纯度提升了8.2倍。
可定向到达结肠的酰基羽衣甘蓝黄酮组分的优化
实施例3
取500mg本发明实施例2优选的方法纯化后的羽衣甘蓝总黄酮，用10mL甲醇将黄酮溶解，再加入20g硅胶，搅拌均匀，并挥干，并装于层析柱中。依次用如下洗脱剂，以流速1BV/h，对硅胶柱进行梯度洗脱：梯度①，洗脱剂为体积分数20％的甲醇水溶液，用量为3BV；梯度②，洗脱剂为体积分数40％的甲醇水溶液，用量为3BV；梯度③，洗脱剂为体积分数60％的甲醇水溶液，用量为3BV；梯度④，洗脱剂为体积分数80％的甲醇水溶液，用量为3BV。分别收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩后冻干。采用超高效液相-离子阱-串联质谱(AB SCIEX Q-Ttap4500)进行负离子检测，并以Quercetin-3-O-D-glucoside和Kaempferol-3-O-D-glucoside作为标准品进行相对定量。
实施例4
取500mg本发明实施例2优选的方法纯化后的羽衣甘蓝总黄酮，用10mL甲醇将黄酮溶解，再加入20g硅藻土，搅拌均匀，并挥干，并装于层析柱中。依次用如下洗脱剂，以流速1BV/h，对硅藻土柱进行梯度洗脱：梯度①，洗脱剂为体积分数20％的甲醇水溶液，用量为3BV；梯度②，洗脱剂为体积分数40％的甲醇水溶液，用量为3BV；梯度③，洗脱剂为体积分数60％的甲醇水溶液，用量为3BV；梯度④，洗脱剂为体积分数80％的甲醇水溶液，用量为3BV。分别收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩后冻干。采用超高效液相-离子阱-串联质谱(AB SCIEXQ-Ttap 4500)进行负离子检测，并以Quercetin-3-O-D-glucoside和Kaempferol-3-O-D-glucoside作为标准品进行相对定量。
实施例5
取500mg本发明实施例2优选的方法纯化后的羽衣甘蓝总黄酮，用10mL乙醇将黄酮溶解，再加入20g含有重复酰胺基团的热塑性树脂，搅拌均匀，并挥干，并装于层析柱中。依次用如下洗脱剂，以流速1BV/h，对含有重复酰胺基团的热塑性树脂柱进行梯度洗脱：梯度①，洗脱剂为体积分数20％的乙醇水溶液，用量为3BV；梯度②，洗脱剂为体积分数40％的乙醇水溶液，用量为3BV；梯度③，洗脱剂为体积分数60％的乙醇水溶液，用量为3BV；梯度④，洗脱剂为体积分数80％的乙醇水溶液，用量为3BV。分别收集洗脱液，真空旋转蒸发浓缩后冻干。采用超高效液相-离子阱-串联质谱(AB SCIEX Q-Ttap4500)进行负离子检测，并以Quercetin-3-O-D-glucoside和Kaempferol-3-O-D-glucoside作为标准品进行相对定量。
实施例6
黄酮定性与动物实验
1、实验动物与给药：SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重20±2g。灌胃给与实施例2中获取的羽衣甘蓝总黄酮，并收集4h后小鼠的结肠内容物。
2、检测指标：将收集到的小鼠结肠内容物，以100mg/mL的80％甲醇进行萃取，12000rpm/min离心10min，-20℃过夜保存，再经离心和过0.22μm有机滤膜后，采用超高效液相-离子阱-串联质谱(AB SCIEX Q-Ttap 4500)进行负离子检测，并以Quercetin-3-O-D-glucoside和Kaempferol-3-O-D-glucoside作为标准品进行相对定量。
表4羽衣甘蓝黄酮组分鉴定
注：表中A-E分别为为羽衣甘蓝总黄酮、可定向到达结肠的羽衣甘蓝黄酮、羽衣甘蓝总黄酮经含有重复酰胺基团的热塑性树脂再次纯化的组分、羽衣甘蓝总黄酮经硅藻土再次纯化的组分和羽衣甘蓝总黄酮经硅胶再次纯化的组分中的黄酮种类；+表示样品中可检测到的黄酮。
表5二次纯的羽衣甘蓝黄酮纯度
注：表中羽衣甘蓝总黄酮是指本发明实施例2优选的方法纯化后的羽衣甘蓝总黄酮。
实施例3-6的实验结果：
图1为可定向到达结肠的羽衣甘蓝黄酮与羽衣甘蓝总黄酮的Q-trap质谱图，通过动物实验发现羽衣甘蓝总黄酮中出峰较早(极性较大)的黄酮几乎都不能到达结肠。而能定向到达结肠的黄酮主要是出峰较晚(极性较小)的黄酮，经质谱定性发现主要是一些特殊的酰基化槲皮素或山奈酚。
表4和表5显示，从羽衣甘蓝中分离纯化的羽衣甘蓝总黄酮鉴定到41种黄酮类化合物，其中有8种能到达结肠且其中6种为酰基化的黄酮。经过再次纯化，采用含有重复酰胺基团的热塑性树脂能更特异性的从羽衣甘蓝中纯化到这类黄酮类化合物，将范围缩小到14种黄酮，其中完全包括了这8种。而硅藻土和硅胶不具备特异性，对能定向到达结肠的羽衣甘蓝黄酮筛选性较差，成分与大孔树脂纯化的羽衣甘蓝总黄酮差别不大。含有重复酰胺基团的热塑性树脂再次纯化黄酮纯度为37.02％，纯度较高，且其中定向到达结肠的黄酮组分比大孔树脂纯化的黄酮高5.02倍。而硅藻土和硅胶的黄酮纯度分别为19.00％和24.77％，且比大孔树脂纯化的黄酮更低，只有0.36和0.95倍。
实施例7
动物实验
1、实验动物：SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重20±2g
动物分组及给药：C57BL/6J雄性小鼠分为正常组、模型组、实验组(富含酰基的羽衣甘蓝总黄酮)，各组均10只。正常组和模型组全程摄入正常饲料，实验组全程摄入添加了羽衣甘蓝总黄酮的饲料。各组摄入14天的对应饲料。在第7天至14天中，模型组和实验组给与3％DSS的饮水。每日对小鼠进行称重。
2、检测指标
1)疾病活动指数(DAI)：处死小鼠前，并对小鼠的粪便形态(正常形态，0分；轻微便稀，2分；液化粪便，4分)、粪便血液(无便血，0分；轻微便血，2分；严重便血，4分)和体重下降百分比(0，0分；1％-5％，1分；5％-10％，2分；10％-15％，3分；＞15％，4分)进行评分，DAI指数为该三个指标得分总和。
2)结肠长度：解剖小鼠后，采用直尺测量小鼠结肠长度。
3)结肠炎症因子TNF-α和IL-1βmRNA水平测定：采用Trizol法提取结肠组织RNA，并采用qPCR法测定炎症因子TNF-α和IL-1βmRNA水平的倍数变化。
3、统计学方法
采用IBM SPSS Statistics 23统计软件进行单因素方差LSD的事后分析检验分析数据。结果以均数±标准差(mean±SD)表示。*p<0.05，**p<0.01，
***p<0.001表明与模型组相比具有显著性。
4、实验结果
如表6所示，溃疡性结肠炎模型组出现严重的便稀、便血和体重下降。此外，与正常组相比，模型组的结肠长度显著缩短，且结肠炎症因子IL-1β和TNF-αmRNA水平也明显增加。而实验组与模型组相比，实验组显著降低DAI指数，缓解结肠长度缩短，并显著降低结肠IL-1β和TNF-αmRNA水平。
表6各组小鼠DAI指数、结肠长度和结肠IL-1β和TNF-αmRNA水平变化
注：与模型组相比*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
本发明优选NKA-9大孔树脂对羽衣甘蓝黄酮进行纯化，羽衣甘蓝总黄酮纯度达到31.16％，回收率高达85.64％，吸附量可达15.93mg每克树脂，与纯化前羽衣甘蓝黄酮浸膏黄酮纯度3.8％相比，纯度提升8.2倍；而经含有重复酰胺基团的热塑性树脂再次纯化后富含酰基的羽衣甘蓝黄酮纯度达37.02％，是大孔树脂纯化黄酮的5.02倍，具有定向到达结肠特征和潜在的靶向药用价值；本发明提供的富含酰基的羽衣甘蓝总黄酮能够有效的缓解溃疡性结肠炎，安全且治疗效果好，能够在制备缓解结肠炎的功能性食品添加剂中应用。
以上所描述的实施例仅为本发明优选实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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