一种减轻化疗副作用的中药益生菌发酵液制剂
阅读说明：本技术 一种减轻化疗副作用的中药益生菌发酵液制剂 (Traditional Chinese medicine probiotic fermentation liquor preparation for relieving side effects of chemotherapy ) 是由 袁杰力 李明 杨永亮 王斌 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于减轻化疗副作用的中药益生菌发酵液制剂,是将长双歧杆菌、发酵乳杆菌和嗜酸乳杆菌添加到含有灵芝和莱菔子水提液的MRS肉汤培养基中增殖发酵获得,MRS肉汤培养基中灵芝浓度为16.6～66.4mg/mL,莱菔子浓度为0.5～2g/mL；添加益生菌菌量比为长双歧杆菌：发酵乳杆菌：嗜酸乳杆菌=1：1：1,使混合后每种益生菌在添加中药的MRS肉汤培养基中初始CFU/mL=1～2*10～(6),进行增殖并发酵中药至发酵液中总CFU/mL=3～5*10～(9)；这是一种能够有效减轻病人因化疗产生副作用的中药益生菌发酵液制剂。(The invention discloses a traditional Chinese medicine probiotic fermentation broth preparation for relieving side effects of chemotherapy, which is obtained by adding bifidobacterium longum, lactobacillus fermentum and lactobacillus acidophilus into an MRS broth culture medium containing water extract of lucid ganoderma and radish seed for proliferation and fermentation, wherein the concentration of the lucid ganoderma in the MRS broth culture medium is 16.6-66.4 mg/mL, and the concentration of the radish seed is 0.5-2 g/mL; the probiotic bacteria are added in a ratio of bifidobacterium longum: lactobacillus fermentum: lactobacillus acidophilus = 1:1:1, mixing each probiotic in MRS broth culture medium added with traditional Chinese medicines, wherein the initial CFU/mL = 1-2 x 10 6 Proliferating and fermenting the traditional Chinese medicine until the total CFU/mL = 3-5 x 10 in the fermentation liquor 9 (ii) a The drug can effectively relieve the side effect of chemotherapyA medicinal probiotic fermented liquid preparation.)
技术领域
本发明涉及一种利用特定益生菌对两种中药进行发酵，制得中药益生菌发酵液制剂，特别是一种用于减轻化疗副作用的中药益生菌发酵液制剂。
背景技术
化疗是目前治疗癌症的最有效的手段之一。但有些化疗药物(如环磷酰胺CTX)在杀死肿瘤细胞的同时会伤及正常细胞，尤其是生长较快的造血干细胞，肠粘膜细胞等，引起副作用。较严重的临床表现为胃肠道菌群紊乱引起的恶心呕吐，机体消瘦，免疫力低下，炎症反应等。另一方面，化疗会严重破坏患者的肠道菌群结构，降低菌群多样性及有益菌的丰度。进而加剧粘膜炎症及胃肠反应。同时，由于肠道菌群高度参与药物代谢和活性物质的转化，而菌群紊乱势必影响一些经口药物，特别是中药方剂的利用程度。现有研究表明灵芝具有增强机体免疫力，抑制细胞组胺的释放，增强各器官功能；莱菔子具有增强回肠节律收缩，加强机械性消化的作用。而该两类药食同源材料功效的发挥均离不开肠道益生菌的分解、转化、结构修饰等作用。双歧杆菌能有效保护肠粘膜屏障，抑制肠粘膜通透性增高；乳杆菌能调节机体细胞免疫，恢复肠道菌群，减轻病人腹泻。但是，这些益生菌对于药食同源材料的发酵转化作用在医疗领域，特别是在减轻化疗后副作用方面的功效尚未开发利用。
发明内容
本发明是为了解决现有临床化疗技术所存在的上述不足，提出一种能够有效缓解病人化疗产生的副作用的中药益生菌发酵液制剂。
本发明的技术解决方案是：一种用于减轻化疗副作用的中药益生菌发酵液制剂，其特征在于：是将长双歧杆菌、发酵乳杆菌和嗜酸乳杆菌添加到含有灵芝和莱菔子水提液的MRS肉汤培养基中增殖发酵获得，MRS肉汤培养基中灵芝浓度为16.6～66.4mg/mL，莱菔子浓度为0.5～2g/mL；添加益生菌菌量比为长双歧杆菌：发酵乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1：1，使混合后每种益生菌在添加中药的MRS肉汤培养基中初始CFU/mL＝1～2*106，进行增殖并发酵中药至发酵液中总CFU/mL＝3～5*109。
进一步地，本发明中长双歧杆菌，发酵乳杆菌，嗜酸乳杆菌，分别在MRS肉汤培养基中获取菌液。
进一步地，三种益生菌可以同时加入添加中药的MRS肉汤培养基中，再进行增殖发酵，最佳的方式是先将发酵乳杆菌添加到含中药的MRS肉汤培养基中，37℃培养12h后，再加入长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌，再进行增殖发酵。
本发明同现有技术相比，具有以下优点：
本种用于减轻化疗副作用的中药益生菌发酵液制剂，其所用中药均来自可食用中药，应用范围广，易获得，安全无毒副作用。其所有菌株均来自于人体，经筛选和组方验证，安全性高，临床应用有保障。它在减轻化疗所致的肠道菌群失调，肠黏膜屏障受损等方面显著效果，能改善肠内微生态失调，增强肠粘膜屏障功能，提高机体免疫力。因此这种中药益生菌发酵液制剂作为肠内营养制剂，能给化疗病人提供肠内营养，还能调节肠道菌群，使用十分广泛，作为一种辅助治疗，能大大减轻病人在化疗过程的痛苦，提高病人生活质量。
具体实施方式
下面将说明本发明的具体实施方式
所述中药益生菌发酵液制剂为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentans)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)在添加灵芝和莱菔子水提液的MRS肉汤培养基中增殖发酵，其中MRS肉汤培养基中添加的灵芝浓度为16.6～66.4mg/mL，莱菔子浓度为0.5～2g/mL；混合益生菌为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentans)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，分别在MRS肉汤培养基中取三种菌液到添加中药的MRS肉汤培养基中，添加益生菌菌量比为长双歧杆菌：发酵乳杆菌：嗜酸乳杆菌＝1：1：1，使混合后每种益生菌在添加中药的MRS肉汤培养基中初始CFU/mL＝1～2*106，然后进行增殖并发酵中药，最终发酵液中总CFU/mL＝3～5*109。
实施案例1
将从MRS肉汤培养基中取长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentans)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌液，将菌液同时添加0.5g/mL莱菔子，66.4mg/mL灵芝MRS肉汤培养基中，每种益生菌初始CFU/mL＝2*106，使益生菌增殖并发酵中药，在37℃恒温箱中增殖发酵24h，活菌计数CFU/mL＝5.0*109。
实施案例2
将在MRS肉汤培养基中取等量的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentans)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌液，将菌液同时添加2g/mL莱菔子，16.6mg/mL灵芝MRS肉汤培养基中，每种益生菌初始CFU/mL＝1.5*106使益生菌增殖并发酵中药，在37℃恒温箱中增殖发酵36h，活菌计数CFU/mL＝3.9*109。
实施案例3
将MRS肉汤培养基中取发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentans)菌液，添加1g/mL莱菔子，33.2mg/mL灵芝MRS肉汤培养基中，初始CFU/mL＝1*106，37℃培养12h后，再从MRS肉汤培养基中加入长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)菌液，长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌各自初始CFU/mL＝1*106，在37℃恒温箱中在继续增殖发酵24h，活菌计数CFU/mL＝4.2*109。
下面是针对本申请所述中药益生菌发酵液的益生菌生长情况实验和动物实验。动物实验为模型试验。
对益生菌在添加中药的培养基中生长情况研究：
将长双歧杆菌，嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌在MRS肉汤培养基中单独培养和按照菌量1:1:1添加到MRS肉汤培养基混合培养，每12h在MRS琼脂培养基上进行活菌计数，计算各菌生长情况(见表1)，发现混合菌液与单个益生菌生长速度趋于一致，第12h～36h为稳定期。按照1g/mL莱菔子，33.2mg/mL灵芝浓度配制添加中药的MRS肉汤培养基，将长双歧杆菌，嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌在添加中药的MRS肉汤培养基中单独培养和按照菌量1:1:1添加到有中药的MRS肉汤培养基混合培养，每12h在MRS琼脂平板上进行活菌计数，计算各菌生长情况(见表2)，发现长双歧杆菌，嗜酸乳杆菌进入平台期的时间为24h～36h,发酵乳杆菌进入平台期时间为36h左右，生长较长双歧杆菌，嗜酸乳杆菌稍慢，因为益生菌在添加中药的MRS肉汤培养基中生长速度较普通MRS肉汤培养基慢，说明益生菌在生长过程中对中药进行了发酵，为探究其发酵后成分对化疗后副作用的影响，通过控制单一变量，进行动物模型实验进一步研究。
对化疗动物模型的研究：
取上述莱菔子，灵芝按照1g/mL莱菔子，33.2mg/mL灵芝浓度添加到MRS肉汤培养基中，为中药(GS)组。将MRS肉汤中取等量长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentans)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌液同时添加到MRS肉汤中增殖，37℃恒温培养12h，活菌计数总活菌数为CFU/mL＝4.0*109，为益生菌(Pro)组。从MRS肉汤培养基中取发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentans)菌液，添加1g/mL莱菔子，33.2mg/mL灵芝MRS肉汤培养基中，初始CFU/mL＝1*106，37℃培养12h后，再从MRS肉汤培养基中加入长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)菌液，长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌初始CFU/mL＝1*106，在37℃恒温箱中在继续增殖发酵24h，活菌计数CFU/mL＝4.2*109，为中药益生菌发酵液(GD+Pro)组(实施例3)。选用SPF级的BALB/c小鼠随机分为五组，分别为正常组(CON)，环磷酰胺(CTX)+生理盐水组，环磷酰胺(CTX)+中药(GS)组，环磷酰胺(CTX)+益生菌(Pro)组，环磷酰胺(CTX)+中药益生菌发酵液(GS+Pro)组。1.GS组按照莱菔子10g/kg，灵芝3.32g/kg，Pro组按照CFU＝109/mL，GS+Pro组按照莱菔子10g/kg，灵芝3.32g/kg,CFU＝109/mL连续灌胃7天，进行预防干预，CON组，CTX组灌服等体积的生理盐水。
2.CTX组，GS组，Pro组，GS+Pro组按照100mg/kg腹腔注射环磷酰胺，连续3天进行注射，CON组腹腔注射等体积生理盐水。同时保持灌胃。建模结束后，每组处死3只小鼠，留取脾脏，血清，结肠内容物，结肠做进一步实验。
3.GS组，Pro组，GS+Pro组继续保持原剂量继续进行灌胃，治疗4天后处死剩余小鼠，留取脾脏，血清，结肠内容物，结肠做进一步实验。
记录建模过程中记录啃食高岭土情况(见表3)，发现建模第1天，除CON组，其他各组均增多，但GS组，Pro组，GS+Pro组啃食量均明显低于CTX组，异食癖较CTX组症状轻。
取结肠做H&E染色，进行病理评分(见表4)，发现GS组，Pro组，GS+Pro组在建模结束和治疗结束时，结肠病理评分均低于CTX组，且在建模结束时，CTX组与GS组，Pro组，GS+Pro组存在差异(P＜0.05)，治疗结束时，CTX组与Pro组存在差异(P＜0.05)。取脾脏称重，按照脾指数＝脾脏重量g/体重重量g*100％计算脾指数(见表5)，发现在治疗结束时，Pro组和GS+Pro组与CTX组相比，存在差异(P＜0.05)，尤其是GS+Pro组，与CTX组相比存在显著差异(P＜0.001)。将脾脏研磨做流式细胞术分析(见表6、表7)，发现建模结束后，CTX组，GS组，Pro组，GS+Pro组总淋巴细胞，B(CD19+)细胞显著降低，T(CD3+)细胞显著升高，以CD4+T细胞升高最明显。治疗结束后，GS组，Pro组，GS+Pro组总淋巴细胞显著恢复，GS组与CTX组存在差异(P＜0.05)，GS+Pro组与CTX组存在明显差异(P＜0.01)，GS组，Pro组，GS+Pro组T(CD3+)细胞有所下降，GS+Pro组在T细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞与CTX组相比，存在明显差异(P＜0.01)。
表1：MRS肉汤培养基中，各益生菌生长情况
表2：添加1g/mL莱菔子，33.2mg/mL灵芝MRS肉汤培养基中，各益生菌生长情况：
表3动物模型建立小鼠啃食高岭土数值
注：高岭土数值为每组每只鼠每天啃食高岭土平均值，单位为g。
表4动物模型实验结肠病理评分
注：与正常组相比，a:P＜0.05，b:P＜0.01，与模型组相比，c:P＜0.05,d：P＜0.01
表5动物模型实验脾指数
注：与正常组相比，a:P＜0.05，b:P＜0.01，c：P＜0.001与模型组相比，d:P＜0.05,e：P＜0.01,f:P＜0.001
表6建模结束时，脾脏淋巴细胞及其亚群流式细胞术检测
注：与正常组相比，a:P＜0.05，b:P＜0.01，与模型组相比，c:P＜0.05,d：P＜0.01。表中数值均为百分比(％)。
表5治疗结束时，脾脏淋巴细胞及其亚群流式细胞术检测
注：与正常组相比，a:P＜0.05，b:P＜0.01，与模型组相比，c:P＜0.05,d：P＜0.01。表中数值均为百分比(％)。
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